Long-term survival of Enterococcus faecium under different conditions of cell stabilization and immobilization

Full Text

Одна из характеристик живых систем – это периодичность их развития. У микроорганизмов развитие их популяций как вида, а на более высоком уровне – развитие микробных сообществ, также осуществляется периодически. Одной из стадий цикла развития микробных популяций в условиях, не благоприятствующих росту, является стадия их выживания, сопряженная с метаболическим покоем клеток. Особое внимание уделяется изучению покоя патогенных и симбионтных бактерий, к которым относятся молочнокислые бактерии (МКБ), чья роль в симбиозе с человеком хорошо освещена (Lyte, 2013; Oleskin et al., 2014; Oleskin, Shenderov, 2020; Олескин и соавт., 2020). Такое внимание к формам покоя бактерий обусловлено их ролью в персистенции патогенных и условно-патогенных бактерий как формах носительства и причине рецидивов инфекционных заболеваний, а также очевидным значением для сохранения жизнеспособных клеток в биотехнологиях и сферах деятельности человека, связанных с микроорганизмами. При использовании биокатализаторов акцент делается на получении препаратов не на основе покоящихся форм, а напротив, клеток, длительно обладающих высокой функциональной активностью, иммобилизованных тем или иным способом (Ефременко, 2018; Radosavljević et al., 2022). Такого рода препараты нуждаются в наличии (или постоянном поступлении) источников питания для поддержания жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных клеток (Ефременко, 2018).

Одной из перспективных основ для биопрепаратов являются формы покоя (ПФ), покоящиеся клетки цистоподобного типа (ЦПК) (Бухарин и соавт., 2005; Эль-Регистан и соавт., 2006; Мулюкин и соавт., 2009). ЦПК образуются на завершающей стадии развития периодических культур грамотрицательных бактерий (а также – и грамположительных в условиях репрессии спорообразования). Численность ЦПК, как правило, невелика (от 0.01 до1%) и соответствует численности клеток-персистеров (Balaban et al., 2004, 2019). Покоящиеся формы типа ЦПК были описаны и у молочнокислых бактерий (Голод и соавт., 2009; Лойко и соавт., 2014; Эль-Регистан и соавт., 2023).

Ранее было установлено положительное влияние гуминовых веществ на длительное выживание планктонных культур углеводородокисляющих бактерий (Nikolaev et al., 2020; Николаев и соавт., 2019, 2020) и их иммобилизованные клетки в силанольно-гуматных гелях (Николаев и соавт., 2021; Nikolaev et al., 2021). Эти подходы не были испытаны для стабилизации культур МКБ в ходе длительного хранения.

Целью настоящей работы было исследовать эффективность различных приемов длительного хранения молочнокислой бактерии Enterococcus faecium: (1) в виде планктонных культур, (2) в планктонных популяциях, иммобилизованных на поверхности гелей или в силанольно-гуматные гели, (3) в планктонных популяциях в присутствии гуматов, (4) в популяциях, выращенных в присутствии гелевых сорбентов.

Интерес к этому объекту вызван тем, что он входит в состав пробиотических продуктов, а также может быть пробиотиком кормового назначения (Azzaz et al., 2022).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В работе была использована бактерия Enterococcus faecium M3185 из коллекции UNIQEM Института микробиологии им. С.Н. Виноградского ФИЦ Биотехнологии РАН.

Условия культивирования. Бактерии культивировали в жидких и на плотных средах: MRS (“Conda Pronadisa”, Испания) и LB (лизогенный бульон Луриа-Бертани, “VWR Chemicals”, США), обезжиренном молоке (сухое молоко, “Уфа-молоко”, РФ). Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл среды на орбитальной качалке (120 об./мин), а также в пенициллиновых флаконах объемом 10 мл с 2 мл среды на орбитальном шейкере Biosan PSU-20i (“BioSan”, Латвия) (150 об./мин) при температуре 28°. Инокулятом служили стационарные культуры, выращенные в колбах, как описано выше, в течение 24 ч (до стационарной фазы).

Численность жизнеспособных клеток бактерий определяли микрометодом (Pious et al., 2015) по числу колониеобразующих единиц (КОЕ), высевая аликвоты (5 мкл) десятичных разведений бактериальных культур на плотную среду LB (1.5% агара) и подсчитывая количество выросших колоний на 1, 3, 5 и 7 сут инкубации (Нетрусов и соавт., 2005).

Определение метаболической активности. О метаболической активности (гетероферментативном молочнокислом брожении) бактерий судили по интенсивности выделения ими СО₂. Аликвоты бактериальной суспензии (400 мкл) вносили в герметически закрытый флакон объемом 40 мл с 4 мл солевого фона среды MRS (рН 5.5‒5.0) и инкубировали на орбитальном шейкере Biosan, PSU-200 (“Biosan”, Латвия) при температуре 28° в течение 24 ч. После стабилизации уровня СО₂ в газовой фазе (через 1‒2 ч после введения пробы) вносили раствор глюкозы (400 мл до концентрации 0.8%) и инкубировали 24 ч. Периодически отбирали шприцем пробы газовой фазы и определяли в них количество выделенного СО₂ хроматографически (Кристалл 5000, “Хроматэк”, РФ). По количеству выделенного СО₂ судили о метаболической активности (брожении) клеток в условиях наличия субстрата, глюкозы. Метаболическая активность клеток энтерококков была использована как косвенный показатель количества жизнеспособных клеток и глубины их покоя.

Способы пролонгирования жизнеспособности клеток E. faecium. Для стабилизации клеток энтерококков использовали четыре разных подхода: 1) к клеткам, выращенным в жидкой среде до стационарной фазы, добавляли химические стабилизаторы – гуматы (табл. 1); 2) клетки стационарной фазы иммобилизовали поверхностно на сорбентах (табл. 2); 3) клетки стационарной фазы иммобилизовали в силанольно-гуматные гели; 4) клетки выращивали в жидкой культуре в присутствии гелей (табл. 3). В последнем случае имело место микро-гетерофазное культивирование, поскольку в среде присутствовали две фазы – жидкая и твердая, но при этом реологические свойства жидкости позволяли выращивать культуру как жидкую, т.е. в колбах на качалке. Контроль выживаемости клеток осуществляли путем определения численности КОЕ/мл и метаболической активности клеток, как описано выше.

 

Таблица 1. Характеристика гуминовых веществ, использованных для стабилизации клеток E. faecium

Наименование	Характеристика, источник
Гумат Сахалинский (“Биомир 2000”, Москва, РФ)	Раствор 5% щелочной вытяжки из леонардита
Лигногумат (ООО “НПО РЭТ”, Санкт-Петербург, РФ)	Растворимый порошок, полусинтетического происхождения. Лигносульфонат
Гуматы Техноэкспорт (ТПК “Техноэкспорт”, Украина)	Растворимый порошок с содержанием не менее 70% гуминовых солей, полученных из бурого угля
Паохумус (Powhumus WSG) (“Humintech Ltd”, Германия)	Растворимый порошок гумата калия, произведенный по технологии мокрой щелочной экстракции из леонардита
Иркутские гуматы (Humate +7) (“АгроТехГУМАТ”, Иркутск, РФ)	Растворимый порошок гумата калия и натрия, получаемый из бурого угля
Фульвокислоты (Fulvital WSP 80) (“Humintech Ltd’, Германия)	Растворимый порошок; источник – подземные воды

 

Таблица 2. Характеристика гелей, использованных для стабилизации клеток E. faecium, предварительно выращенных в жидкой культуре

Наименование	Характеристика	Концентрация, г/л
Энтеросгель (ООО “ТНК Силма”, Москва, РФ)	Гелеобразная суспензия полигидрата полиметилсилоксана	70
Полисорб МП (АО “Полисорб”, Копейск, РФ)	Гелеобразная суспензия из диоксида кремния	50 или 40
Силанольно-гуматный гель (Лабораторное получение)	Гель, состоящий из гуматов Паохумус или Байкал и органо-силанольного полимера	17 или 24

 

Таблица 3. Характеристика сорбентов, использованных для стабилизации клеток E. faecium, в ходе гетерофазного культивирования

Наименование	Характеристика	Концентрация, г/л
Энтеросгель (ООО “ТНК Силма”)	Пористая глобулярная структура полиметилсилоксана полигидрата (кремнийорганическое соединение), размер частиц не более 300 мкм	4
Полисорб МП (АО “Полисорб”)	Мелкодисперсный диоксид кремния, размер частиц до 90 мкм	3.3

 

Применение химических стабилизаторов. В бактериальные культуры стационарной фазы роста, выращенные в колбах, как описано выше, и разлитые в пробирки Хангейта (объемом 20 мл по 5 мл), вносили водные растворы гуматов (табл. 1) до конечной концентрации 0.15 или 0.5 г/л. Образцы хранили в статических условиях при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, периодически отбирая пробы для определения численности жизнеспособных клеток (КОЕ/мл).

Иммобилизация выращенных клеток с использованием гелей. В работе использовали три типа гелей на основе кремниевых соединений. Для поверхностной иммобилизации использовали полиметилсилоксан (Энтеросгель) и высокодисперсный кремнезем (Полисорб), для иммобилизации в матрицу геля использовали силанольно-гуматный гель (табл. 2). Для иммобилизации на поверхность гелей клетки стационарной фазы роста смешивали со свежеприготовленным гелем (1 : 1, об./об.; концентрация гелей – см. табл. 2), разливали по пробиркам типа Фалькон (15 мл) или Эппендорф (2 мл) и оставляли до застывания геля, затем хранили в течение нескольких месяцев, периодически определяли численность жизнеспособных клеток (КОЕ/мл).

Полиметилсилоксана полигидрат представлен в виде гелеобразующей матрицы, которая имеет глобулярное строение и состоит из ансамбля глобул. Глобулы, связываясь между собой силоксановыми связями, формируют поры в виде пространства между ними, заполненные водой. Частицы препарата, как правило, образуют непрерывную сеть в суспензии. Эти частицы можно рассматривать как двумерные листы. Глобулы метилкремниевой кислоты имеют размеры до 300 мкм (Маркелов и соавт., 2008).

Высокодисперсный кремнезем – коллоидный диоксид кремния с химической формулой SiO₂. При попадании в воду присоединяет к себе гидроксильные группы и формирует сложную пространственную структуру. Частицы диоксида кремния имеют размеры до 90 мкм (Маркелов и соавт., 2008).

Иммобилизация клеток бактерий в силанольно-гуматные гели. Силанольно-гуматные гели получали при использовании двух видов гуматов Паохумус (Powhumus WSG) (“Humintech”, Германия) и Байкал (“АгроТехГумат”, РФ) и органосилана 3-аминопропилтриэтоксисилана (АПТЭС) (“АГМ-9”, ООО “Пента 91”, Россия) по разработанной ранее методике (Volikov et al., 2016) с модификацией (Nikolaev et al., 2021; Николаев и соавт., 2021). К 10 мл 10% раствора гумата при интенсивном перемешивании добавляли 250 или 350 мкл АПТЭС; полученный раствор титровали 10% раствором уксусной кислоты до значений рН 6‒7, затем вносили 5 мл культуры энтерококка стационарной фазы роста, не переставая перемешивать. Полученную смесь разливали по 1 мл в конические пробирки Эппендорф объемом 2 мл. В течение 1‒2 ч при комнатной температуре происходило желирование смеси. Гель сохранял свои свойства в течение нескольких месяцев, при добавлении воды и интенсивном перемешивании растворялся с высвобождением бактериальных клеток, что обусловливало возможность определения их жизнеспособности (КОЕ/мл), как описано выше.

Микроскопические наблюдения. Для оценки степени адгезии клеток бактерий на различных поверхностях и их авто-агрегирования применяли люминесцентную микроскопию на световом эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager D1 (“Carl Zeiss Microscopy GmbH”, Германия) с фазово-контрастным объективом, а также с использованием флуоресцентного красителя акридиновый оранжевый (“Molecular probes”, США). Использование красителя было необходимо для повышения контрастности изображений.

Электронно-микроскопические исследования. Биомассу бактерий фиксировали 1.5% раствором глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (pH 7.2) при температуре 4° в течение 1 ч, затем трижды отмывали тем же буфером и фиксировали 1% раствором оксида осмия (OsO₄) в 0.05 М какодилатном буфере. После обезвоживания в серии спиртов материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Затем готовили ультратонкие срезы на микротоме LKB-III (Швеция), срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу при 20° в течение 4‒5 мин. Готовые срезы просматривали в микроскопе JEM 1400 (“JEOL”, Япония) при ускоряющем напряжении 120 кВ.

Определение терморезистентности клеток бактерий. О количестве терморезистентных клеток бактерий судили по доле выживших клеток после прогревания аликвот (500 мкл) бактериальных суспензий при температуре 70° в течение 15 мин в пластиковых пробирках типа Эппендорф на термошейкере TS-100 (“Biosan”, Латвия) с последующим высевом на плотную питательную среду для определения численности выживших клеток (КОЕ/мл).

Исследование диссоциации бактериальных популяций. Индекс диссоциации бактериальной популяции определяли как долю (%) выросших на агаризованной среде колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Признаками, характеризующими фенотип, были цвет, консистенция и размер колоний.

Образование покоящихся форм бактерий. Покоящиеся формы (ПФ) бактерий получали при длительном хранении в статическом режиме планктонных культур. Культуры E. faecium, выращенные до стационарной фазы роста, хранили в течение 6 мес. в условиях разного доступа кислорода: (1) в колбах с ватными пробками (максимальный доступ кислорода под малым слоем жидкости); (2) в пробирках Хангейта с ватными пробками (ограниченный доступ кислорода в более высоком столбе жидкости); (3) в пробирках Хангейта с пластмассовыми крышками с резиновой прокладкой (без доступа кислорода). Об образовании ПФ судили по: сохранению ими жизнеспособности (образованию колоний на плотных средах); более высокой терморезистентности; отсутствию метаболической активности (на основе выделения СО₂); а также по особенностям их ультраструктурной организации. Эти признаки считаются необходимыми признаками форм покоя (Бухарин и соавт., 2005).

Статистическая обработка данных. Все исследования выполнены в двух биологических повторностях, по три параллельных эксперимента (технические повторности) в каждом. При расчетах определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение для р < 0.05 с использованием программы Microsoft Excel 2016. Различия между вариантами считали значимыми, если они превышали стандартное отклонение, обычно не превышающее 30%. На рисунках представлены данные типичных экспериментов, в таблицах – средние значения параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При культивировании энтерококка в молоке или жидкой среде LB в колбах объемом 250 мл с 50 мл среды в условиях аэрации на роторной качалке, стационарная фаза наступала через 24 ч, максимальный урожай составлял ⁓10⁹ КОЕ/мл. В последующих экспериментах в качестве инокулята использовали стационарные культуры E. faecium, выращенные в колбах с перемешиванием в течение 24 ч.

Кривая отмирания популяции E. faecium, выращенной на молоке, типичный вид которой представлен на рис. 1, состояла из трех участков.

 

Рис. 1. Динамика изменения численности жизнеспособных клеток E. faecium в популяции, выращенной в обезжиренном молоке, при хранении в статических условиях с доступом кислорода воздуха в течение 1 мес. Цифрами отмечены фазы отмирания: 1 – стационарная, 2 – быстрого отмирания, 3 – плато.

 

До 4 сут численность КОЕ не менялась, что соответствует стационарной фазе; в период от 4 до 14 сут скорость отмирания была максимальной, что отражает фазу отмирания обычных стационарных клеток; затем скорость отмирания уменьшалась, образуя “плато” – длительную фазу медленного отмирания, характерную для отмирания субпопуляции клеток-персистеров (Balaban et al., 2004, 2019). Доля выживающих клеток составляла 0.001‒1%, что соответствует численности клеток-персистеров, образующихся в стационарных культурах бактерий (Balaban et al., 2004) и созревающих в культурах возрастом несколько месяцев в ЦПК (Мулюкин и соавт., 2009, 2014).

Сравнение эффективности различных способов пролонгированного хранения E. faecium

Для пролонгированного сохранения жизнеспособности (КОЕ/мл) молочнокислых бактерий E. faecium были использованы способы, аналогичные факторам естественной среды обитания МКБ: (1) действие химических стабилизаторов – гуматов при их внесении в стационарные культуры E. faecium; (2) иммобилизацию клеток стационарной культуры на поверхность частиц геля; (3) иммобилизацию клеток стационарной культуры в гели различного состава; (4) иммобилизацию клеток на носителях, внесенных вместе с инокулятом и последующим глубинным гетерофазным культивированием.

Полученные препараты хранили в “провокационных условиях”, т.е. при комнатной температуре и доступе кислорода в статическом режиме в течение 6 мес., периодически определяя титр жизнеспособных клеток (КОЕ/мл).

Влияние гуминовых веществ на выживаемость клеток E. faecium. Гуминовые вещества содержат остатки фенольных соединений, в том числе и алкилрезорцинов, которые обладают активностью факторов межклеточной коммуникации микроорганизмов и проявляют антистрессовую и антиоксидантную активность (Kozubek et al., 2001; Николаев и соавт., 2006; Эль-Регистан и соавт., 2006; Sampietro et al., 2013). Внесение ГВ в культуры углеводородокисляющих бактерий (УОБ) стационарной фазы роста способствовало кратному увеличению числа выживающих клеток при их длительном хранении до 4 мес. (Nikolaev et al., 2019). Основываясь на этих результатах, было исследовано выживание клеток энтерококка в присутствии 6 видов гуминовых веществ, различных по составу и происхождению (табл. 1), при их внесении в концентрациях 0.15 и 0.5 г/л в стационарные культуры энтерококка с последующим хранением в течение 1 мес.

Существенное, более чем на 50%, увеличение численности КОЕ наблюдали в присутствии 0.15 г/л Паохумуса и Фульвокислот (рис. 2). Другие гуматы оказывали на титр КОЕ минимальный или отрицательный эффект (рис. 2). Увеличение концентрации ГВ до 0.5 г/л снижало защитный эффект Паохумуса и Фульвокислот и не изменяло эффекта для других ГВ (данные не приводятся).

 

Рис. 2. Доля (% от контроля) выживших клеток E. faecium, хранившихся в течение 1 мес. в контрольном (без добавления ГВ) и опытных вариантах с внесением ГВ в концентрации 0.5 г/л (столбец отмечен цифрой 1) и 0.15 г/л (столбец отмечен цифрой 2).

 

Таким образом, протекторный эффект ГВ относительно МКБ зависит как от вида гумата, так и от концентрации, аналогично тому, как это было описано для углеводородокисляющих бактерий (УОБ) (Николаев и соавт., 2019, 2020; Nikolaev et al., 2020). При этом защитное влияние гуматов на выживание энтерококка существенно ниже, чем на выживание углеводородокисляющих бактерий, где количество выживших клеток повышалось до 10 раз. Относительно УОБ максимальное защитное действие также оказывал гумат Паохумус.

На выживаемость клеток большее влияние оказывали не концентрации вносимых гуматов, 0.15 или 0.5 г/л, а условия хранения образцов – с или без доступа кислорода воздуха (рис. 3).

 

Рис. 3. Доля (% от контроля) выживших клеток E. faecium, хранившихся в течение 1 мес. в контрольном (без добавления ГВ) и опытных вариантах с внесением ГВ в концентрации 0.15 г/л и при хранении с ограничением доступа (столбец отмечен цифрой 1) и без ограничения доступа кислорода воздуха (столбец отмечен цифрой 2).

 

При внесении гуматов Паохумус и Фульвокислоты в концентрации 0.15 г/л и хранении образцов без доступа кислорода воздуха, было отмечено превышение контрольных значений на 26 и 68% соответственно. При хранении с доступом кислорода воздуха доля выживших клеток в этих вариантах возрастала до 290 и 206% от контроля соответственно.

Причина максимального стрессопротекторного действия со стороны гуматов, а именно Паохумус и Фульвокислоты, очевидно, связана с особенностями их химического состава. Так, эти ГВ характеризовались максимальным содержанием углерода алкильных звеньев (остатков алканов) и минимальным содержанием ароматического углерода, замещенного гетероатомами (гетероциклических соединений) (Nikolaev et al., 2020).

Все препараты с ГВ характеризовались снижением метаболической активности клеток относительно контроля (рис. 3), что свойственно формам выживания бактерий, сохраняющим лишь минимальный уровень метаболизма (Бухарин и соавт., 2005; Fleischmann et al., 2021; Wainwright et al., 2021).

Однако, если бы все клетки были аналогичны аметаболическим цистоподобным покоящимся клеткам, можно было ожидать полного отсутствия метаболической активности. Поскольку этого не наблюдали, можно заключить, что не все клетки перешли в состояние полного метаболического покоя, а находятся в состоянии гипометаболизма.

Таким образом, на выживание клеток энтерококка при их хранении в течение 1 мес. положительно влияли: внесение в стационарные культуры препаратов гуматов Паохумус и Фульвокислоты, а также хранение культур с доступом кислорода воздуха.

Положительное влияние кислорода на МКБ, обладающие бродильным метаболизмом, т.е. не нуждающехся в кислороде, связано с тем, что МКБ способны к аэробному дыханию в присутствии гемов в окружающей среде, что повышает их метаболическую активность (Condon, 1987; Maresca et al., 2018; Брюханов и соавт., 2022). Авторы работы Gaudu et al. (2002) предсказали, что выживание лактококков в присутствии экзогенных гемов должно быть выше в аэробных условиях, что мы и наблюдали в нашей работе.

Выживание клеток E. faecium при их иммобилизации на/в органические и неорганические гели. Еще один вариант существования микроорганизмов в природе – их развитие на поверхности или в органических и неорганических гелях. Бактериальные клетки, в адсорбированном на твердых носителях состоянии и иммобилизованные в гели, при постоянном поступлении источников питания длительно сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность (Ефременко и соавт., 2018). О выживании иммобилизованных в гелях бактерий в отсутствие источников питания информации нет, хотя такие ситуации в природе естественны.

Иммобилизация на поверхность гелей из органосилана и кремнезема. В наших экспериментах культуру E. faecium, выращенную в молоке до стационарной фазы роста, смешивали с гелями разной природы – из органосилана (Энтеросгель) и кремнезема (Полисорб) в соотношении 1 : 1, как описано выше (Материалы и методы исследования) и затем хранили в течение 1 мес.

Суспензии гелей состояли из частиц размером 30‒300 мкм, что определено с использованием люминесцентного микроскопа (рис. 4).

 

Рис. 4. Клетки E. faecium, сорбированные на поверхностях гелевых частиц или в геле: а – препарат Энтеросгель; б – препарат Полисорб; в – СГГ на основе гумата Паохумус. 1 – Частицы полиметилсилоксана полигидрата; 2 – частицы мелкодисперсного кремнезема (Полисорб); 3 – сорбированные клетки E. faecium. Люминесцентная микроскопия.

 

Люминесцентная микроскопия образцов показала, что клетки бактерий располагались на поверхностях гелевых частиц (рис. 4). За время хранения в контроле (планктонная культура) численность выживших клеток снизилась до 2.5 × 10⁷ КОЕ/мл, что составило 0.8% от исходной численности жизнеспособных клеток стационарной культуры (3 × 10⁹ КОЕ/мл). В опытных вариантах – при хранении в гелях, титр КОЕ был достоверно выше: в вариантах с Полисорбом (50 г/л) – 1 × 10⁸ КОЕ/мл, в варианте с Энтеросгелем – 6 × 10⁷ КОЕ/мл (рис. 5), т.е. в 3 и 1.25 раза выше, чем в контроле, соответственно.

 

Рис. 5. Доля (% от контроля) выживших клеток популяции E. faecium, выращенных в молоке, при хранении в течение месяца в контрольном (без добавления стабилизаторов) и опытных вариантах с внесением стабилизаторов.

 

Иммобилизация в силанольно-гуматные гели. АПТЭС является основным гелеобразователем в силанольно-гуматных гелях; чем выше его концентрация, тем тверже гель (Volikov et al., 2016). При исходной концентрации 25 мкл/мл (что соответствует 1.7% в окончательном препарате геля) гель имел полужидкую сметанообразную консистенцию, при 35 мкл/мл (2.3% в окончательном препарате) гель имел консистенцию мягкой силиконовой резины. В обоих случаях клетки располагались в толще геля достаточно равномерно, макроскопических неравномерностей в геле не наблюдали (рис. 4).

Через 1 мес. хранения численность выживших клеток в контроле (планктонная культура) снизилась до 2 × 10⁶ КОЕ/мл (что составляет 0.87% от исходного титра 2.3 × 10⁸ КОЕ/мл), тогда как в опытных вариантах она была в 2‒7 раз выше для гелей на основе гумата Байкал и в 10‒35 раз выше для гелей на основе Паохумуса (рис. 6). Таким образом, гель на основе Паохумуса был более эффективен, чем на основе гумата Байкал. При этом плотность гелей сказывалась по-разному на выживании бактерий: Паохумус более эффективен в мягком состоянии, Байкал – в более плотном.

 

Рис. 6. Доля (% от контроля) выживших клеток E. faecium, выращенных в молоке, при хранении в течение 1 мес. в контрольном (планктонная культура) и опытных вариантах в СГГ.

 

Уровень метаболической активности клеток на эндогенном (остаточном) субстрате в стабилизированных культурах был в 20 раз выше, чем в контрольном варианте (табл. 4), что указывает на наличие более высокого метаболизма.

 

Таблица 4. Уровни метаболической активности клеток (брожения) на эндогенном субстрате после 1 мес. хранения, ‰ СО₂/ч

Стационарная культура	Контроль (стационарная культура, 1 мес.)	Байкал, 1.7% АПТЭС	Байкал, 2.3% АПТЭС	Паохумус, 1.7% АПТЭС	Паохумус, 2.3% АПТЭС
0.24 ± 0.005	0.005 ± 0.005	0.12 ± 0.005	0.14 ± 0.005	0.1 ± 0.005	0.1 ± 0.005

 

При этом в образцах с ГВ Байкал активность была выше, чем в образцах с ГВ Паохумус (0.13 и 0.1‰ СО₂/ч соответственно) (табл. 4), что объясняется более глубоким метаболическим покоем клеток, хранящихся в СГГ с ГВ Паохумус. Эффект более медленной реактивации глубоко покоящихся клеток неоднократно отмечался ранее, в том числе в нашей предыдущей статье при анализе прорастании ПФ другой МКБ ‒ E. durans (Николаев и соавт., 2022).

Выживание клеток E. faecium после гетерофазного выращивания с гелевыми сорбентами. Наиболее распространенным в природе способом существования микроорганизмов является их развитие в виде биопленок. Эта способность свойственна всем микроорганизмам, в том числе молочнокислым бактериям (Mgomi et al., 2023). В наших экспериментах проверяли степень выживания клеток E. faecium, выросших при их гетерофазном глубинном культивировании в молоке в режиме принудительного перемешивания в присутствии различных сорбентов (табл. 2) до стационарной фазы роста и затем хранящихся в течение 1 мес. в статических условиях с и без доступа воздуха.

Природа сорбентов не оказывала влияния на максимальную численность выросших стационарных культур; во всех вариантах опытов она составила ~10⁹ КОЕ/мл. Динамика отмирания популяций также была схожа. Однако в вариантах с внесением Энтеросгеля через 1 мес. хранения выживало больше клеток, чем в вариантах роста с Полисорбом и в контроле. При этом в условиях ограничения доступа кислорода воздуха выживало 125% от контроля, а в условиях доступа воздуха ~ 400% (5 × 10⁷ КОЕ/мл) от контроля (1.15 × 10⁷ КОЕ/мл) (рис. 7).

 

Рис. 7. Доля (% от контроля) выживших клеток популяции E. faecium, выросшей при гетерофазном культивировании с внесением сорбентов и последующем хранении в течение 1 мес. в разных условиях доступа кислорода: с ограничением доступа кислорода (столбцы со сплошной заливкой) и с доступом кислорода (столбцы со штриховкой).

 

Таким образом, как и в вариантах длительной инкубации планктонных культур с внесением гуматов, доступность кислорода воздуха при хранении адсорбированных популяций E. faecium играет положительную роль в сохранении жизнеспособности клеток энтерококка.

Отметим, что гетерофазное культивирование известно в биотехнологии как способ получения микробной биомассы в качестве целевого продукта. При этом численность микробных клеток на единицу объема не увеличивается, что было также подтверждено в настоящем исследовании, где этот показатель составлял в стационарной фазе культур E faecium в присутствии разных сорбентов около 10⁹ кл./мл. Однако выживаемость клеток через 1 мес. хранения популяций, выросших в присутствии сорбентов, была выше, чем в контроле до 4 раз и зависела от природы сорбента и условий хранения. Выращивание МКБ на сорбентах может быть перспективно для получения более стабильных препаратов.

Таким образом, испытанные способы повышения жизнеспособности клеток молочнокислой бактерии E. faecium при длительном хранении показали разную эффективность (табл. 5). Умеренное кратное возрастание титра КОЕ наблюдали при использовании гуматов и гелей на основе кремния. В последнем случае не было существенной разницы между внесением гелей в культуру клеток или выращиванием клеток в их присутствии. Наилучший эффект был при иммобилизации клеток стационарной фазы в СГГ (в 35 раз выше, чем в контроле).

 

Таблица 5. Повышение количества жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий E. faecium, выращенных на молоке, после 1 мес. хранения, при использовании разных подходов, относительно контроля, крат

Гуматы	Сорбенты, гели	Иммобилизация в СГГ	Гетерофазное выращивание с гелями
2‒3	1.25‒3	35	1.25‒4

 

Таким образом, как и в случае углеводородокисляющих бактерий (Nikolaev et al., 2021; Николаев и соавт., 2021), наилучший результат получен путем иммобилизации клеток в гели, а не на поверхность сорбентов. Были исследованы причины длительного выживания клеток E. faecium в жидких культурах.

Образование длительно выживающих покоящихся форм E. faecium при пролонгированном хранении их планктонных культур

Известно, что МКБ образуют ПФ разных типов при длительном хранении их культур (Голод и соавт., 2009; Лойко и соавт., 2014) – толстостенные и тонкостенные ЦПК и L-формы. Для объекта настоящего исследования, E. faecium, образование ПФ ранее не было показано.

При длительном хранении при комнатной температуре в стационарном режиме (до 6 мес.) планктонных культур E. faecium, выросших в обезжиренном молоке и среде LB до стационарной фазы роста, обнаружены признаки, необходимые и достаточные для заключения о наличии покоящихся форм (Chambliss, Vary, 1978; Эль-Регистан и соавт., 2006) (табл. 6). В таких культурах, полученных в естественном цикле развития культуры, сохранялся высокий титр жизнеспособных клеток в неростовых условиях (голодание) – доли и единицы %; клетки обладали стрессоустойчивостью (терморезистентностью) и характерными свойствами ультраструктурной организации (рис. 8); отсутствием экспериментально определяемого метаболизма (фиксируемого по отсутствию выделения СО₂).

 

Таблица 6. Количество и характеристики покоящихся форм E. faecium, выращенных на молоке или среде LB и хранившихся 6 мес. в различных условиях

Вариант	Показатели
	КОЕ, % (от 100% КОЕ в стационарной фазе)	Терморезистентность, % (от 100% КОЕ до прогрева)	Выделение СО2, %/ч
Среда LB
Стационарная фаза, 1 сут	100	0.04	0.025 ± 0.005
Колба	2‒3	1.33	0.0006 ± 0.005
Пробирка Хангейта с доступом О2	13	1.71	0.0023 ± 0.005
Пробирка Хангейта без О2	2‒5	2.2	0.0007 ± 0.005
Молоко
Колба	3.6	1.0	0.0003 ± 0.005
Пробирка Хангейта с О2	3.4	0.8	0.0025 ± 0.005
Пробирка Хангейта без О2	3.28	1.2	0.0013 ± 0.005
Молоко, разбавленное в 10 раз
Колба хранение	0.13	0.75	0.0008 ± 0.005
Пробирка Хангейта с О2	0.2	1.0	0.0008 ± 0.005
Пробирка Хангейта без О2	0.32	0.8	0.0009 ± 0.005

 

Рис. 8. Электронно-микроскопические снимки тонких срезов клеток E. faecium, выращенных на молоке до стационарной фазы роста (а, б) и хранившихся 6 мес. в статическом режиме (в‒ж). Обозначения: ВК – ультраструктура вегетативных клеток (а, б); ЦПК I типа с утолщенной клеточной стенкой (КС); ЦПК II типа с толстой многослойной КС и плотной цитоплазмой, компактизованным нуклеоидом (КН); L-ф – L-форма клеток без КС (в); ЦПМ – цитоплазматическая мембрана (б , г, ж).

 

Количество сохранивших жизнеспособность клеток. Было показано, что количество сохранивших жизнеспособность клеток зависело от среды роста бактерий (табл. 6). Титр выживших клеток был выше в культурах, выращенных в среде LB (до 13%), чем в молоке (не более 3.6%), в неразбавленном молоке было минимальное количество ПФ (не более 0.3%), что коррелирует с содержанием доступных питательных веществ, сахаров и аминокислот, в этих субстратах. Во всех длительно хранившихся культурах интенсивность выделения СО₂ была до 80 раз ниже, чем в контрольной культуре. Если бы все выжившие клетки E. faecium были представлены аметаболическими ЦПК, то выделения СО₂ не наблюдали бы. Следовательно, какая-то часть выживающих клеток метаболически активна, что подтверждено электронно-микроскопическими исследованиями – по наличию ультраструктурных особенностей, свойственных активным клеткам. Зависимость количества выживающих клеток от количества питательных веществ свидетельствует о нахождении выживающих клеток (или их части) в метаболически активном состоянии.

Количество образовавшихся форм покоя не зависело от условий хранения бактериальных культур – с или без доступа кислорода.

Доля терморезистентных клеток в хранящихся суспензиях была на порядок выше, чем в культуре вегетативных клеток (1‒2 и 0.04% соответственно; табл. 6). Высокая терморезистентность свидетельствует о наличии покоящихся форм типа ЦПК. Ультраструктурная организация длительно выживающих клеток E. faecium, выросших в молоке или на среде LB и хранившихся в неростовых условиях в течение 6 мес., отличалась от ультраструктурной организации вегетативных клеток и имела ярко выраженный полиморфизм. При этом полиморфизм выживающих клеток не зависел от среды роста хранившихся популяций ‒ молоко или LB. По этой причине на рис. 8 приведены фото клеток, выращенных на молоке (рис. 8а, 8б) и хранившихся 6 мес. (рис. 8в‒8ж) (для клеток, выращенных на среде LB, данные аналогичны и не представлены).

Стационарная культура состояла из однотипных клеток размером 1‒1.5 мкм, электронно-плотных, часть из которых не завершила деление, окруженных тонкой экзополисахаридной капсулой; зона нуклеоида визуализируется слабо. В 6-мес. популяциях преобладали лизированные клетки (“чехлы”) (рис. 8в), среди оставшихся интактными клеток были клетки типа ЦПК двух типов (рис. 8д, 8е), клетки, аналогичные клеткам стационарной фазы (рис. 8г), а также L-формы (рис. 8ж). Численность лизированных клеток составляла 70‒90%, численность покоящих форм типа ЦПК – около 15% и L-форм – 1‒3%.

Выживающие формы типа ЦПК были представлены клетками двух типов, различающихся структурой клеточной стенки: I тип – утолщенной в 1.5 раза относительно стенки вегетативных клеток (60‒70 нм) (рис. 8г, 8д) или II тип – существенно более толстой (140 нм) и многослойной (рис. 8 е), с более плотной цитоплазмой. Аналогичные покоящиеся формы типа ЦПК были описаны ранее (Мулюкин и соавт., 2009; Соляникова и соавт., 2017). У родственного микроорганизма, E. durans, были обнаружены только ЦПК I типа и L-формы (Эль-Регистан и соавт., 2023).

Таким образом, по сумме признаков длительно выживающие в неростовых условиях клетки E. faecium могут быть отнесены к покоящимся формам микроорганизмов. Длительное выживание L-форм молочнокислых бактерий показано впервые в нашей предыдущей публикации (Эль-Регистан и соавт., 2023).

Диссоциативная фенотипическая изменчивость E. faecium

Важным признаком ЦПК, отличающим их от других типов ПФ (эндо- и экзоспор, акинет и др.), является изменение (расширение) диссоциативного спектра популяций, вырастающих из ЦПК в новом цикле развития, что было многократно отмечено ранее (Ivshina et al., 2015; Соляникова и соавт., 2017). Эта особенность ЦПК E. faecium была проверена, результаты представлены на рис. 9.

 

Рис. 9. Колонии диссоциантов E. faecium в популяции, полученной из клеток, выращенных в обезжиренном молоке в течение 24 ч (а) и хранившихся в течение 6 месяцев (б). 1 – Колонии доминантного S-морфотипа с размерами до 2 мм; 2 – колонии Sb-морфотипа с размерами 2‒3 мм; 3 – колонии S_m-морфотипа с размерами менее 1 мм, полупрозрачные. Световая микроскопия.

 

При рассеве на плотные среды аликвот планктонных культур E. faecium, выросших в молоке до стационарной фазы, они вырастали популяцией клеток доминантного S-типа (98%) (рис. 9а). На агаризованной среде их колонии имели круглую форму; диаметр 1.5‒2 мм, поверхность гладкая, края ровные, цвет белесо-серый, края непрозрачные с выпуклой сердцевиной. При рассеве на агаризованной среде популяции, хранившейся в течение 6 мес., ее диссоциативный спектр резко менялся (рис. 9б): колонии S-морфотипа составляли не более 15%. 60‒70% выросшей популяции было представлено колониями Sm-типа, характеризующихся диаметром 0.3‒0.5 мм, с гладкой поверхностью, ровными краями, плотной консистенции, полупрозрачными, с выпуклым профилем, блестящими, серого цвета (рис. 9б). Около 25% колоний были представлены самыми крупными колониями Sb-типа (похожих на колонии S-типа, но диаметром 2‒3 мм). Очевидно, что максимальной скоростью роста характеризовался морфотип Sb-типа, а минимальной ‒ Sm-типа.

Таким образом, естественными способами длительного выживания МКБ в разных условиях являются:

• образование покоящихся цистоподобных клеток, что доказано приведенными выше результатами исследований;
• нахождение в состоянии биопленок, что пока не является строго доказанным и составит предмет наших дальнейших исследований, но хорошо согласуется с мнением других авторов (Zur et al., 2016);
• нахождение в состоянии гипометаболизма, отличном от состояния покоя и от состояния активного метаболизма растущих клеток. Это состояние мало исследовано и также составит предмет нашего изучения.

Кроме того, экзогенное добавление веществ с антиоксидантным действие (гуматов) или дающих бактериям возможность окислительного метаболизма и, одновременно, актиоксидантной защиты (гема), также существенно (в разы) повышает выживаемость МКБ при хранении.

Наибольший практический интерес представляет обнаруженный способ хранения МКБ при их иммобилизации в силанольно-гуматные гели, дающий максимальный эффект.

Изучению свойств и морфотипов клеток МКБ, длительно выживающих в силанольно-гуминовых гелях, будут посвящены наши следующие исследования.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 24-24-20062 и, частично, госзадания Минобрнауки РФ для ФИЦ Биотехнологии РАН (зарплата Т.А. Канапацкого и Г.И. Эль-Регистан).

БЛАГОДАРНОСТИ

Электронно-микроскопические исследования выполнены на оборудовании Центра коллективного пользования ФИЦ Биотехнологии РАН “Коллекция уникальных и экстремофильных микроорганизмов различных физиологических групп биотехнологического назначения UNIQEM”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

O. A. Galuza

Federal Research Center of Biotechnology RAS; Bavar+ JSC

Author for correspondence.
Email: olesya_galuza@mail.ru

Institute of Microbiology named after. S.N. Vinogradsky

Russian Federation, 119071, Moscow; 127206, Moscow

G. I. El-Registan

Federal Research Center of Biotechnology RAS

Email: olesya_galuza@mail.ru

Institute of Microbiology named after. S.N. Vinogradsky

Russian Federation, 119071, Moscow

T. A. Kanapatski

Federal Research Center of Biotechnology RAS

Email: olesya_galuza@mail.ru

Institute of Microbiology named after. S.N. Vinogradsky

Russian Federation, 119071, Moscow

Yu. A. Nikolaev

Federal Research Center of Biotechnology RAS

Email: olesya_galuza@mail.ru

Institute of Microbiology named after. S.N. Vinogradsky

Russian Federation, 119071, Moscow

References

Supplementary files