Email this article Alkane monoxygenase AlkB1 of Rhodococcus qingshengii strain X5 does not required for growth on alkanes
- Authors: Petrikov K.V.1, Rejepova A.A.1, Pozdnyakova-Filatova I.Y.1
-
Affiliations:
- Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
- Issue: Vol 93, No 5 (2024)
- Pages: 651-656
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/273138
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624050132
- ID: 273138
Cite item
Full Text
Abstract
The study of monooxygenase systems responsible for the primary oxidation of alkanes is necessary to understand the bacterial metabolism of these hydrocarbons. Genome analysis of the Rhodococcus qingshengii strain X5 showed a wide variety of genes encoding the corresponding enzymes, including 5 homologs of AlkB-type alkane monooxygenases. A strain with knockout of the alkB1 gene was constructed. A comparison of the ability of the wild-type strain and the mutant strain to grow on alkanes of various lengths at two temperatures (6°C and 28°C) reveals the preservation of the basic phenotype: although the growth of the mutant at low temperatures was weakened, the spectrum of oxidizable substrates did not change. This suggests that other functioning monooxygenase active at different temperatures towards a wide range of alkanes.
Full Text
Микроорганизмы, способные к использованию углеводородов в качестве единственного ростового субстрата, достаточно широко распространены в природе (Long et al., 2017; Tomasino et al., 2021). Бактериальная деградация углеводородов не только вносит существенный вклад в естественный цикл углерода, но и находит практическое применение в технологиях биоремедиации, используемых при ликвидации последствий антропогенного загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами (Ławniczak et al., 2020). Типичным классом нефтяных углеводородов являются алканы, поступление которых в окружающую среду обусловлено не только добычей и переработкой полезных ископаемых, но и разнообразными естественными источниками (Wiesenberg et al., 2009; Schulz et al., 2012).
Ключевыми ферментами бактериального метаболизма алканов являются алкан монооксигеназы, катализирующие реакцию гидроксилирования субстрата (Moreno, Rojo, 2017). Известно несколько типов этих ферментов, среди которых к наиболее распространенным у углеводородокисляющих микроорганизмов относят негемовые мембранные алкан монооксигеназы AlkB-типа, относящиеся к суперсемейству десатураз жирных кислот (Pérez-de-Mora et al., 2011; Smith et al., 2013).
Организация соответствующих генов и путь метаболизма н-алканов в аэробных условиях были достаточно подробно описаны на примере OCT-плазмиды штамма Pseudomonas putida TF4-1L (GPo1) (van Beilen, Funhoff, 2007). Однако следует отметить, что к настоящему времени значительную долю исследований составляют работы практического характера. Многочисленные алкан-окисляющие системы других микроорганизмов, равно как и важные аспекты их функционирования, например, при адаптации к экстремальным условиям окружающей среды, изучены лишь поверхностно. Понимание особенностей метаболизма алканов важно как с точки зрения получения фундаментальных знаний, так и для расширения возможностей биотехнологического использования бактерий-нефтедеструкторов (Müller et al., 2016; Tsai et al., 2017).
К хорошо известным углеводородокисляющим микроорганизмам относятся представители рода Rhodococcus (Kim et al., 2018). Одной из особенностей бактерий этого рода является наличие в геноме до 5 копий гомологичных генов, кодирующих алкан монооксигеназы AlkB-типа (van Beilen et al., 2002). Роль такого разнообразия, особенности функционирования конкретных генетических и ферментных систем остаются до конца не выясненными.
Целью настоящей работы было определение роли гена alkB1 в метаболизме алканов у штамма Rhodococcus qingshengii X5 при умеренной и низкой положительной температурах.
Штамм Rhodococcus qingshengii (erythropolis) X5 (BKM Ac-2532Д) получен из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Полные аннотированные геномные последовательности R. qingshengii X5, включающие кольцевую хромосому и линейную плазмиды, депонированы в GenBank (номера CP044284 и CP044283 соответственно) (Delegan et al., 2019).
Для выращивания культур использовали лизогенный бульон (среда LB) (Sambrook, Russell, 2001), плотную среду получали добавлением 2% вес. агара. При необходимости вносили добавки, как указано далее.
Оценку способности изучаемых штаммов к росту на различных алканах выполняли визуально. Культивирование проводили на модифицированной минеральной среде Эванса (среда E) (Petrikov et al., 2013) в течение 4 сут при 27°C и 25 сут при 6°C. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли алканы в количестве 2% об. для жидких (н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-гексадекан, пристан, изоцетан) и 0.5% вес. для твердых (н-эйкозан, н-докозан, смесь парафинов C46‒C48); выращивание с н-октаном проводили в парáх, внося субстрат в специальный отросток.
Выравнивание последовательностей и построение филогенетического дерева выполняли в программе MEGA X (Kumar et al., 2018).
Штамм R. qingshengii X5, дефектный по гену alkB1 (координаты гена в GenBank CP044284: 844 049..845 224), конструировали путем замены этого гена на мутантный аллель при помощи гомологичной рекомбинации. Два фрагмента, фланкирующих целевой ген, амплифицировали, используя две пары праймеров: alkB1_up_F (5'-CGGCCGCTCTAGAACTAGTGTTGCCATATCGGGAGGACG-3') и alkB1_up_R (5'-CATCGAATTCTCCAGTTCTCGTTC-3') для upstream-участка, alkB1_down_F (5'-GAACGAGAACTGGAGAATTCGATGGCCTACGGGGTGAACGCATG-3') и alkB1_down_R (5'-CGAATTCCTGCAGCCCGGGGGTAGTTCCTTCGACAGCGCC-3') для downstream-участка. Полученные фрагменты клонировали в плазмидном векторе pJQ200KS по методу T5 exonuclease DNA assembly (Xia et al., 2019). Скрещивание штамма-донора E. coli S17-1(pJQ200KSΔalkB1) и штамма-реципиента R. qingshengii X5 проводили на плотной среде LB с добавлением гентамицина (80 мкг/мл) и налидиксовой кислоты (10 мкг/мл). Для обнаружения меродиплоидов устойчивые клоны тестировали методом ПЦР. Отбор продуктов двойного кроссинговера проводили на среде LB с добавлением сахарозы (20% вес.). У клонов, устойчивых к сахарозе и чувствительных к гентамицину, наличие делеции гена alkB1 проверяли с помощью ПЦР с парой специфичных праймеров, расположенных upstream и downstream от целевой мутации: alkB1_seq_F (5'-ACGACCAAAGGGCCGTATTT-3') и alkB1_seq_R (5'-TCGATACCCTGCTCGGTCC-3') при следующих условиях: 98°C ‒ 3 мин, далее 30 циклов: 98°C ‒ 10 с, 60°C ‒ 20 с, 72C° ‒ 1 мин 30 с, финальная достройка: 72°C ‒ 2 мин. Корректность мутации подтверждали с помощью секвенирования по Сэнгеру с праймерами alkB1_seq_F и alkB1_seq_R.
В нашей работе была получена характеристика способности к росту штамма R. qingshengii X5 на различных алканах при двух температурах (таблица). Интенсивный рост был отмечен для обеих температур на всем спектре проверенных линейных алканов.
Таблица. Характеристика способности штамма дикого типа R. qingshengii X5 и мутантного штамма R. qingshengii X5(ΔalkB1), содержащего делецию гена alkB1, к росту на алканах при двух температурах
Субстрат | R. qingshengii X5 | R. qingshengii X5(ΔalkB1) | ||
6°C | 28°C | 6°C | 28°C | |
н-Октан | Н.п. | + | Н.п. | + |
н-Декан | + | ++ | + | ++ |
н-Ундекан | ++ | ++ | + | ++ |
н-Додекан | ++ | ++ | ++ | ++ |
н-Гексадекан | ++ | ++ | + | ++ |
н-Эйкозан | ++ | ++ | + | ++ |
н-Докозан | ++ | ++ | + | ++ |
Смесь C46-C48 | + | ++ | + | ++ |
Пристан | 0 | ++ | 0 | ++ |
Изоцетан | 0 | 0 | 0 | 0 |
Примечание. ++ ‒ Интенсивный рост; + ‒ умеренный рост; 0 ‒ отсутствие роста; н.п. ‒ не проверялась.
Кроме н-алканов в качестве субстратов были использованы и два разветвленных алкана: пристан, у которого субтерминальный атом углерода является третичным, и изоцетан, с четвертичным субтерминальным атомом углерода. Известно, что разветвленные алканы значительно хуже подвергаются биодеградации, чем линейные, и деструкторы таких соединений встречаются гораздо реже (Rojo, 2009).
В нашей работе рост на пристане у штамма R. qingshengii X5 наблюдался только при 28°C, а потреблять изоцетан штамм оказался неспособен. Ранее было описано несколько представителей родококков, растущих на пристане: R. erythropolis E1 (Sokolovska et al., 2003), Rhodococcus sp. TMP2 (Kunihiro et al., 2005), Rhodococcus sp. 094 (также не мог потреблять изоцетан) (Bredholt, Eimhjellen, 1999), но о зависимости этой способности от температуры не сообщалось.
Полученные результаты говорят о наличии у штамма R. qingshengii X5 алкан-деградирующих систем с широкой субстратной специфичностью, сохраняющих активность и при низких положительных температурах.
В соответствии с представленной в базе данных GenBank аннотацией, в геноме штамма R. qingshengii Х5 содержатся 5 генов алкан монооксигеназ AlkB-типа, все имеют хромосомную локализацию. Впервые такое разнообразие генов alkB у родококков было показано в работе van Beilen et al. (2002). Затем этой же группой было предложено разделить обнаруженные гены на 4 группы, отличающиеся не только соответствующей кластеризацией нуклеотидных последовательностей, но и локализацией в характерных регионах генома, сохраняющих консервативность окружения (Whyte et al., 2002). Так, гены подтипа alkB1 располагались в кластере, включающем в себя гены других необходимых участников реакции гидроксилирования алканов: рубредоксина (две копии, rubA1 и rubA2) и рубредоксин редуктазы (rubB), также в кластер входит ген регуляторного белка AlkU, относящегося к семейству TetR. Ген alkB2 отличался отсутствием в кластере гена rubB, к консервативному окружению гена alkB3 относился ген сортазы класса F, а alkB4 ‒ глутамил-тРНК синтетазы (Whyte et al., 2002). Впоследствии были опубликованы работы, сообщающие об обнаружении новых подтипов генов alkB у родококков (Takei et al., 2008; Xiang et al., 2022). К настоящему времени для генов из окружения всех подтипов alkB, кроме 1 и 2, не известно никакой функциональной связи с потреблением алканов.
По результатам филогенетического анализа можно заключить, что каждая из 5 алкан монооксигеназ относится к своему подтипу, которые характерны для представителей рода Rhodococcus (рисунок).
Рисунок. Слева: филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей алкан монооксигеназ AlkB-типа представителей рода Rhodococcus, построенное по методу Neighbor-Joining; бутстрепы рассчитаны для 1000 повторений, величина поддержки бутстрепа указана цифрами. Последовательности штамма R. qingshengii X5 выделены жирным шрифтом. Стрелками отмечено соответствие консервативному региону. Справа: организация консервативных регионов, в которых локализованы гены alkB разных подтипов. Рамкой обведены кластеры функциональных генов, непосредственно участвующих в метаболизме алканов. Обозначения генов: alkB1‒alkB5 ‒ алкан монооксигеназы соответствующего подтипа; rubA1‒rubA4 ‒ рубредоксины; rubB ‒ рубредоксин редуктаза; alkU ‒ регуляторный белок семейства TetR; manA ‒ маннозо-6-фосфат изомераза; ahcY ‒ аденозил гомоцистеиназа; srtF ‒ сортаза типа F; glnS ‒ глутамил-тРНК синтетаза; ABC ‒ белок-транспортер; araC ‒ транскрипционный регулятор AraC-типа.
Поскольку кластер гена alkB1 содержит функционально необходимые для окисления алканов детерминанты, он представляется важнейшим среди всех остальных гомологов alkB. Ранее была показана сильная связь индукции генов этого типа с ростом на алканах (Takei et al., 2008; Gibu et al., 2019), а в экспериментах по гетерологичной экспрессии ‒ связь гена с деградирующей активностью (Zampolli et al., 2014). Исходя из этого, ген был выбран как целевой для получения мутантного штамма с соответствующей делецией.
В ходе выполнения настоящей работы был получен мутантный штамм R. qingshengii X5ΔalkB1, содержащий делецию гена alkB1, кодирующего алкан монооксигеназу AlkB1 (QEX09356.1). Была проведена оценка его способности к росту в тех же условиях, что и для штамма дикого типа (таблица). В результате у мутантного штамма наблюдалось ослабление роста при температуре 6°C для некоторых алканов, однако полностью способность к их потреблению не пропадала. При 28°C различий между фенотипами мутантного штамма и штамма дикого типа не было обнаружено.
Таким образом, очевидно, что ген alkB1 не является обязательным элементом для метаболизма алканов у штамма Х5. Вероятно, этот ген играет существенную роль для потребления алканов при низких температурах, но и в этом случае очевидно наличие других функционирующих в таких условиях систем.
ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-24-00192, https://rscf.ru/project/23-24-00192/
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
About the authors
K. V. Petrikov
Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Author for correspondence.
Email: petrikov_kv@pbcras.ru
Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, 142290, PushchinoA. A. Rejepova
Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Email: petrikov_kv@pbcras.ru
Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, 142290, PushchinoI. Y. Pozdnyakova-Filatova
Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”
Email: petrikov_kv@pbcras.ru
Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, 142290, PushchinoReferences
- Bredholt H., Eimhjellen K. Induction and development of the oil emulsifying system in an alkane oxidizing Rhodococcus species // Can. J. Microbiol. 1999. V. 45. P. 700–708.
- Delegan Y., Valentovich L., Petrikov K., Vetrova A., Akhremchuk A., Akimov V. Complete genome sequence of Rhodococcus erythropolis X5, a psychrotrophic hydrocarbon-degrading biosurfactant-producing bacterium // Microbiol. Resour. Announc. 2019. V. 8. Art. e01234-19.
- Gibu N., Kasai D., Ikawa T., Akiyama E., Fukuda M. Characterization and transcriptional regulation of n-alkane hydroxylase gene cluster of Rhodococcus jostii RHA1 // Microorganisms. 2019. V. 7. Art. 479.
- Kim D., Choi K. Y., Yoo M., Zylstra G. J., Kim E. Biotechnological potential of Rhodococcus biodegradative pathways // J. Microbiol. Biotechnol. 2018. V. 28. P. 1037–1051.
- Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Mol. Biol. Evol. 2018. V. 35. P. 1547–1549.
- Kunihiro N., Haruki M., Takano K., Morikawa M., Kanaya S. Isolation and characterization of Rhodococcus sp. strains TMP2 and T12 that degrade 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristane) at moderately low temperatures // J. Biotechnol. 2005. V. 115. P. 129–136.
- Ławniczak Ł., Woźniak-Karczewska M., Loibner A. P., Heipieper H. J., Chrzanowski Ł. Microbial degradation of hydrocarbons ‒ basic principles for bioremediation: a review // Molecules. 2020. V. 25. Art. 856.
- Long H., Wang Y., Chang S., Liu G., Chen T., Huo G., Zhang W., Wu X., Tai X., Sun L., Zhang B. Diversity of crude oil-degrading bacteria and alkane hydroxylase (alkB) genes from the Qinghai-Tibet Plateau // Environ. Monit. Assess. 2017. V. 189. Art. 116.
- Moreno R., Rojo F. Enzymes for aerobic degradation of alkanes in bacteria // Aerobic utilization of hydrocarbons, oils, and lipids. Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology / Ed. F. Rojo. Springer International Publishing, 2017. P. 1–25.
- Müller C. A., Weingartner A. M., Dennig A., Ruff A. J., Gröger H., Schwaneberg U. A whole cell biocatalyst for double oxidation of cyclooctane // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2016. V. 43. P. 1641–1646.
- Pérez-de-Mora A., Engel M., Schloter M. Abundance and diversity of n-alkane-degrading bacteria in a forest soil co-contaminated with hydrocarbons and metals: a molecular study on alkB homologous genes // Microbial. Ecol. 2011. V. 62. P. 959–972.
- Petrikov K., Delegan Y., Surin A., Ponamoreva O., Puntus I., Filonov A., Boronin A. Glycolipids of Pseudomonas and Rhodococcus oil-degrading bacteria used in bioremediation preparations: formation and structure // Proc. Biochem. 2013. V. 48. P. 931–935.
- Rojo F. Degradation of alkanes by bacteria // Environ. Microbiol. 2009. V. 11. P. 2477–2490.
- Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
- Schulz S., Giebler J., Chatzinotas A., Wick L. Y., Fetzer I., Welzl G., Harms H., Schloter M. Plant litter and soil type drive abundance, activity and community structure of alkB harbouring microbes in different soil compartments // ISME J. 2012. V. 6. P. 1763–1774.
- Smith C. B., Tolar B. B., Hollibaugh J. T., King G. M. Alkane hydroxylase gene (alkB) phylotype composition and diversity in northern Gulf of Mexico bacterioplankton // Front. Microbiol. 2013. V. 4. Art. 730.
- Sokolovska I., Rozenberg R., Riez C., Rouxhet P. G., Agathos S. N., Wattiau P. Carbon source-induced modifications in the mycolic acid content and cell wall permeability of Rhodococcus erythropolis E1 // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7019–7027.
- Takei D., Washio K., Morikawa M. Identification of alkane hydroxylase genes in Rhodococcus sp. strain TMP2 that degrades a branched alkane // Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 1447–1452.
- Tomasino M., Aparício M., Ribeiro I., Santos F., Caetano M., Almeida C., de Fátima Carvalho M., Mucha A. Diversity and hydrocarbon-degrading potential of deep-sea microbial community from the Mid-Atlantic Ridge, south of the Azores (North Atlantic Ocean) // Microorganisms. 2021. V. 9. Art. 2389.
- Tsai Y.-F., Luo W.-I., Chang J.-L., Chang C.-W., Chuang H.-C., Ramu R., Wei G.-T., Zen J.-M., Yu S. S.-F. Electrochemical hydroxylation of C3–C12 n-alkanes by recombinant alkane hydroxylase (AlkB) and rubredoxin-2 (AlkG) from Pseudomonas putida GPo1 // Sci. Rep. 2017. V. 7. Art. 8369.
- van Beilen J. B., Funhoff E. G. Alkane hydroxylases involved in microbial alkane degradation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 74. P. 13–21.
- van Beilen J. B., Smits T. H.M., Whyte L. G., Schorcht S., Röthlisberger M., Plaggemeier T., Engesser K.-H., Withol B. Alkane hydroxylase homologues in Gram-positive strains // Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 676–682.
- Whyte L. G., Smits T. H.M., Labbé D., Witholt B., Greer C. W., van Beilen J. B. Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strains Q15 and NRRL B-16531 // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 5933–5942.
- Wiesenberg G. L.B., Lehndorff E., Schwark L. Thermal degradation of rye and maize straw: Lipid pattern changes as a function of temperature // Org. Geochem. 2009. V. 40. P. 167–174.
- Xia Y., Li K., Li J., Wang T., Gu L., Xun L. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis // Nucl. Acids Res. 2019. V. 47. P. e15.
- Xiang W., Liang Y., Hong S., Wang G., You J., Xue Y., Ma Y. Degradation of long-chain n-alkanes by a novel thermal-tolerant Rhodococcus strain // Arch. Microbiol. 2022. V. 204. Art. 259.
- Zampolli J., Collina E., Lasagni M., Di Gennaro P. Biodegradation of variable-chain-length n-alkanes in Rhodococcus opacus R7 and the involvement of an alkane hydroxylase system in the metabolism // AMB Express. 2014. V. 4. Art. 73.
Supplementary files
