Modulation of azithromycin activity against monospecies and binary biofilms Staphylococcus aureus and Kytococcus schroeteri by norepinephrine

Full Text

Модуляция активности азитромицина в отношении моновидовых и бинарных биопленок Staphylococcus aureus и Kytococcus schroeteri гормоном норадреналином ¹

Грамположительные кокки Staphylococcus aureus (филум Firmicutes) и Kytococcus schroeteri (филум Actinobacteria) входят в состав микробиоты кожи человека. S. aureus – условно-патогенная бактерия, в определенных случаях вызывающая целый ряд заболеваний, начиная с относительно “легких” кожных инфекций (акне вулгарис, импетиго, фурункулеза, флегмоны), до смертельно опасных (пневмонии, менингита, остеомиелита, эндокардита, инфекционно-токсического шока и сепсиса) (Tong et al., 2015). Многие штаммы S. aureus устойчивы к антибиотикам. Наибольшую опасность представляют собой метициллинрезистентные штаммы S. aureus (meticillin-resistant S. aureus, MRSA), устойчивые к бета-лактамам (благодаря наличию лактамаз) и к ряду других антибиотиков (Green et al., 2012). Ситуация значительно усугубляется, если S. aureus формирует биопленки в очагах инфекций. В составе биопленок микроорганизмы становятся еще более устойчивыми к антимикробным веществам, и борьба с биопленочными инфекциями является одной из наиболее острых в клинической практике (Sauer et al., 2022).

K. shroeteri является частью нормальной микробиоты кожи человека, и в целом не представляет такой опасности для здоровья человека, как золотистый стафилококк. Тем не менее зарегистрировано достаточное количество клинических случаев эндокардита после имплантации искусственного клапана или шунта в сердце (Aepinus et al., 2008; Yousri et al., 2010; Schaumburg et al., 2013). Также сообщалось, что K. shroeteri обладает устойчивостью к пенициллину G, оксациллину, эритромицину (Becker et al., 2002). Способность данных микроорганизмов образовывать биопленки, а также полученные ранее результаты о межвидовых взаимодействиях в составе биопленки (Дювенжи и соавт., 2022) делают их интересным объектом для изучения устойчивости бактериальных биопленочных сообществ к антибиотикам.

Около 80% всех хронических заболеваний вызываются биопленками патогенных микроорганизмов (Sharma et al., 2019). Микробные клетки в биопленках обладают в 10‒1000 раз большей устойчивостью к антимикробным веществам, чем в составе жидких суспензионных (планктонных) культур (Mah, 2012). В биопленочных сообществах устойчивость к антибиотикам возникает благодаря различным факторам, таким как измененный фенотип и метаболизм клеток, медленное или неполное проникновение антибиотиков в биопленку из-за барьерной функции внеклеточного полимерного матрикса (физической или химической), наличию клеток-персистеров и др. (Плакунов и соавт., 2010; Lewis, 2010). Также устойчивость биопленок к биоцидам может быть следствием совокупных защитных свойств микроорганизмов в составе многовидовых биопленок, когда более устойчивые виды защищают от биоцида менее устойчивые (Плакунов и соавт., 2019). Все вышеперечисленное затрудняет лечение инфекций при помощи классической химиотерапии антибиотиками. Кроме того, серьезными проблемами являются неправильное употребление антибиотиков и недостаточный контроль за их оборотом, вследствие чего лекарственные вещества попадают в организм зачастую в недостаточной концентрации. Кроме того, антибиотики часто попадают в окружающую среду (Chow et al., 2021). Известно, что антибиотики в субингибиторных концентрациях способствуют не только развитию устойчивости у микроорганизмов (Chow et al., 2021), но могут стимулировать рост биопленок и повышать их вирулентность (Ranieri et al., 2018). Следовательно, помимо контроля за употреблением антибиотиков, а также для преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов и для купирования возможных негативных эффектов неправильного применения антибиотиков необходимы новые подходы и стратегии лечения. Одним из перспективных подходов к решению данной проблемы является комбинированная терапия – применение антибиотиков в сочетании с другими активными соединениями, усиливающими (или дополняющими) их действие. Такими соединениями могут быть гормоны человека.

Микробная эндокринология (Lyte, 2013) ‒ относительно новое междисциплинарное направление исследований, изучающее взаимосвязи организма человека и его микробиоты на уровне сигнальных молекул – факторов гуморальной регуляции. Разрозненные, но достаточно многочисленные данные, накопленные к настоящему времени, позволяют утверждать универсальность явления регуляции моновидовых биопленок и микробных сообществ гормонами человека. Такиe данные получены для стероидов (Hosoda et al., 2011; Clabaut et al., 2021), натрийуретических пептидов (Veron et al., 2007; Louis et al., 2022), нейропептидов (N’diaye et al., 2016) и катехоламинов (Cambronel et al., 2019). Последние являются наиболее изученным классом гормонов с точки зрения микробной эндокринологии. Говоря об объектах настоящего исследования, стоит отметить, что ранее было показано дозозависимое ингибирующее действие на биопленки K. shroeteri ‒ наибольшее подавление роста наблюдалось при более высоких концентрациях гормона относительно нормального уровня в плазме крови (Данилова и соавт., 2021).

На основе этих данных, а также с учетом актуальности темы комбинированной терапии, целью данной работы было исследование модулирующего действия норадреналина на активность широко используемого полусинтетического макролидного антибиотика – азитромицина – в отношении моновидовых и мультивидовых биопленок K. shroeteri и S. aureus. Учитывая вышеизложенные факты, действие азитромицина на микроорганизмы исследовали в субингибиторных концентрациях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы и их культивирование. В работе использовали штаммы бактерий S. aureus 209Р и K. schroeteri H01, полученные из коллекции лаборатории выживаемости микроорганизмов ФИЦ Биотехнологии РАН. Культивирование производили аэробно на обогащенной клостридиальной среде (reinforced clostridial medium, RCM) (Данилова и соавт., 2021). Для получения моновидовых культур и биопленок ОП₅₄₀ суспензий доводили до 0.5 ед. физиологическим раствором (0.9% NaCl) (“Диа-М”, Москва, Россия) в дистиллированной воде. Для получения бинарных культур и биопленок ОП₅₄₀ обеих бактериальных суспензий доводили до 1.0 ед., затем суспензии смешивали в соотношении 1 : 1.

Активные соединения. В работе использовали азитромицин в форме препарата Сумамед (“Teva”, Хорватия). Исходный раствор азитромицина готовили в 96% этаноле и хранили при температуре ‒20°С. Для получения требуемых тестовых концентраций исходный раствор азитромицина (50 мг/мл) разбавляли стерильной средой RCM до необходимой концентрации – 0.001 и 4 мк г/мл. Норадреналин (“Merck”, Германия) разводили в стерильной воде MilliQ до концентрации 3.55 ммоль (MQ) и хранили при температуре ‒20°С. Перед экспериментом проводили серию разведений в стерильной MQ-воде в зависимости от необходимой концентрации. В работе использовали концентрацию 3.55 мкмоль согласно результатам предыдущего исследования (Данилова и соавт., 2021).

Выращивание моновидовых культур и биопленок на тефлоновых кубиках. Биопленки и планктонные культуры получали, как описано ранее (Дювенжи и соавт., 2022). Микроорганизмы выращивали на среде RCM. Комбинации норадреналина и азитромицина в подобранных ранее концентрациях (Дювенжи и соавт., 2022) исследовали в сравнении с контрольными образцами и с образцами с добавлением действующих веществ. Культивирование производили в течение 24, 48 и 72 ч аэробно.

Выращивание биопленок на стекловолоконных фильтрах. Стекловолоконные фильтры марки Whatman GF/F (“Merck”, Германия) диаметром 21 мм использовали в двух разных модельных системах, как описано ранее (Дювенжи и соавт., 2022). В первой модельной системе биопленки выращивали на фильтрах в жидкой среде RCM с добавлением активных веществ (стадия обратимой адгезии не редуцирована во времени). Во второй модельной системе фильтры помещали на поверхность агаризованной среды RCM (редуцирована во времени стадия обратимой адгезии). Культивирование производили в течение 24, 48 и 72 ч в аэробных условиях.

По истечении срока инкубации один фильтр с биопленкой использовали для определения метаболической активности клеток, второй – для определения количества колониеобразующих единиц и анализа агрегации клеток.

Определение метаболической активности клеток. Метаболическую активность клеток в составе биопленок определяли косвенно методом окрашивания 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), как описано ранее (Плакунов и соавт., 2016). МТТ, восстанавливаясь за счет переносчиков электронов ЭТЦ в клетках, превращается в нерастворимое окрашенное в синий цвет вещество – формазан. Формазан экстрагировали диметилсульфоксидом и измеряли оптическую плотность экстрактов при λ = 540 нм.

Определение числа КОЕ. Диспергирование биопленок проводили методом, описанным ранее (Ovcharova et al., 2021). Чашки с агаризованной средой RCM, на которых рассевали суспензии, инкубировали 48 ч при 37°С для более быстрого роста колоний, после чего производили подсчет КОЕ и расчет количества клеток в биопленке на фильтре.

Оценка агрегации клеток. Оценку агрегации клеток в составе биопленок проводили с помощью световой микроскопии фиксированных образцов суспендированных биопленок на фильтрах, как описано ранее (Ovcharova et al., 2021). Рассчитывали размер агрегатов и процентное соотношение числа агрегатов и одиночных клеток.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) биопленок, выращенных в жидкой среде в планшетах со стеклянным дном. Биопленки исследуемых микроорганизмов выращивали в 24-луночных планшетах (“Eppendorf”, Германия) с плоским стеклянным дном, как описано ранее (Coenye et al., 2007; Diuvenji et al., 2023) в течение 24 и 48 ч. Для S. aureus использовали зонд 5'-GAA-GCA-AGC-TTC-TCG-TCC-G-3' (“Синтол”, Москва, Россия), меченый родамином R6G для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Все образцы дополнительно окрашивали SYTO9 Green (“Thermo”, США) в течение 15 мин. Затем аккуратно отмывали от красителя с помощью физраствора и покрывали фиксирующей жидкостью ProLong^TM Gold Antifade mountant (“ThermoFisher”, США). Анализ образцов и получение 3D-изображений проводили с использованием микроскопа Nikon TE2000-U (“Nikon”, Токио, Япония) с иммерсионным масляным объективом Nikon 100× 1.3NA S Fluo и сканирующей конфокальной системой Becker&Hickl DCS-120 для получения изображений. Полученные файлы OME-TIFF анализировали с использованием плагина Comstat2 (“TDU”, Копенгаген, Дания) (Heydorn et al., 2000) в программном пакете ImageJ (NIH, Bethesda, Мэриленд, США). Определяли среднюю плотность биомассы на единицу площади (мкм³ /мкм²). Трехмерные изображения получали из z-стеков OME-TIFF с использованием плагина Volume Viewer 2.0 в ImageJ.

Количественная ПЦР. Анализ генов устойчивости к антибиотикам у K. schroeteri и S. aureus проводили с помощью алгоритма CARD (The comprehensive antibiotic resistance database). Праймеры для ПЦР подбирались с помощью инструмента primer-BLAST NCBI (NIH, США) (таблица; дополнительные материалы). Все праймеры проверяли на возможность формирования вторичных структур в виде шпилек в программе Oligo (“Molecular Biology Insights”, США). Выделение РНК, проверку праймеров и количественную ПЦР проводили по стандартным протоколам, описанным ранее (Diuvenji et al., 2023).

Статистическая обработка. Эксперименты проводили минимум в трех независимых повторах. Данные обрабатывали с помощью программного пакета GraphPad Prism 8.3.0. На графиках отмечали медианные значения с разбросом от максимального к минимальному либо среднее с разбросом, равным стандартной ошибке среднего в зависимости от необходимости. Для определения значимости различий использовали множественный t-критерий в программе GraphPad.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние комбинаций азитромицина и норадреналина на моновидовые планктонные культуры и биопленки на тефлоновых кубиках

В работе использовали субингибиторные концентрации азитромицина 0.001 и 4 мкг/мл, подобранн ые ранее (Diuvenji et al., 2023). Было обнаружено, что влияние комбинаций норадреналина и азитромицина на рост планктонных культур и биопленок зависел от времени культивирования и концентрации антибиотика. Было показано, что добавление норадреналина в среду с 4 мкг/мл азитромицина усиливало ингибирующее действие азитромицина на планктонные культуры K. schroeteri. Условная оптическая плотность (ОП) суспензии планктонных клеток снижалась, ее относительный показатель составлял 22.8% от контроля, в то время как при действии одного антибиотика он составлял 77.9% (рис. 1а). Добавление норадреналина к антибиотику также усиливало его ингибирующее действие в отношении биопленок после 48 ч инкубации (рис. 1б), однако статистически значимым этот эффект не был.

 

Рис. 1. Влияние комбинации азитромицина и норадреналина на рост планктонных культур (а) и биопленок (б) K. Schroeteri : 1 – контроль; 2 – азитромицин 0.001 мкг/мл; 3 – азитромицин 4 мкг/мл; 4 – сочетание норадреналина 3.55 мкМ и азитромицина 0.001 мкг/мл; 5 – сочетание норадреналина 3.55 мкМ и азитромицина 4 мкг/мл. ** – различие достоверно при р < 0.01.

 

На моновидовые планктонные культуры S. аureus азитромицин в концентрации 4 мкг/мл в среде также оказывал ингибиторный эффект (рис. 2а), показатель плотности биомассы суспензии не превышал 11% (после 48 ч инкубации). В концентрации 0.001 мкг/мл азитромицин не оказывал значимого эффекта, однако при добавлении норадреналина к антибиотику после 48 ч инкубации появлялся ингибирующий эффект – показатель ОП планктонных культур понижался на 11% – до 89% от ОП контроля.

 

Рис. 2. Влияние комбинации азитромицина и норадреналина на рост планктонных культур (а) и биопленок (б) S. aureus : 1 – контроль; 2 – азитромицин 0.001 мкг/мл; 3 – азитромицин 4 мкг/мл; 4 – сочетание норадреналина 3.55 мкМ и азитромицина 0.001 мкг/мл; 5 – сочетание норадреналина 3.55 мкМ и азитромицина 4 мкг/мл. * – различие достоверно при p < 0.05; ** – различие достоверно при р < 0.01; *** – различие достоверно при p < 0.005.

 

Интересно, что норадреналин значимо ослаблял подавляющее действие 4 мкг/мл азитромицина в среде после 48 ч инкубации: при сочетании активных веществ показатель ОП суспензии планктонных клеток составлял 79% относительно ОП контроля (в присутствии одного антибиотика – всего 11% от ОП контроля). Подобного эффекта не наблюдали после 24 и 72 ч инкубации. Если говорить о биопленках S. aureus, стоит отметить, что гормон значимо усиливал действие азитромицина в концентрации 0.001 мкг/мл (рис. 2б): показатель ОП экстрактов КФ из образцов с сочетанием активных веществ составлял 60.5% от ОП экстрактов из контроля, тогда как в присутствии одного антибиотика – 93%. В отношении биопленок также наблюдали тенденцию к ослаблению ингибирующего действия 4 мкг/мл азитромицина в присутствии норадреналина, однако данное различие не было статистически значимым.

Таким образом, добавление в среду норадреналина может модулировать действие азитромицина на планктонные культуры и моновидовые биопленки K. schroeteri и S. aureus. Показано, что этот эффект зависит от времени культивирования (наибольшие эффекты при 48 ч) и концентрации антибиотика (при концентрации азитромицина 0.001 мкг/мл норадреналин усиливал ингибирующее действие, в то время как при концентрации 4 мкг/мл – ослаблял).

Определение числа КОЕ в моновидовых и бинарных биопленках

В данных экспериментах подсчитывали количество КОЕ в биопленке на фильтре. Дополнительно исследовали количество КОЕ в присутствии норадреналина через 48 ч инкубации.

Биопленки на плотной среде (система с редуцированной во времени стадией первичной адгезии). Количество КОЕ в моновидовых биопленках K. schroeteri, выращенных на агаризованной среде RCM, через 24 ч составило 1.13 × 10⁸ (дополнительные материалы, рис. S1А). В присутствии азитромицина в концентрации 4 мкг/мл число КОЕ снижалось до 5.7 × 10 ⁶. Добавление норадреналина к антибиотику в концентрации 4 мкг/мл снижало число КОЕ еще сильнее ‒ до 2.75 × 10⁵. Через 48 ч инкубации добавление гормона вместе с антибиотиком в среду вело к ослаблению ингибирующего действия азитромицина в концентрации 4 мкг/мл: число КОЕ составляло 6.5 × 10⁷ против 2 × 10⁶ в образцах с одним антибиотиком (рис. S1А). Через 72 ч инкубации значимый эффект наблюдали только в образцах с норадреналином в сочетании с 0.001 мкг/мл азитромицина. Сочетание веществ оказывало стимулирующее действие на моновидовые биопленки китококков. Число КОЕ увеличивалось в данном случае до 1.7 × 10⁹ против 1 × 10⁹ в контроле и 8 × 10⁸ в образцах с антибиотиком (рис. S1А).

В случае S. aureus, выращенных на агаризованной среде, азитромицин в концентрации 4 мкг/мл оказывал сильное ингибирующее действие на биопленки, особенно выраженное после 72 ч инкубации. В свою очередь, добавление норадреналина не приводило к сколь-либо значимому изменению числа КОЕ.

В бинарном сообществе, ввиду особенностей роста K. schroeteri, определяли только КОЕ S. aureus. Как и в случае с моновидовыми биопленками, азитромицин в концентрации 4 мкг/мл понижал число КОЕ S. aureus в бинарных сообществах (рис. S1Д). Однако после 48 и 72 ч инкубации (рис. S1Д) сочетания гормона и антибиотика приводили к ослаблению ингибирующего эффекта азитромицина. Влияние норадреналина и азитромицина в концентрации 0.001 мкг/мл, напротив, оказывало стимулирующее действие на биопленки, и число КОЕ увеличивалось до 1.14 × 10¹⁰ против 5.25 × 10⁹ в контроле и 4.07 × 10⁹ в образцах с одним антибиотиком.

Через 72 ч инкубации норадреналин снимал ингибирующее действие азитромицина в концентрации 4 мкг/мл и даже оказывал стимулирующее действие: число КОЕ увеличивалось до 5.15 × 10⁹ против 3.15 × 10⁹ в контроле и 3.25 × 10⁷ в образцах с 4 мкг/мл азитромицина в среде.

Таким образом, в зависимости от времени культивирования норадреналин в данной системе ослаблял подавляющее действие азитромицина, максимальное проявление данного эффекта наблюдалось в бинарных биопленках.

Биопленки в жидкой среде (система с полной стадией первичной адгезии). Количество КОЕ в моновидовых биопленках K. schroeteri, выращенной в жидкой среде RCM, через 24 ч инкубации составляло 9.3 × 10⁵ (рис. S1Б). Азитромицин в концентрации 4 мкг/мл оказывал ингибирующее действие на рост биопленок, и число КОЕ снижалось до 3.4 × 10⁵ (рис. S1Б). Добавление норадреналина приводило к усилению ингибирующего действия антибиотика и снижению числа КОЕ до 2.1 × 10⁴.

Азитромицин в концентрации 0.001 мкг/мл также оказывал ингибирующее действие на биопленку K. schroeteri, и показатели КОЕ снижались до 3.8 × 10⁴ против 2 × 10⁶ в контроле через 48 ч инкубации. Однако добавление норадреналина, напротив, вызывало стимулирующее действие, и число КОЕ возрастало до 6.7 × 10⁸ по сравнению с 4.4 × 10⁸ в образце с одним антибиотиком.

В моновидовых биопленках S. aureus азитромицин в концентрации 0.001 мкг/мл (рис. S1Г) оказывал ингибирующее действие, и добавление гормона через 24 ч ослабляло этот эффект. Число КОЕ в присутствии норадреналина увеличивалось до 7.9 × 10⁸ против 5.3 × 10⁸ в образце с одним антибиотиком. На вторые сутки инкубации наблюдали такой же эффект. Число КОЕ увеличивалось до 1.4 × 10^8, в то время как в образце с одним антибиотиком число КОЕ составляло 4.4 × 10^7, а в контроле ‒ 1.6 × 10⁸ КОЕ на биопленку.

В бинарном сообществе K. schroeteri и S. aureus через 24 ч инкубации норадреналин снимал стимулирующее действие азитромицина в концентрации 0.001 мкг/мл (дополнительные материалы, рис. S1Е). Число КОЕ при сочетании гормона и азитромицина снижалось до 6.3 × 10⁸, когда в присутствии только антибиотика оно составляло 8.5 × 10⁸. На третьи сутки инкубации гормон также снимал стимулирующий эффект азитромицина в концентрации 0.001 мкг/мл и даже понижал число КОЕ в бинарной биопленке. При добавлении норадреналина показатели снижались до 1.2 × 10⁸ против 3.6 × 10⁸ в контроле и 8.4 × 10⁸ в контроле с антибиотиком.

Таким образом, норадреналин модулировал влияние азитромицина на число КОЕ в моновидовых и бинарных биопленках. Однако данный эффект зависел от системы культивирования и времени инкубации. Так, в биопленках K. schroeteri, культивируемых на плотной среде, норадреналин на ранних стадиях роста усиливал ингибирующее действие азитромицина, тогда как после 48 и 72 ч инкубации добавление гормона ослабляло ингибирующий эффект антибиотика. В моновидовых биопленках S. aureus, культивируемых на плотной среде, эффекта от добавления гормона не наблюдали, тогда как в бинарных биопленках число КОЕ на поздних стадиях роста увеличивалось. В жидкой среде, напротив, и в моновидовых, и в бинарных биопленках добавление гормона усиливало ингибирующее действие азитромицина. Вероятно, характер адгезии, а также сосуществование двух организмов в одной биопленке влияет на механизм модулирующего действия норадреналина в отношении азитромицина в субингибиторных концентрациях, что подтверждает данные предыдущих исследований (Дювенжи и соавт., 2022; Diuvenji et al., 2023).

Исследование метаболической активности моновидовых и бинарных биопленок

Статистически значимого влияния активных соединений на метаболическую активность моновидовых и бинарных биопленок не наблюдалось (рис. S2). Исключение составляли биопленки стафилококков, метаболическая активность которых подавлялась в присутствии 4 мкг/мл азитромицина (рис. S2В).

Исследование агрегации клеток в биопленках

Подсчет КОЕ при изучении биопленок может не всегда давать точные результаты. Даже после диспергирования в суспензии может оставаться некоторое количество агрегатов, которые будут искажать данные, т.к. количество клеток в агрегате методом подсчета КОЕ учесть невозможно. Поэтому результаты, полученные методом подсчета КОЕ, следует уточнять методами анализа агрегации, например, при помощи световой микроскопии.

Исследование агрегации клеток в биопленках, выращенных на плотной среде. Агрегаты клеток в моновидовых биопленках K. schroeteri, выращенных на поверхности плотной среды, были самыми крупными среди трех типов биопленок (рис. S3). В процессе культивирования по мере созревания биопленок размеры агрегатов китококков увеличивались и составляли в контрольных образцах около 30 клеток на агрегат через 72 ч инкубации (после 24 и 48 ч – 14 и 18 клеток соответственно; рис. S3А, S3В, S3Д). Действие азитромицина приводило к снижению размера агрегатов клеток в биопленках китококков, причем сильнее всего – в 72-часовых биопленках (рис. S3Д). Добавление норадреналина ослабляло действие азитромицина, причем этот эффект был заметен уже после 24 и 72 ч инкубации. В зрелых бинарных биопленках (рис. S3Д) сочетание 0.001 мкг/мл азитромицина и норадреналина приводило не только к снятию ингибирования, но даже к увеличению размеров агрегатов с 19 до 47 клеток.

Следует отметить, что степень агрегации в моновидовых биопленках K. schroeteri была выше, чем в других исследованных биопленках. Максимальное количество агрегатов обнаружено через 24 ч инкубации и составляло 71% от совокупного количества агрегатов и одиночных клеток, наблюдавшихся в поле зрения (рис. S3Б), тогда как через 72 ч инкубации число агрегатов снижалось до 63% (рис. S3Е). В моновидовых биопленках S. aureus относительное количество агрегатов было максимальным через 48 ч и составляло 56% (рис. S3Г).

Азитромицин в концентрации 4 мкг/мл снижал агрегацию клеток в биопленках, однако добавление в среду норадреналина, как правило, снимало данный эффект антибиотика. Похожее действие норадреналин в сочетании с 0.001 мкг/мл азитромицина в биопленках K. schroeteri оказывал через 72 ч инкубации и в бинарных сообществах через 48 ч инкубации (рис. S3Б, S3Е). В бинарном сообществе антибиотик в концентрации 4 мкг/мл увеличивал долю агрегатов во всех временных точках, и добавление в среду гормона не оказывало значимого эффекта (рис. S3Е).

Исследование агрегации клеток в биопленках, выращенных в жидкой среде. В биопленках, выращенных в жидкой среде RCM, в целом повторялись закономерности, наблюдавшиеся в биопленках на плотной среде (рис. S4). При этом размер агрегатов был значительно меньше. Максимальный размер агрегатов в моновидовых биопленках K. schroeteri наблюдался через 48 ч инкубации и составлял в среднем около 7 клеток на агрегат (рис. S4А). В случае S. aureus максимальный размер агрегатов приходился на первые сутки и составлял 3.3 клетки, тогда как через 48 и 72 ч наблюдался их частичный или полный распад (рис. S4В). Доля агрегатов в моновидовых биопленках S. aureus в присутствии 0.001 мкг/мл азитромицина в сочетании с норадреналином уменьшалась через 24 ч инкубации, и их количество составляло 24% против 38% в образцах без норадреналина (рис. S4Б). Однако через 72 ч инкубации наблюдали обратный эффект, и относительное количество агрегатов увеличивалась до 25% против 16% (рис. S4Е).

В бинарных сообществах в жидкой среде азитромицин (в обеих концентрациях), как и в предыдущем опыте, увеличивал размер агрегатов, особенно в концентрации 4 мкг/мл (минимум в два раза). Влияния норадреналина после 24 и 48 ч инкубации обнаружено не было. Только через 72 ч наблюдали некоторый модулирующий эффект норадреналина: если 0.001 мкг/мл азитромицина в среде приводило к увеличению размера агрегатов с 2.6 до 3.7 клеток, то добавление гормона снимало этот эффект (рис. S4Е). Сочетание гормона с антибиотиком в концентрации 4 мкг/мл, напротив, увеличивало размер агрегатов клеток (типовые фото всех образцов представлены на рис. S5‒S10).

Таким образом, действие активных соединений на моновидовые и бинарные биопленки, выращенные в различных системах, различалось при сравнении числа КОЕ и степени агрегации клеток. Так, в системе с редуцированной во времени стадией обратимой адгезии (на плотной среде) добавление норадреналина к азитромицину, как правило, приводило к усилению роста клеточной биомассы и степени агрегации клеток. Напротив, в системе, где биопленка формировалась с обратимой стадией первичной адгезии (в жидкой среде) добавление гормона, как правило, снижало рост биомассы, что выражалось в меньшем числе КОЕ и в меньшем или не изменившемся размере агрегатов (таблица). Вероятно, характер адгезии при формировании биопленки влияет на действие как антибиотика, так и гормона.

 

Таблица. Эффект от добавления 3.55 мкМ норадреналина в среду, содержащую азитромицин в концентрациях 0.001 мкг/мл или 4 мкг/мл, на рост и агрегацию клеток в моновидовых и бинарных биопленках K. schroeteri и S. aureus

Биопленка	Время, ч	Концентрация азитромицина, мкг/мл	Эффект от добавления 3.55 мкМ норадреналина на действие азитромицина
			На плотной среде		На жидкой среде
			КОЕ	Агрегация (размер и доля)	ОП планктонных культур/ экстрактов КФ	КОЕ	Агрегация (размер и доля)	КЛСМ (плотность биомассы биопленок, мкм3 /мкм2)
K. schroeteri	24	0.001	Н/Э	О/И	С	Н/Э	О/С	Н/Э
		4	У/И	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Э
	48	0.001	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Э	О/И	Н/Э
		4	О/И	Н/Э	У/И	Н/Э	У/И	У/И
	72	0.001	С	С	Н/Э	Н/Э	О/И	Н/Д
		4	Н/Э	О/И размера, И доли	Н/Э	У/И	У/И	Н/Д
S. aureus	24	0.001	Н/Э	С	Н/Э	Н/Э	Н/Э	С
		4	Н/Э	О/И размера, С доли	Н/Э	Н/Э	Н/Э	У/И
	48	0.001	Н/Э	У/И размера, С доли	И	У/И	Н/Э	Н/Э
		4	Н/Э	Н/Э	О/И	Н/Э	Н/Э	У/И
	72	0.001	Н/Э	У/И размера, С доли	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Д
		4	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Э	Н/Д
Бинарное сообщество	24	0.001	Н/Э	С	Н/Д	Н/Э	Н/Э	Н/Э
		4	Н/Э	С	Н/Д	Н/Э	Н/Э	Н/Э
	48	0.001	У/С	О/С	Н/Д	У/И	Н/Э	Н/Э
		4	Н/Э	Н/Э	Н/Д	Н/Э	Н/Э	У/И
	72	0.001	Н/Э	У/С	Н/Д	Н/Э	О/С	Н/Д
		4	У/С	У/С	Н/Д	Н/Э	Н/Э	Н/Д

Условные обозначения: И – ингибирование, О/И – ослабление ингибирования, У/И – усиление ингибирования, С – стимуляция, О/С – ослабление стимуляции, У/С – усиление стимуляции, Н/Э – нет эффекта, Н/Д – нет данных

 

КЛСМ биопленок, выращенных в жидкой среде в планшетах со стеклянным дном

Для уточнения количественного соотношения клеточной биомассы K. schroeteri и S. aureus в бинарной биопленке использовали метод КЛСМ. Исследование проводили, рассчитывая параметр плотности биомассы биопленок каждого микроорганизма (отношение объем детектируемой биомассы в поле зрения к площади поля зрения).

Поскольку моновидовые биопленки S. aureus и бинарные сообщества окрашивались зеленым красителем SYTO9 и красным красителем R6G, вначале рассчитывали коэффициент, представляющий отношение сигнала от S. aureus, окрашенного SYTO9, к сигналу от S. aureus, окрашенного R6G в моновидовых биопленках. Данный коэффициент использовали для расчетов долей биомассы стафилококка и китококка в бинарных сообществах (Diuvenji et al., 2023, трехмерная визуализация биопленок представлена на рис. S12‒S17).

Структуру и показатель плотности биомассы (рассчитанного по детектируемому сигналу объема биомассы на единицу площади поля зрения) моновидовых и бинарных биопленок K. schroeteri и S. aureus в присутствии активных соединений исследовали с помощью анализа трехмерных изображений, полученных в ходе КЛСМ.

Через 24 ч инкубации плотность биомассы моновидовых биопленок K. schroeteri (рис. S11А, S12А, S12Б) и бинарных сообществ (рис. S11А, S14З) значимо не изменялась ни в присутствии азитромицина (4 мкг/мл, здесь и далее), ни в присутствии комбинации антибиотика и норадреналина. В то же время в моновидовых биопленках S. aureus, окрашенных SYTO9, плотность биомассы снижалась в присутстии азитромицина, но при добавлении норадреналина ‒ увеличивалась до 3.03 мкм³ /мкм² против 0.07 мкм³ /мкм² в образцах с одним антибиотиком (рис. S11А, S12В).

В 24-часовых моновидовых биопленках S. aureus (рис. S11В), окрашенных зондом с R6G, а также в бинарном сообществе (рис. S11Д) практически ни один из изученных эффектов от действия активных соединений не был статистически значимым.

Через 48 ч инкубации норадреналин усиливал ингибирующее действие азитромицина на моновидовые биопленки K. schroeteri, и плотность биомассы уменьшалась до 1.67 мкм³ /мкм² против 2.37 мкм³ /мкм² в образцах только с одним антибиотиком (рис. S11Б, S15). На моновидовые биопленки S. aureus норадреналин оказывал аналогичное действие. По результатам окраски SYTO9 (рис. S11Б, S16) и R6G (рис. S11Г, S16) плотность биомассы биопленок S. aureus в присутствии азитромицина снижалась с 3.6 мкм³ /мкм² в контроле до 0.7 мкм³ /мкм². Добавление норадреналина приводило к еще большему усилению ингибиторного действия антибиотика, и плотность биомассы снижалась еще сильнее ‒ до 0.27 мкм³ /мкм². В бинарном сообществе в присутствии азитромицина и норадреналина доля стафилококка также уменьшалась (рис. S11Е, S17).

Таким образом, установлено, что в зависимости от времени инкубации норадреналин оказывал двойственный эффект на биопленки. Если после 24 ч инкубации гормон нивелировал ингибирующее действие антибиотика (что заметно, в первую очередь, в случае S. aureus), то после 48 ч инкубации добавление норадреналина ингибирующее действие антибиотика усиливало.

Более выраженные эффекты после 48 ч инкубации могут быть в том числе следствием процессов, происходящих в более зрелых биопленках, ведущих к ускорению распада биопленок. В итоге, подтверждено, что в системе, где стадия обратимой адгезии не редуцирована, норадреналин усиливает ингибирующее действие азитромицина биопленок изученных микроорганизмов. Результаты систематизированы в таблице.

Исследование экспрессии генов

Чтобы понять, какие молекулярные механизмы лежат в основе реакций, вызванных норадреналином и антибиотиком, была исследована дифференциальная экспрессия генов с помощью метода количественной ПЦР (табл. S1‒S2). Полученные результаты в моновидовых биопленках K. schroeteri показали, что азитромицин в концентрации 0.001 мкг/мл в комбинации с норадреналином снижал э кспрессию гена fomB, отвечающего за инактивацию антибиотика, в то же время экспрессия генов novA, mrx, mdtK увеличивалась. Наибольшие изменения наблюдались с геном arlR, отвечающим за синтез выкачивающих помп, обуславливающих отток антибиотика из клетки. В присутствии норадреналина увеличивалась также экспрессия гена tetA, ответственного за устойчивость к тетрациклинам.

Полученные данные показывают, что азитромицин способен влиять на экспрессию генов устойчивости и к другим антибиотикам. Снижение экспрессии генов также может быть следствием связывания азитромицина с бактериальной рибосомой и блокировкой синтеза белка, что в том числе приводит к замедленному росту. Азитромицин в комплексе с норадреналином снижал экспрессию генов, что было показано для генов устойчивости к фторхинолонам и антибиотикам группы фосфоновой кислоты.

Итак, полученные данные показали, что норадреналин способен модулировать действие азитромицина на биопленки K. schroeteri и S. aureus. При этом ключевым моментом, вероятно, являются процессы адгезии клеток и формирование биопленочного фенотипа у обоих изученных микроорганизмов, а также их бинарного сообщества. В случае быстро сформировавшихся биопленок добавление норадреналина к азитромицину чаще ослабляло его ингибиторное действие, а в некоторых случаях даже стимулировало рост. Тогда как в случае, когда клетки проходят полную стадию адгезии, норадреналин усиливает подавляющее действие азитромицина. При этом, на начальных этапах гормон ускоряет, по-видимому, деление клеток, что говорит о вовлеченности активных соединений в процессы распада зрелых биопленок.

Показано, что присутствие в бинарном сообществе одного микроорганизма (а именно K. schroeteri), способно модулировать активность азитромицина в отношении другого (S. aureus), как было показано при подсчете КОЕ стафилококков. Было также показано, что сочетание азитромицина и норадреналина может оказывать влияние на экспрессию генов устойчивости к антибиотикам.

Полученные результаты в ряде случаев могут отчасти объяснить, с одной стороны, низкую эффективность терапии антибиотиками, а с другой стороны, ‒ негативные эффекты от их неправильного применения. В связи с тем, что антибиотикорезистентность является одной из главных проблем в медицине, проведенное исследование поможет лучше понять механизмы взаимодействия микроорганизмов внутри биопленки, а также потенциальное влияние системы гуморальной регуляции организма человека на микробное сообщество и, возможно, в будущем позволит создать новые стратегии лечения бактериальных инфекций.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят А.Л. Мулюкина и В.В. Сорокина (ЦКП “Коллекция UNIQEM”) за предоставление жидкого азота. Авторы благодарят А.П. Савицкого (лаборатория физической биохимии ФИЦ Биотехнологии РАН) за предоставление доступа к конфокальной микроскопии. Исследование экспрессии генов методом ПЦР проводилось на базе ЦКП “Биоинженерия” ФИЦ Биотехнологии РАН.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 19-74-10071). Работа В.К. Плакунова выполнена частично за счет средств Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: https://doi.org/10.31857/S0026365624060058

About the authors

E. V. Diuvenji

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

I. D. Soloviev

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

M. V. Sukhacheva

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

E. D. Nevolina

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

M. A. Ovcharova

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

N. A. Loginova

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

A. M. Mosolova

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

S. V. Mart’yanov

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

V. K. Plakunov

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

A. V. Gannesen

FRC “Fundamentals of biotechnology” of RAS

Author for correspondence.
Email: andrei.gannesen@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

References

Supplementary files