Methanosarcina baikalica sp. nov., a new methanogenic archaea isolated from surface bottom sediments of Lake Baikal

Full Text

Methanosarcina baikalica sp. nov., новая метаногенная архея, выделенная из поверхностных придонных осадков озера Байкал ¹

Озеро Байкал – самое древнее, глубокое и крупное по объему пресных вод озеро на Земле. Оно расположено в тектонически активной рифтовой зоне Восточной Сибири, что способствует созданию в нем своеобразных биотопов, развитие которых в значительной степени обусловлено наличием в тектонически ослабленных зонах дна озера метановых и нефтяных высачиваний разного генезиса. Вся многокилометровая толща донных отложений обитаема для микроорганизмов (Намсараев, Земская, 2000). Микробиологические исследования озера Байкал проводились с 20-х годов XX столетия, но в последние десятилетия с развитием молекулярных методов основное внимание было уделено изучению биоразнообразия разных групп микроорганизмов-деструкторов в составе микробных сообществ донных осадков, в том числе анаэробных (Земская и соавт., 2021), а также оценке скоростей процессов деструкции органического вещества (Намсараев, Земская, 2000; Пименов и соавт., 2014). Было установлено, что из-за дефицита сульфата в воде озера Байкал процесс сульфатредукции, обнаруженный в осадках озера, имеет второстепенное значение (Пименов и соавт., 2014), а основным конечным продуктом микробного разложения органического вещества является метан (Намсараев и Земская, 2000; Дагурова и соавт., 2004).

В анаэробных сообществах донных отложений оз. Байкал, в том числе приуроченных к разгрузкам газо- и нефтенасыщенных флюидов, присутствие и разнообразие метаногенных архей было выявлено на основе иммунофлуоресцентного окрашивания (Намсараев, Земская, 2000), получения накопительных культур с использованием основных субстратов метаногенеза (Павлова и соавт., 2014; Букин и соавт., 2018) и секвенирования генов 16S рРНК и mcrA (Шубенкова и соавт., 2005; Lomakina et al., 2014, 2018; Kadnikov et al., 2012; Черницына и соавт., 2016; Bukin et al., 2020). В донных осадках было выявлено присутствие метаногенов всех известных путей метаногенеза – гидрогенотрофного, ацетокластического, метилотрофного и водород-зависимого метилотрофного, с доминированием в глубоководных донных отложениях гидрогенотрофного метаногенеза (Земская и соавт., 2021). Примененные экологические и молекулярно-биологические методы для изучения скоростей процесса метаногенеза и разнообразия метаногенов донных осадков оз. Байкал не исключают выделения и изучения их чистых культур, необходимых как для прямого доказательства функционирования того или иного пути метаногенеза, осуществляемого метаногенными археями в анаэробном сообществе, так и для выявления их физиологических особенностей, связанных с местом обитания.

Ранее из зоны нефтепроявления центральной части Байкала были выделены первые представители метаногенных архей – использующий водород M ethanobacterium flexile Z-7215 и Methanosarcina sp., штамм Z-7115^T (Жилина и соавт., 2017). В этой работе мы приводим полное филогенетическое и фенотипическое описание выделенного штамма Methanosarcina и на основании проведенных исследований предлагаем отнести его к новому виду – Methanosarcina baikalica s p. nov.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Источник выделения. Исходным материалом для накопления и выделения метаногенных архей служили пробы глубоководных донных осадков пресноводного оз. Байкал (Восточная Сибирь, Россия). Пробы были отобраны Н.В. Пименовым в Кукуйском каньоне с разных горизонтов над газогидратами (GR-1; GR-2) и зонами нефтепроявления (BС-6; GG-6 “черпак”) центральной части оз. Байкал (Горевой утес) с борта научного судна “Г.Ю. Верещагин” в июле 2013 г. Источником для выделения штамма Z-7115^Т послужила проба ВС-6 (E 105°23.4670, N 52°18.2656) восстановленного ила темно-серого цвета маслянистой консистенции с глубины 5–10 см от поверхности донных отложений.

Накопительные культуры и условия культивирования. Для выявления метаногенов в исследуемых пробах и получения накопительных культур была использована низкоминерализованная среда Пфеннига, которая содержала (г/л): NH₄Cl ‒ 0.33; KH₂PO₄ ‒ 0.33; MgCl₂ ‧ 2H₂O – 0.33; CaCl₂ ‧ 2H₂O – 0.33; KCl – 0.33; NaHCO₃ – 1; раствор микроэлементов – 1 мл/л; раствор витаминов по Волину – 10 мл/л; ацетат натрия – 2 мМ; цистеин-хлорид – 0.3; Na₂S ‧ 9H₂O – 0.4. После стерилизации среды ее pH составлял 6.8–7.0. В качестве субстратов были использованы следующие варианты: смесь Н₂/CO₂ (80 : 20); ацетат 20 мМ; метанол 40 мМ + триметиламин (ТМА) 10 мМ; формиат натрия 40 мМ. Приготовление среды и культивирование проводили в строго анаэробных условиях в атмосфере N₂/CO₂ (80 : 20) в случае использования органических субстратов.

Для накопительных культур использовали герметически закрытые флаконы объемом 100 мл с 50 мл среды на органических субстратах и 20 мл среды с H₂/CO₂ в газовой фазе, в которые вносили 1 мл суспензии ила из исследуемых проб. Суспензия была приготовлена добавлением во флакон объемом 100 мл 5 г ила и 50 мл анаэробной минеральной среды со стеклянными шариками под током N₂/CO₂ (80 : 20).

Инкубацию проводили при 6 и 18°С. О развитии двух конкурирующих за водород и метильные соединения метаболических групп анаэробов – метаногенов и ацетогенов – судили по образованию метана или ацетата после 3-х и 12-ти месяцев инкубации.

Состав среды для выделения и пересевов исследуемого в работе штамма Z-7115^Т в основном соответствовал составу среды для накопительных культур, но дополнительно содержал (г/л): дрожжевой экстракт Bacto (“BD”) – 0.05 (вместо раствора витаминов); резазурин – 0.02; Na₂S × 9H₂O – 0.5; метанол – 30 мМ.

Физиологические характеристики. Зависимости скорости метаногенеза от pH и температуры определяли на среде с метанолом как субстратом в пробирках Хангейта в двух повторностях. Зависимость роста микроорганизма от рН определяли при 25°С. Значения рН устанавливали добавлением растворов 6 н HCl или 6 н NaOH. Температурную зависимость роста штамма определяли в области от 5 до 40°С с шагом в 5°С.

Для определения спектра используемых субстратов для метаногенеза их вносили из стерильных концентрированных растворов в среду перед засевом в следующих конечных концентрациях (мМ): метанол – 30; ТМА, диметиламин (ДМА), монометиламин (ММА), ацетат, формиат, пируват, пропанол, изопропанол – 20; н-бутанол – 10; диметилсульфид (DMS) – 2. Использование молекулярного водорода тестировали в смеси H₂/CO₂ (80: 20).

Аналитические методы. Метан, водород и ацетат определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000.2 (“Хроматэк”, Россия). Разделение метана и водорода проводили на стеклянной колонке длиной 1 м, заполненной фазой Carboxen^TM 1000 (“Supelсo”, CША) и присоединенной к детектору ДТП. Ацетат определяли на колонке, заполненной фазой Carbopack C + 0.3% Carbowax 20M + 0.1% H₃PO₄ (“Supelсo”).

Морфология. Живые клетки исследовали в фазово-контрастном микроскопе ZETOPAN (“Reichert”, Австрия). Для получения ультратонких срезов осадок клеток фиксировали в 1.5%-ом растворе глутаральдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч и дополнительно фиксировали в 1%-ом растворе OsO₄ в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3 ч при 20°С. После обезвоживания в серии спиртов материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (“JEOL”, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв.

Выделение ДНК, секвенирование и анализ полного генома. Выделение ДНК проводили с помощью FastDNA Spin Kit (“MP Bio”), следуя протоколу производителя. Геном штамма Z-7115^T секвенировали, используя систему DNBSEQ-G400 (“MGI Tech”) прочтениями по 2 × 150 нуклеотидов. Сборку генома проводили с помощью ПО Unicycler 0.5.0 (Wick et al., 2017). Поиск генов и аннотацию проводили с использованием ПО PGAP (Tatusova et al., 2016). Полноту и контаминацию сборки оценивали с помощью ПО CheckM v1.2.2 (Parks et al., 2015).

Филогенетический анализ. Филогенетическую реконструкцию на основе 53 консервативных однокопийных маркерных генов проводили с помощью ПО GTDB-Tk 2.3.2 de_novo_wf (Chaumeil et al., 2022). Филогенетическую реконструкцию на основе гена 16S рРНК проводили с помощью ПО IQ-TREE 2.2.0.3 (Minh et al., 2020). Виртуальная оценка гибридизации геномов осуществлялась с помощью ПО GGDC 3.0 (Meier-Kolthoff et al., 2022) по алгоритму “identities / HSP length”. Для вычисления и построения матрицы распределения и тепловой карты bANI между геномами рода Methanosarcina использован набор инструментов GET_HOMOLOGUES v. 16092021 (Contreras-Moreira, Vinuesa, 2013).

Депонирование нуклеотидных последовательностей. Полногеномная последовательность штамма Z-7115^T депонирована в GenBank/EMBL под номером JAVKPK000000000. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма Z-7115^T депонирована в GenBank/EMBL под номером KY780617.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Накопительные культуры. При посеве проб на среды с вышеперечисленными субстратами метаногенеза и инкубации при температуре 6 или 18°С рост был детектирован только при 18°С. В накопительных культурах были выявлены метилотрофные и гидрогенотрофные метаногены и ацетогены. При 6°С после инкубации в течение года роста микроорганизмов и метаногенеза не было выявлено. В пробах над газогидратами (GR-1, GR-2) водород использовался исключительно на ацетогенез. На метилированных соединениях рост был незначительным, и небольшое количество ацетата образовалось в обеих пробах, наряду с метаном в пробе GR-1. Ацетат и формиат либо не использовались (проба Gr-1), либо использовались крайне слабо (проба Gr-2), что не дало возможности получить устойчивые накопительные культуры метаногенов на этих субстратах. В пробах зоны нефтепроявления (BС-6, GG-6) метилированные соединения использовались исключительно метаногенами, но и на водороде шло их развитие, наряду с ацетогенами. Небольшое образование метана из ацетата было детектировано только в пробе ВС-6. В пробе GG-6 формиат преимущественно использовался на метаногенез, а в пробе ВС-6 на ацетогенез (рис. 1).

 

Рис. 1. Сравнение процессов метаногенеза (синие столбцы) и ацетогенеза (желтые столбцы) на разных субстратах метаногенеза в пробах озера Байкал над газогидратами (GR-1, GR-2) и зоны нефтепроявления (BС-6, GG-6).

 

На метилированных соединениях метаногены были представлены кокковидными клетками – неподвижными и агрегированными в сарциноподобные пакеты, а на водороде и формиате – палочковидными формами или подвижными плоскими и угловатыми кокками. Ацетогены были представлены спорообразующими палочками разных морфотипов.

Для идентификации присутствующих метаногенных архей была проведена ПЦР-реакция с использованием универсальных архейных праймерных систем для амплификации генов 16S рРНК двух накопительных культур (BC-6; GG-6) на метилированных субстратах и одной (GG-6/2) на Н₂/СО_2. В пробе BC-6 на метилированных субстратах была выявлена архея, имеющая 98.51% сходства с Methanosarcina siciliae T4/M^Т и 98.4% с Methanosarcina subterranea HC-2^T. С водородом, как субстратом, были детектированы археи рода Methanobacterium, из них доминирующая была близка к Methanobacterium flexile c 99.9% сходства. Обе археи – Methanosarcina sp. Z-7115^T и гидрогенотрофная M. flexile Z-7215 были выделены в чистую культуру, и Methanosarcina sp. Z-7115^T была далее описана.

Выделение чистой культуры Methanosarcina sp. Рост метаносарцины в жидкой среде визуально определяли по появлению на дне флаконов желтоватого осадка, легко диспергируемого при перемешивании. На твердой среде с агаром (2%, “Bacto”) роста получено не было. Чистая культура метаносарцины, обозначенная как штамм Z-7115^Т, была получена методом последовательных десятикратных разведений в жидкой среде c метанолом в присутствии смеси антибиотиков ампициллина и оксициллина (по 500 мг/л). Чистота культуры была подтверждена микроскопически, отсутствием роста на богатых органических средах с дрожжевым экстрактом и триптиказой (по 1 г/л) или глюкозой (3 г/л), а также результатом анализа гена 16S рРНК с использованием различных праймеров.

Морфология. Клетки штамма Z-7115 ^Т кокковидные, неподвижные, размером 0.2–3.0 мкм, объединены в сарциноподобные пакеты и их небольшие агрегаты-конгломераты размером 6–9 мкм, описанные ранее для метаносарцин (Жилина, 1976) как морфотип 2 (рис. 2а).

 

Рис. 2. Морфология клеток штамма Z-7115^Т: а ‒ световой микроскоп, фазовый контраст, масштабная метка ‒ 5 мкм; б ‒ электронный микроскоп, масштабная метка – 1 мкм.

 

Варьирование в размере клеток определяется характерным способом деления метаносарцин – неравномерным и не всегда синхронным, с образованием клеточных сферических сегментов, видимых на срезах (Жилина, 1971) (рис. 2б). Они объединены капсулярным, не плотным для электронов слоем полисахаридной природы (рис. 2б). Цитоплазма содержит множество рибосом и нитей ДНК. В ней присутствуют скопления мелких хаотически ориентированных (иногда в виде цепочек) гетерогенных электронно-плотных включений, подобных наблюдаемым ранее у M. vacuolata и определенных как гликоген (Жилина, 1971).

Рост и метаболические свойства. Штамм Z-7115^Т – строгий анаэроб, развивающийся только в присутствии восстановителей, таких как сульфид или тиогликолат натрия. Штамм Z-7115^Т использовал в качестве источника энергии только метанол, моно- ди-, триметиламины и ацетат. На ацетате рост слабый, медленный и не всегда воспроизводимый, хотя в случаях позитивного роста было установлено его потребление, сопровождающееся образованием метана. Рост и метаногенез отсутствовали на смеси H₂/CO₂ и формиате. Водород не потреблялся и в сочетании с метанолом, но и не угнетал рост и метаногенез на этом субстрате. Пируват, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол не использовались для роста и метаногенеза. Штамм Z-7115^Т не нуждался в органических добавках. Небольшое количество дрожжевого экстракта в среде (50 мг/л) могло быть заменено раствором витаминов или ацетатом натрия (2 мМ). Штамм Z-7115^Т не нуждался в NaCl и был толерантен к его присутствию в среде без ухудшения роста до концентрации 0.05 М NaCl. Падение урожая клеток и метаногенеза в два раза наблюдалось при концентрации NaCl 0.1 M, в три раза – при 0.2 M NaCl по сравнению с контролем, где NaCl отсутствовал, и полным ингибированием при NaCl 0.3 М и выше. Штамм Z-7115^Т – нейтрофил с областью роста при значениях рН 6.3–7.5 и оптимумом при рН 7.3 (дополнительные материалы, рис. S1a). Выше рН 7.7 и ниже рН 6.0 рост отсутствовал. По отношению к температуре культуру можно характеризовать как мезофильную, с областью развития при температуре 15–35°С и оптимумом роста при 25°С (рис. S1б).

Филогенетическое положение. Филогенетический анализ полной последовательности гена 16S рРНК штамма Z-7115^Т показал, что изолят представляет собой хорошо обособленную отдельную ветвь внутри рода Methanosarcina (риc. 3а), а его ближайшим валидно описанным родственником является штамм M. siciliae T4/M^T (Ni et al., 1994) с уровнем сходства по гену 16S рРНК 98.51%.

Виртуальная оценка гибридизации геномов этих двух штаммов составила 23.3%, а вероятность того, что гибридизация даст значение больше 70%, составила 0%. Филогенетический анализ на основе 53 консервативных однокопийных маркерных генов (Chaumeil et al., 2022) показал результат, схожий с результатом анализа гена 16S рРНК, но с более высокой статистической достоверностью (риc. 3б). ANI между геномами штамма Z-7115^T и типовыми штаммами видов рода Methanosarcina составило 83.2–85.7% (рис. 4).

 

Рис. 3. Филогенетическое дерево, основанное на последовательностях гена 16S рРНК (а) и на 53 консервативных однокопийных маркерных генах (б) (Chaumeil et al., 2022). Дерево было реконструировано методом maximum-likelihood с помощью ПО IQ-TREE 2.2.0.3 (Minh et al., 2020). Значения бутстрепа выше показаны в узлах. Масштабная метка ‒ 0.1 замен на нуклеотидное положение.

 

Рис. 4. Упорядоченная тепловая карта, построенная по матрице распределения коэффициентов ANI между геномами рода Methanosarcina.

 

Общие характеристики генома. Полученный геном штамма Z-7115^T состоял из 157 контигов с общей длиной 3742969 п.о., N50 = 48212. Полнота сборки составила 99.84%; уровень вероятной контаминации сборки – 0.327%. Содержание Г + Ц геномной ДНК составило 40.76%. Геном содержал 3302 генов, из которых 3151 кодирующий белок ген и 63 кодирующих РНК генов, 59 из которых кодируют тРНК. В геноме содержатся по одной копии генов 16S и 23S рРНК.

Гены, связанные с метаногенезом. В геноме штамма Z-7115^T присутствовали все основные гены белков гидрогенотрофного/метилотрофного метаногенного пути (формилметанофуран дегидрогеназа, fwd; формилметанофуран-тетрагидрометаноптери N-формилтрансфераза, ftr; метенилтетрагидрометаноптерин циклогидролаза, mch; метилентетрагидрометаноптерин дегидрогеназа, mtd; 5,10-метилентетрагидрометаноптерин редуктаза, mer; коэнзим F420-гидрогеназа, frh; тетрагидрометаноптерин S-метилтрансфераза, mtr; метил-коэнзим М редуктаза, mcr; гетеродисульфид редуктаза, hdrABCDE).

В геноме отсутствуют гены F₄₂₀-восстанавливающей формиатдегидрогеназы fdh, что не позволяет штамму использовать в качестве субстрата формиат. Присутствуют все гены для использования в качестве субстрата метанола (mtaABC), но часть генов для роста на моно-, ди- и триметиламине либо имеет нарушенную рамку считывания (mttB, mtbB), либо отсутствует (mtmB).

У штамма Z-7115^T обнаружены все гены комплекса ACDS (cdhA₁A₂A₃B₁B₂C₁C₂E₁E₂) для восстановительного пути Вуда–Льюнгдала и гены ферментов активации ацетата, универсальные для рода Methanosarcina: ацетаткиназы (ackA) и фосфоацетилтрансферазы (pta).

Отсутствуют гены ацетил-КоА синтетазы (АДФ-зависимой, EC 6.2.1.1.3) acdA и acdB, что в целом необычно, поскольку этот фермент присутствует у большей части исследованных типовых штаммов рода, как использующих ацетат в качестве катаболического субстрата (M. acetivorans C2A^T (GCA_000007345.1), M. horonobensis HB-1^T (GCA_000970285.1), M. ther mophila TM-1^T (GCA_000969885.1), M. vacuola ta Z-761^T (GCA_000969905.1), M. soligelidi SMA-21^T (GCA_000744315.1), M. flavescens E03.2^T (GCA_001304615.2)), так и неспособных его использовать (M. siciliae T4/M^T (GCA_000970085.1)). Ген acdA отсутствовал также у штамма M. spelaei MC-15^T (GCA_002287235.1), который мог использовать ацетат для роста.

У штамма Z-7115^T обнаружены основные дегидрогеназы, связанные с генерацией трансмембранного потенциала и использованием молекулярного водорода у цитохром-содержащих метаногенов: frhABDG, vhtACDG, fpoABCDEFGHIJK, hdrDE, а также echABCDEF, которую в некоторых работах связывают со способностью метаносарцин к потреблению ацетата как единственного субстрата (Kulkarni et al., 2018). Дегидрогеназы rnfABCDEG и ионный транспортер mrpABCDEFG, необходимые для роста на ацетате, в частности, M. acetivorans C2A^T (Ferry, 2020), у исследуемого штамма не обнаружены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Штамм Z-7115^Т по типу обмена является строго анаэробным хемоорганотрофом. Диапазон предпочтительно используемых им субстратов характеризует его, прежде всего, как метилотрофного метаногена. Лучшим из метилированых субстратов для роста является метанол, и все гены, необходимые для его использования, у организма присутствуют. Несмотря на то, что часть генов для роста на моно-, ди- и триметиламине имеет нарушенную рамку считывания (mttB, mtbB), либо отсутствует (mtmB), штамм Z-7115^Т стабильно растет на всех трех метиламинах с предпочтением ТМА.

Организм не способен к использованию формиата, и в геноме отсутствуют соответствующие этой возможности гены. В геноме обнаружены основные дегидрогеназы, связанные с генерацией трансмембранного потенциала и использованием молекулярного водорода. Таким образом, штамм теоретически способен использовать водород как донор электронов, однако есть неопределенные причины, мешающие ему реализовать эту возможность, и с СО_2, как акцептором, и при метилредуцирующем метаногенезе на метаноле. Несмотря на имеющиеся гены белков восстановительного пути Вуда–Льюнгдала и гены ферментов активации ацетата, универсальные для рода Methanosarcina, ацетат используется штаммом Z-7115^Т крайне слабо, и рост на нем нестабилен. Потенциально имеющиеся в геноме возможности для осуществления в анаэробном сообществе метаногенеза тремя известными путями, по сути, ограничены для исследуемого штамма метилотрофным путем.

Наиболее вероятным для него субстратом в анаэробном сообществе донных отложений оз. Байкал может быть метанол, образуемый в пресноводных водоемах при разложении пектина и лигноцеллюлозы клеточных стенок водорослей. Метиламины – специфичные субстраты метаногенеза для гиперсоленых мест обитания. Их появление обусловлено деградацией осмопротектора бетаина, и специализированные на использовании исключительно метиламинов экстремально галофильные метаногены были открыты вместе с ацетогеном, способным разлагать бетаин с образованием метиламинов (Zhilina, Zavarzin, 1990). В оз. Байкал детектированное присутствие метиламинов в верхних слоях осадков зон разгрузок, откуда был выделен штамм, объясняется их миграцией из глубинных осадков, что согласуется с изотопным составом растворенного биогенного метана, характерным для его образования преимущественно восстановлением метильных групп (Земская и соавт., 2021). Помимо способных к использованию метилированных соединений представителей семейства Methanosarcinaceae в оз. Байкал выявлены метил-редуцирующие археи порядка Methanomassiliicoccales, семейств Methanomethyliaceae и Methanofastidiosaceae, что дополнительно подтверждает возможность образования биогенного метана в донных осадках путем использования метилированных соединений, в том числе метиламинов (Земская и соавт., 2021). Выделение нами чистой культуры метаногенной археи, использующей метанол и метиламины для метаногенеза, микробиологически обосновывает сделанные ранее предположения.

По своим физиологическим характеристикам (зависимости роста от рН, температуры, минерализации среды) штамм Z-7115^T соответствует занимаемой им экологической нише (таблица). Воды оз. Байкал классифицируются как гидрокарбонатные и отличаются низкой минерализацией. Общая минерализация поровых вод донных отложений выше водной толщи и достигает 120–400 мг/л (Намсараев, Земская, 2000). Штамм Z-7115^T может развиваться при такой низкой минерализации, поскольку способен расти на среде Пфеннига, разведенной в 2–3 раза, с общей минерализацией 500 мг/л. Не нуждаясь в хлориде натрия, новый изолят толерантен лишь к его крайне низким концентрациям <0.1 M, с полным ингибированием роста и метаногенеза уже при 0.3 М NaCl. Диапазон рН для роста штамма лежит в границах, установленных для донных отложений оз. Байкал (рН 6.7–8.0) (Намсараев, Земская, 2000). Температурный оптимум роста выделенного штамма (25°С) значительно ниже характерного для большинства мезофильных штаммов и сопоставим с таковым у психротолерантного вида Мethanosarcina lacustris (Simankova et al., 2001). В тоже время новый изолят не рос при 10°С и ниже, и его нельзя отнести к психротолерантным видам.

 

Таблица. Сравнительные признаки нового изолята с типовыми штаммами ближайших видов рода Methanosarcina

Свойства	Z-7115T	M. siciliae T4/M1, 2	M. subterranea HC-23	M. acetivorans C2A4	M. vacuolata Z-7615, 6	M. lacustris ZS7	M. barkeri MS8, 6
Клетки, мкм Рост в жидкой среде	0.2‒3 Морфотип 2	0.5 ‒ 3.0 Морфотип 3, 2	0.9 ‒ 1.4 Морфотип 3, 2	1.9 Морфотип 3 и цисты	1 ‒ 2 Морфотип 2	1.5 ‒ 3.5 Морфотип 1	1.5‒2.0 Морфотип 2
Окраска по Грамму Лизис 0.01% (w/v) SDS	Нд ‒	‒ +	‒ +	‒ +	+ ‒	+ Нд	+ ‒
Температура роста (°С): диапазон оптимум	15 ‒ 35 25	25 ‒ 45 40	10 ‒ 40 35	15 ‒ 4 2 35 ‒ 40	18 ‒ 45 37 ‒ 40	1 ‒ 35 25	20 ‒ 45 40 ‒ 42
рН роста: диапазон оптимум	6.5 ‒ 7.5 7.3	6.0 ‒ 7.7 6.5 ‒ 6.8	5.9 ‒ 7.4 6.6 ‒ 6.8	5. 0‒7.0 6.0	6.0 ‒ 8.0 7.5	4.5 ‒ 8.5 7.0	5.0 ‒ 8.0 6.0 ‒ 7.0
Влияние NaCl (M): диапазон оптимум	0 ‒ 0.2 0 ‒ <0.1	0 ‒ >1.7 0.4 ‒ 0.6	0 ‒ 0.6 0.1 ‒ 0.2	0.1 ‒ 1.0 0.1 ‒ 0.6	0.1 ‒ 0.5 0.1 ‒ 0.125	Нд Нд	0.1 ‒ 0.8 0.1 ‒ 0.125
Субстраты: H2/CO2 Метанол Триметиламин Диметиламин Монометиламин Диметилсульфид Ацетат	‒ + + + + ‒ +/‒	‒ + + Нд Нд + ‒	‒ + + + + + ‒	‒ + + + + + +	+ + + Нд + Нд +	+ + + + + ‒ ‒	+ + + Нд Нд Нд +
Стимуляция роста дрожжевым экстрактом	‒	+	+	‒	+	+	+
Г + Ц, мол. %	40. 76 (геном)	4 1. 5 (Тm)	4 1. 5 (геном)	4 1 ± 1 (Tm)	5 1 ± 0.5 (Тm)	43.4 (Tm)	38.8 ‒ 43.5
Источник выделения	Пресные донные осадки оз. Байкал, Россия	Морские осадки	Из глубоких недр в формации диатомовых сланцев Хоронобе, Япония	Морские осадки Scripps Canjon, La Jolla, California	Сброженный ил метантенк	Пресные озерные осадки, Швейцария	Сточные воды

Обозначения: “‒” ‒ нет роста; “+/‒” ‒ слабый, нестабильный; Нд – нет данных; T_m ‒ температура плавления.

Морфотипы (Жилина, 1976): морфотип 1 – большие не разделяемые агрегаты псевдосарцин ‒ зерна (псевдопаренхима); морфотип 2 – кокковидные клетки по 2‒4 в пакетах (псевдосарцина) и небольшие агрегаты их; морфотип 3 – отдельные кокковидные клетки.

Ссылки на источник: 1 ‒ Ni & Boone, 1991; 2 ‒ Ni et al., 1994; 3 ‒ Shimizu et al., 2015; 4 ‒ Sowers et al., 1984; 5 ‒ Zhilina & Zavarzin, 1987; 6 ‒ Maestrojuan & Boone, 1991; 7 ‒ Simankova et al., 2001; 8 ‒ Bryant & Boone, 1987.

 

Приведенное в таблице фенотипическое сравнение штамма Z-7115^T с филогенетически близкими видами рода Methanosarcina показывает, что толерантность к NaCl можно считать важным отличительным признаком в этой группе метаносарцин. Штамм Z-7115^Т наиболее чувствителен к повышению солености и требует низкой минерализации среды, что отличает его от других пресноводных метаносарцин и филогенетически близким с ним морских видов – M. siciliae (Ni, Boone, 1991; Ni et al., 1994), M. subterranea (Shimizu et al., 2015) и M. acetivorans (Sowers et al., 1984; Ni et al.,1994). Близкие к штамму виды различаются также размерами и степенью агрегации клеток, составом клеточных стенок, что определяется действием на них детергентов, границами и оптимумом температуры роста, а также способностью использовать водород и/или ацетат (таблица). Штамм Z-7115^Т способен использовать ацетат, имеет, как и другие пресноводные метаносарцины, полисахаридную, а не белковую клеточную стенку, иные границы и оптимум температуры роста, иное место обитания, что отличает его от близкородственного вида M. siciliae T4/M^Т.

На основании совокупности морфофизиологических свойств и филогенетических данных можно утверждать, что выделенный метаноген представляет новый вид рода Methanosarcina, для которого мы предлагаем название Methanosarcina baikalica sp. nov. с типовым штаммом Z-7115^T.

Описание Methanosarcina baikalica sp. nov.

Methanosarcina baikalica (bai’ ka.li.ca. L.n. baikalicum, the Baikal lake. N.L. fem.adj. по названию озера Байкал, из которого организм был выделен).

Клетки неподвижные, кокковидные, диаметром 0.2–3.0 мкм, в парах, тетрадах или небольших сарциноподобных агрегатах. В жидкой среде растет в виде легко диспергируемого желтоватого осадка. Строгий анаэроб. Субстратами для роста и метаногенеза служат метанол, моно-, ди-, триметиламины и ацетат. Не использует смеси H₂ + CO_2, Н₂ + метанол, формиат, пируват, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол и диметилсульфид. Ацетат (0.2 г/л) требуется для роста в качестве источника углерода. Дрожжевой экстракт не стимулирует рост и может быть заменен раствором витаминов. Мезофил с областью роста при 15–35°С (оптимум 25°С); нейтрофил, растет при значениях рН 6.3–7.5 (оптимум рН 7.3). Развитие возможно в среде с низкой минерализацией (Σ 500 мг/л). Не нуждается в NaCl и толерантен к низким его концентрациям <0.1 М с ингибированием роста и метаногенеза при 0.3 М NaCl. Содержание Г + Ц в геноме типового штамма 40.76 мол. %.

Место обитания – донные осадки пресноводных водоемов. Типовой штамм Z-7115^T (=JCM 39438, =VKM B-3565) выделен из поверхностного слоя донных осадков озера Байкал (Восточная Сибирь, Россия).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках госзадания № 122041100029-2 ФИЦ Биотехнологии РАН.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: https://doi.org/10.31857/S002636562406002

About the authors

T. N. Zhilina

Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: Zhilinat@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, Moscow, 119071

A. Yu. Merkel

Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Email: Zhilinat@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, Moscow, 119071

T. V. Kolganova

Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Email: lichoradkin43@gmail.com

Skryabin Institute of Bioengineering

Russian Federation, Moscow, 119071

V. E. Trubitsyn

Pushchino Research Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: lichoradkin43@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

V. A. Shcherbakova

Pushchino Research Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: lichoradkin43@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

N. E. Suzina

Pushchino Research Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: lichoradkin43@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

N. V. Pimenov

Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Email: Zhilinat@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, Moscow, 119071

References

Supplementary files