Application of the bacterial C-DAG system to analyze the ability of amyloids to seed protein aggregation in vitro

封面

如何引用文章

全文:

详细

The search for new amyloid proteins, as well as the study of their properties, is an actual task, which can be solved by a number of different model systems. One of the most popular is the C-DAG approach. It is based on the analysis of aggregation of the investigated proteins on the surface of Escherichia coli cells. According to the original protocol, it can be used to demonstrate one of the characteristic properties of amyloids: the ability to bind the amyloid-specific dye Congo red and demonstrate apple-green birefringence. In addition, the C-DAG technique allows one to analyze the morphology of aggregates and their resistance to detergents. In this work, we tested using Sup35NM as an example whether aggregates on the surface of bacterial cells can act as inducers of aggregation of the corresponding protein.

全文:

Амилоиды представляют собой белковые агрегаты с кросс-β структурой, и на сегодняшний день известно более сотни белков с амилоидными или амилоидоподобными свойствами (Матиив и соавт., 2020). Идентификация новых амилоидов является трудоемкой задачей, для решения которой был предложен ряд подходов. Удобным инструментом для массового скрининга амилоидов in vitro стала тест-система C-DAG (Curli-dependent amyloid generator) (Sivanathan, Hochschild, 2013). Она основана способности бактерий образовывать на своей поверхности структуры из амилоидогенных белков. У Escherichia coli они носят название “curli”, а их основным компонентом является белок CsgA. За транспорт этого белка на поверхность клетки отвечает специфическая сигнальная последовательность (CsgAss). Слияние других белков с CsgAss позволяет также направлять их на экспорт из клетки, и если такой белок обладает амилоидными свойствами, то на поверхности бактериальных клеток будут формироваться амилоидные фибриллы. Впервые это было продемонстрировано на примере амилоидогенного фрагмента Sup35NM (Sivanathan, Hochschild, 2012). Методика C-DAG позволяет в короткие сроки проверять взаимодействие белковых агрегатов с амилоид-специфическим красителем Конго красный. Колонии бактерий с амилоидами, культивируемые на этой среде, становятся красными. Последующий анализ клеток с помощью поляризационной микроскопии позволяет протестировать наличие двойного зеленого лучепреломления образцов. Две эти проверки свидетельствуют о наличии свойств, характерных для амилоидов, а также позволяют выдвинуть предположение о кросс-β структуре агрегатов исследуемого белка. Фибриллярную морфологию агрегатов на поверхности клеток можно продемонстрировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Наконец, биохимические методы позволяют также протестировать устойчивость исследуемых белковых агрегатов к детергентам (Sivanathan, Hochschild, 2013). Методика C-DAG была успешно использована для проверки амилоидных свойств различных белков: Gas1 и Ygp1 (Ryzhova et al., 2018), RopA и RopB (Kosolapova et al., 2019), Esp (Taglialegna et al., 2020), RAD51 (Kachkin et al., 2022), FXR1 (Sopova et al., 2019), YghJ (Belousov et al., 2018) и других. Однако методика C-DAG позволяет проанализировать далеко не все свойства амилоидов. В частности, она не дает информации о способности агрегатов индуцировать агрегацию такого же белка, хотя это также является характерным свойством амилоидов (Chiti, Dobson, 2017; Матиив и соавт., 2020; Willbold et al., 2021). Мы решили заполнить этот пробел и протестировали это на примере Sup35NM.

Рекомбинантный белок Sup35NM выделяли из клеток E. coli BL21(DE3), несущих вектор pET20b-SUP35NM (Allen et al., 2005), согласно ранее опубликованной методике (Serio, Lindquist, 1999). Полученный белок осаждали метанолом и хранили при ‒80°C. Перед экспериментами осадок белка растворяли в 6 М ГГХ в течение ночи при 4°C. Для получения агрегатов Sup35NM измеряли концентрацию белка и разводили его минимум в 100 раз в буфере для сборки фибрилл (буфер F, 5 мМ калий фосфатный буфер pH 7.5, 150 мМ NaCl) до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Полученный раствор инкубировали при 25°C на ротаторе с переворачиванием (60 об./мин) в течение 12‒24 ч. Для анализа кинетики агрегации Sup35NM белок разводили в буфере F (минимум в 50 раз) до концентрации не менее 0.5 мг/мл и центрифугировали при скорости 21130 g и температуре 4°C в течение 30 мин. Этот этап был необходим для удаления не растворившихся агрегатов белка.

Для получения клеток E. coli в системе C-DAG использовали штамм VS39, который трансформировали плазмидой pVS72, несущей ген SUP35NM (Sivanathan, Hochschild, 2013). Подготовку клеток проводили согласно опубликованному протоколу. Для контроля исходный штамм VS39 высевали на среду LB с хлорамфениколом. Чашки с культурами инкубировали при 37°C в течение 48 ч. Клетки собирали с твердой среды и ресуспендировали в 100 мкл буфера F. Суспензию термически инактивировали при 75°C в течение 20 мин. Концентрации клеток в пробах выравнивали на основании оптической плотности суспензий.

Для анализа кинетики агрегации белка использовали следующие компоненты в различных сочетаниях (указаны конечные концентрации в реакционной смеси): мономерный Sup35NM (0.1 мг/мл), фибриллы Sup35NM (0.002 мг/мл), бактериальные клетки (OD600 = 0.01), краситель тиофлавин Т (2.5 мМ). Конечный объем одной пробы составлял 150 мкл, реакция проходила в буфере F. Изменение флуоресценции тиофлавина Т (широко используемый амилоид-специфический краситель) в пробах проводили в планшетах с темными стенками (Corning 3603) на приборе Clariostar Plus (“BMG Labtech”) через каждые 240 с. Флуоресценцию считывали при длине волны 483 ± 10 нм (возбуждение при 448 ± 10 нм). Результаты нормировали, принимая за ноль минимальное значение, а за единицу ‒ медиану флуоресценции на стадии “плато”. Затем для каждой реакции мы подбирали параметры следующей модели (Vaneyck et al., 2021):

y=A2+A1−A21+ex−x0dx,

где A1 и A2 ‒ начальный и финальный уровень флуоресценции, x0 ‒ время полуреакции, dx ‒ величина, обратная скорости агрегации. С учетом подобранных параметров мы также рассчитывали время lag-фазы реакции: lag = x0 ‒ 2dx.

Нам удалось проследить процесс агрегации Sup35NM в присутствии бактериальных клеток. В этом эксперименте в качестве положительного контроля мы использовали фибриллы Sup35NM, полученные in vitro. Ранее в ряде работ было показано, что агрегаты Sup35NM ускоряют агрегацию этого белка (Glover et al., 1997; Chen et al., 2007; Sant’Anna et al., 2016). Мы продемонстрировали, что амилоидные фибриллы Sup35NM, а также бактериальные клетки штамма VS39 с агрегатами этого белка на поверхности клеток, сокращают время начала агрегации (lag-фазы) Sup35NM in vitro (рисунок).

 

Рисунок. Бактериальные клетки с фибриллами Sup35NM ускоряют агрегацию белка Sup35NM in vitro. ∅ ‒ спонтанная агрегация Sup35NM. “Н.з.” ‒ отсутствие значимых отличий; * ‒ p-value < 0.05 (критерий Вилкоксона).

 

При этом клетки VS39, не продуцирующие гетерологичных белков, не имеют подобного эффекта. Таким образом, мы показали, что амилоидные агрегаты на поверхности бактериальных клеток могут индуцировать агрегацию белка in vitro.

БЛАГОДАРНОСТИ

Статья посвящается 300-летию СПбГУ. Работа выполнена с использованием ресурсного центра “Развитие молекулярных и клеточных технологий” СПбГУ. Авторы также благодарят Л.Г. Данилова за техническую помощь в экспериментах.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 22-74-10042.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

作者简介

N. Trubitsina

Saint Petersburg State University

Email: s.bondarev@spbu.ru

Department of Genetics and Biotechnology

俄罗斯联邦, 1199034, Saint Petersburg

O. Zemlyanko

Saint Petersburg State University

Email: stanislavspbgu@gmail.com

Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of Amyloid Biology

俄罗斯联邦, 1199034, Saint Petersburg

G. Zhouravleva

Saint Petersburg State University

Email: s.bondarev@spbu.ru

Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of Amyloid Biology

俄罗斯联邦, 1199034, Saint Petersburg

S. Bondarev

Saint Petersburg State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: stanislavspbgu@gmail.com

Department of Genetics and Biotechnology, Laboratory of Amyloid Biology

俄罗斯联邦, 1199034, Saint Petersburg

参考

  1. Матиив А. Б., Трубицина Н. П., Матвеенко А. Г., Барбитов Ю. А., Журавлева Г. А., Бондарев С. А. Амилоидные и амилоидоподобные агрегаты: многообразие и кризис термина // Биохимия. 2020. Т. 85. № 9. С. 1213–1239.
  2. Matiiv A. B., Trubitsina N. P., Matveenko A. G., Barbitoff Y. A., Zhouravleva G. A., Bondarev S. A. Amyloid and amyloid-like aggregates: diversity and the term crisis // Biochemistry (Moscow). 2020. V. 85. P. 1011–1034.
  3. Allen K. D., Wegrzyn R. D., Chernova T. A., Müller S., Newnam G. P., Winslett P. A., Wittich K. B., Wilkinson K. D., Chernoff Y. O. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+] // Genetics. 2005. V. 169. P. 1227–1242.
  4. Belousov M. V., Bondarev S. A., Kosolapova A. O., Antonets K. S., Sulatskaya A. I., Sulatsky M. I., Zhouravleva G. A., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Nizhnikov A. A. M60-like metalloprotease domain of the Escherichia coli YghJ protein forms amyloid fibrils. // PLoS One. 2018. V. 13. Art. e0191317.
  5. Chen B., Newnam G. P., Chernoff Y. O. Prion species barrier between the closely related yeast proteins is detected despite coaggregation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 2791–2796.
  6. Chiti F., Dobson C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade // Annu. Rev. Biochem. 2017. V. 86. P. 27–68.
  7. Glover J. R., Kowal A. S., Schirmer E. C., Patino M. M., Liu J. J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae // Cell. 1997. V. 89. P. 811–819.
  8. Kachkin D. V., Volkov K.V, Sopova J.V, Bobylev A. G., Fedotov S. A., Inge-Vechtomov S.G., Galzitskaya O. V., Chernoff Y. O., Rubel A. A., Aksenova A. Y. Human RAD51 protein forms amyloid-like aggregates in vitro // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. Art. 11657.
  9. Kosolapova A. O., Belousov M. V., Sulatskaya A. I., Belousova M. V., Sulatsky M. I., Antonets K. S., Volkov K. V., Lykholay A. N., Shtark O. Y., Vasileva E. N., Zhukov V. A., Ivanova A. N., Zykin P. A., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Tikhonovich I. A., Nizhnikov A. A. Two novel amyloid proteins, RopA and RopB, from the root nodule bacterium Rhizobium leguminosarum // Biomolecules. 2019. V. 9. Art. 694.
  10. Ryzhova T. A., Sopova J. V., Zadorsky S. P., Siniukova V. A., Sergeeva A. V., Galkina S. A., Nizhnikov A. A., Shenfeld A. A., Volkov K. V., Galkin A. P. Screening for amyloid proteins in the yeast proteome // Curr. Genet. 2018. V. 64. P. 469–478.
  11. Sant’Anna R., Fernández M. R., Batlle C., Navarro S., de Groot N. S., Serpell L., Ventura S. Characterization of amyloid cores in prion domains // Sci. Rep. 2016. V. 6. Art. 34274.
  12. Serio T. R., Lindquist S. L. [PSI+]: an epigenetic modulator of translation termination efficiency // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. V. 15. P. 661–703.
  13. Sivanathan V., Hochschild A. Generating extracellular amyloid aggregates using E. coli cells // Genes Dev. 2012. V. 26. P. 2659–2667.
  14. Sivanathan V., Hochschild A. A bacterial export system for generating extracellular amyloid aggregates // Nat. Protoc. 2013. V. 8. P. 1381–1390.
  15. Sopova J. V., Koshel E. I., Belashova T. A., Zadorsky S. P., Sergeeva A. V., Siniukova V. A., Shenfeld A. A., Velizhanina M. E., Volkov K. V., Nizhnikov A. A., Kachkin D. V., Gaginskaya E. R., Galkin A. P. RNA-binding protein FXR1 is presented in rat brain in amyloid form // Sci. Rep. 2019. V. 9. Art. 18983.
  16. Taglialegna A., Matilla-Cuenca L., Dorado-Morales P., Navarro S., Ventura S., Garnett J. A., Lasa I., Valle J. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers // NPJ Biofilms Microbiomes. 2020. V. 6. P. 15. https://doi.org/10.1038/s41522-020-0125-2
  17. Vaneyck J., Segers-Nolten I., Broersen K., Claessens M. M.A.E. Cross-seeding of alpha-synuclein aggregation by amyloid fibrils of food proteins // J. Biol. Chem. 2021. V. 296. Art. 100358.
  18. Willbold D., Strodel B., Schröder G. F., Hoyer W., Heise H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids // Chem. Rev. 2021. V. 121. P. 8285–8307.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Figure. Bacterial cells with Sup35NM fibrils accelerate the aggregation of Sup35NM protein in vitro. ∅ ‒ spontaneous aggregation of Sup35NM. “NS” ‒ no significant differences; * ‒ p-value < 0.05 (Wilcoxon test).

下载 (19KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».