Formation of biologically active compounds by Siberian Cordyceps militaris (L.) Fr. strains

Full Text

Cordyceps militaris ‒ энтомопатогенный гриб, который известен как один из древних лекарственных средств Тибета и Китая (Kontogiannatos et al., 2021; Cui, 2015). C. militaris паразитирует внутри личинок или куколок чешуекрылых насекомых и образует плодовые тела на насекомых-хозяевах (Olatunji et al., 2018). Грибы этого вида являются популярными нутрицевтиками, которые используются в кулинарии в виде экстрактов, ферментированного порошка и настоек (Jędrejko et al. 2022). В последнее время появились данные об использовании этого гриба в качестве кормовой добавки в животноводстве и птицеводстве (Chen et al., 2020). Поиск и изучение новых штаммов С. militaris представляет интерес из-за их биологически активных соединений, которые нашли применение в фармакологии (Jędrejko et al., 2021). Среди лечебных свойств C. militaris известна гипогликемическая, гиполипидемическая, противовоспалительная, противоопухолевая, антибактериальная, противогрибковая, противовирусная, противомалярийная, нейропротекторная, антиоксидантная и иммуномодулирующая активности (Zhang et al., 2019; Das et al., 2021). Из плодовых тел, мицелия и культуральной жидкости этих грибов были выделены различные биологические активные соединения: полисахариды, нуклеозиды (аденозин, кордицепин (3ꞌ-дезоксиаденозин), гуанозин), эргостерин, пептиды, статины и пр. (Das et al., 2021; Miao et al., 2022; Qu et al., 2022).

Полисахариды (ПС), накапливающиеся в культуральной жидкости, являются одними из основных водорастворимых биоактивных компонентов C. militaris (Miao et al., 2022). По сравнению с другими соединениями ПС C. militaris изучены недостаточно. Из-за различных условий выращивания и особенностей штаммов С. militaris моносахаридный состав и их молярные соотношения в ПС непостоянны, что усложняет установление их структуры (Yang et al., 2020). Экспериментальные данные показывают, что ПС Сordyceps spp. обладают широким спектром действия, включая противоопухолевую, противовирусную, иммуностимулирующую, гипохолестеринемическую, гипогликемическую и антиоксидантную активности (Liu et al., 2015).

Вид C. militaris широко распространен в Северной и Южной Америке, Европе и Азии. На территории РФ встречается часто в Приморском крае, реже в центральных и южных регионах Европейской части страны. В западной Сибири штаммы C. militaris были изолированы в Иркутской, Новосибирской областях, на юге Байкала (Огарков и соавт., 2012; Kryukov et al., 2018). Этот гриб обычно растет на куколках, реже на личинках или взрослых насекомых из отрядов Arachnida, Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Orthoptera, Diptera и Isoptera. Аскоматы C. militaris изменчивы по форме и размерам, что связано с типом доступного для роста грибов источника пищи, а также размером хозяина и количеством образовавшихся стром.

В природе грибы C. militaris растут медленно, их рост ограничен определенной территорией, а плодовые тела трудно обнаружить из-за небольших размеров (0.8‒7 см высотой и 2‒6 мм шириной в верхней части) (Евлахова, 1974). В Китае из-за чрезмерной эксплуатации под угрозой находятся ресурсы дикого C. militaris, поэтому широкое использование его в качестве лекарственного средства запрещено. Для преодоления этого ограничения были разработаны технологии крупномасштабного искусственного выращивания культур C. militaris в виде плодовых тел и мицелия (Shih et al., 2007; Jiapeng et al., 2014; Kang et al., 2014). Существующие возможности улучшения коммерческого выращивания C. militaris связаны с выбором подходящего штамма и оптимизацией питательной среды.

На территории Нижне-енисейского лесничества Красноярского края в 2017 г. из погибших гусениц сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetverikov, обнаруженных в подстилке и кроне Abies sibirica Ledeb., нами были выделены три новых изолята энтомопатогенных грибов.

Целью работы было определение таксономического положения изолятов; изучение и идентификация биологически активных соединений, продуцируемых штаммами, и установление оптимальных условий их образования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы и условия культивирования.Объектами исследования были три штамма C. militaris (L.) Fr. (1818) (Cordycipitaceae, Hypocreales, Hypocreomy cetidae, Sordariomycetes, Ascomycota, Fungi) 11-3, 11-4, 11-5 из коллекции чистых культур лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева ФИЦ КНЦ СО РАН (Красноярск, Россия). Штаммы были выделены в 2017 г. из гусениц D. sibiricus. После поверхностной стерилизации 75%-м этанолом с последующим промыванием стерильной водой и подсушиванием между двумя слоями стерильной фильтровальной бумаги гусениц раскладывали во влажные камеры, а также на поверхность 2% мальт-экстракт агара (МЭА) с 0.5% танина и среды Чапека. Посевы инкубировали 7 сут при 25°С. Из мицелия, выросшего непосредственно из тела насекомого, изолировали чистые культуры грибов. Морфологические особенности колоний изучали на МЭА, картофельно-сахарозном агаре (КСА) и среде SNA (глюкоза – 0.2 г, сахароза – 0.2 г, KNO₃ – 1.0 г, KH₂PO₄ – 1.0 г, MgSO₄ × 7H₂O г, KCl – 0.5 г, дистиллированная вода 1 л; Nirenberg, 1990) на 7 и 14 сут роста. Микроструктуры оценивали методами светлопольной микроскопии с использованием микроскопа Nikon Eslipse Ci (“Nicon”, Япония). Видовую идентификацию штаммов подтверждали молекулярно-генетическими методами – секвенированием участков генетических маркеров ITS и TEF 1-alpha с использованием оборудования ЦКП “Инновационные технологии защиты растений” Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (Санкт-Петербург‒Пушкин, РФ). Последовательность по ITS штамма 11-3 Siberia внесена в GenBank под номером SUB14449092 SH PP794588.

Штаммы выращивали в пробирках на скошенном глюкозо-картофельном агаре (ГКА) при 25°С и хранили при 4°С. Влияние температуры культивирования на скорость роста штаммов определяли в чашках Петри с ГКА при температурах 15, 25, 28 и 37°С. Оптимальную температуру выращивания оценивали по радиальной скорости роста колоний.

Влияние двух источников углерода на рост культур и биосинтез биологически активных соединений (БАС) изучали при глубинном или поверхностном культивировании штаммов С. militaris в двух средах, содержащих по 50 г/л глюкозы или сахарозы и 10 г/л триптона. Изучение влияния пяти разных источников азота на процесс роста и биосинтеза БАС было проведено при глубинном культивировании штамма С. militaris 11-5 в присутствии 50 г/л глюкозы. Среды содержали 10 г/л триптона (“Difco”, США), 10 г/л гидролизата казеина (“Difco”, США), 5 г/л глутамата, 6 г/л NaNO ₃ или 40 мл абиопептида (ООО “А-Био”, РФ). Концентрации других компонентов в средах составили (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт (“Difco”, США) – 9.0; KH₂PO₄ ‒ 1.0; MgSO₄ × 7H₂O – 0.9; KCl – 0.01; ZnSO₄ × 7H₂O – 0.01; FeSO₄ × 7H₂O – 0.01. Грибы выращивали в колбах (750 мл): глубинно в 200 мл среды на шейкере (220 об./мин) в течение 12 сут или в стационарных условиях с 400 мл среды в течение 35 сут. Температура культивирования составляла 24 ± 1°С. Среды засевали 5‒7-суточным мицелием, выращенным глубинно в 2%-ом мальт-экстракте (“Difco”, США).

Изучение накопления ПС и потребления углеводов в процессе роста C. militaris 11-5. Гриб выращивали в 5 л ферментере Minifors (“Infors HT”, Швейцария) с 3.5 л среды, содержащей 50.0 г/л сахарозы и 40 мл/л абиопептида. Концентрация других компонентов указанна выше. Ферментер засевали 5‒7 сут культурой, выращенной глубинно в колбах (750 мл) с 200 мл вышеописанной среды на шейкере (200 об./мин) при 24°С. Посевная доза инокулята составила 10 об. % (сухая масса мицелия 1.4 г/л). Силиконовый пеногаситель Silicone anti-foam M-30 (“Serva”, США) вносили в концентрации 0.1%. При культивировании гриба температуру в ферментере поддерживали на уровне 24 ± 1°С, а рН среды ‒ 5.0 ± 0.2 периодическим внесением 5%-го раствора NaOH. Отбор проб проводили два раза в сутки. В пробах определяли концентрацию биомассы, углеводов и внеклеточных ПС, также проводили микроскопирование культуры и контроль на присутствие посторонней микрофлоры.

Определение биомассы. Мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через бумажный фильтр (Белая лента, РФ) и навеску биомассы высушивали до постоянного веса при температуре 105°C.

Определение углеводов. Углеводы в среде определяли спектрофотометрически антроновым методом при λ 625 нм (Roe, 1955). Расчет содержания углеводов проводили по калибровочной кривой, построенной по глюкозе.

Идентификация нуклеозидов. Внутриклеточные нуклеозиды выделяли из мицелия, высушенного до постоянного веса при температуре 60°C, трехкратной экстракцией метанолом. Внеклеточные нуклеозиды выделяли из фильтрата культуральной жидкости трехкратной экстракцией хлороформом. Растворители удаляли в вакууме. Экстракты анализировали методом ТСХ на пластинках силикагеля 10 ×10 см (Silica gel 60 F_254, “Merck”, Германия) в системе этилацетат‒метанол‒вода (100 : 15 : 10) (Thuy et al., 2023). Соединения обнаруживали по поглощению в УФ-свете при 254 нм. Нуклеозиды выделяли препаративной ТСХ на пластинках силикагеля (Silica gel F_254, “Merck”, Германия) в системе растворителей. Идентификацию выделенных соединений осуществляли на основе сравнения данных УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии с литературными источниками. Подробную информацию о структуре соединений получали при анализе МС/МС спектров при энергии коллизии 20‒40 %. УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160А (“Shimadzu”, Япония). Масс-спектры соединений регистрировали на квадрупольном масс-спектрометре LCQ Advantage MAX (“Thermo Finnigan”, Германия), используя одноканальный шприцевой насос для прямого ввода образца в камеру для химической ионизации при атмосферном давлении.

Количественное определение нуклеозидов. К навеске биомассы (200 мг) добавляли 4 мл 50% этанола и выдерживали при температуре 60°C в течение 1 ч. Экстракты в пяти повторностях наносили на пластину силикагеля в объеме 5 мкл и хроматографировали в системе растворителей. В качестве стандарта использовали кордицепин (“Sigma”, США), который наносили на пластины в аналогичном объеме в нескольких концентрациях. Анализ хроматограмм осуществляли с последующим их сканированием в денситометре (“SORBFIL”, РФ). Концентрацию нуклеозидов в полученных экстрактах определяли с помощью программы Sorbfil TLC View.

Количественное определение внеклеточных и внутриклеточных полисахаридов.К 5 мл фильтрата культуральной жидкости добавляли 30 мл 96% этанола и выдерживали 12‒15 ч при 4°C. Полученный осадок отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об./мин. Осадок суспендировали в 0.3 N NaОН и выдерживали на водяной бане в течение 30 мин при температуре 60°C (Li et al., 2021). Общее количество сахаров в препарате ПС определяли по методу с фенол-серной кислотой (Dubois et al., 1956). Для этого к 1 мл раствора добавляли 0.5 мл 5% фенола и 2.5 мл Н₂SO₄ (конц.) и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Полученный раствор анализировали на спектрофотометре при 490 нм. Расчет вели, используя калибровочную кривую, построенную по раствору глюкозы в различных концентрациях.

Для определения внутриклеточных ПС к навеске биомассы (200 мг) добавляли 5 мл Н₂О (дист.) и выдерживали в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Раствор фильтровали через бумажный фильтр, осадок промывали. Фильтрат анализировали по методу, указанному выше.

Расчет основных характеристик роста и биосинтеза ПС (Перт, 1978):

Удельную скорость роста гриба (µ, ч-¹) рассчитывали по формуле: µ = ((lg x – lg x₀₎ / t) × 2.3;

Скорость потребления субстрата культурой (q_s, г/г·ч): q_s = (s – s₀₎ / x × t;

Удельную скорость образования продукта культурой (q_p, г/г·ч): q_p, = (p – p₀₎ / x × t;

Экономический коэффициент (Y_s): Y_s = x ‒ x₀ / s – s₀, где x₀ – концентрация биомассы в начальный момент времени; x – концентрация биомассы в конечный момент времени; s₀ – концентрация субстрата в начальный момент времени; s – концентрация субстрата в конечный момент времени; p₀ – концентрация продукта в начальный момент времени; p – концентрация продукта в конечный момент времени; t – время.

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием стандартных методов, обеспеченных программой Microsoft Office Excel 2013. Анализы биомассы, ПС проводили не менее трех раз, нуклеозидов ‒ не менее пяти раз. Их содержание представлено в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка. Доверительные интервалы не превышали ±5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфология штаммов С. militaris. Исследуемые штаммы, выделенные из гусениц Dendrolimus sibiricus (рис. 1а), характеризовались схожими морфологическими признаками. На МЭА культуры грибов формировали округлые выпуклые колонии светло-сливочного цвета порошистой структуры за счет обильного спороношения; при старении культур иногда появлялся экссудат светло-желтого цвета; реверс бледно-желтый или светло-коричневый (рис. 1б).

 

Рис. 1. Морфология колоний C. militaris 11-3: а ‒ мицелий гриба на гусенице Dendrolimus sibiricus; б ‒ колонии на МЭА; в ‒ колонии на КСА (7 сут); г ‒ колонии (слева) и реверс колонии (справа) при старении культуры на КСА (14 сут).

 

На КСА колонии более приземистые, пушистые, слегка припорошенные, мицелий белого цвета (рис. 1в), но при старении культуры появляется слабый сливочный оттенок. Реверс окрашен в различные оттенки желтого (рис. 1г). У штамма 11-3 реверс бледно-желтый, у 11-4 светло-коричневый, у 11-5 – ярко-желтый. Оптимальная температура роста штаммов C. militaris составила 25°С; при 28°С рост отсутствовал. Наибольшую скорость роста отмечена у штамма 11-5 C. militaris (2.5 мм/сут); скорость роста штаммов 11-3 и 11-4 была ниже на 30 и 12% соответственно.

Вегетативный мицелий анаморфной формы C. militaris представлен разветвленными, равномерно септированными гифами 1.5‒3 мкм в диаметре, которые в отдельных случаях формировали мицелиальные тяжи. Фиалиды расположены одиночно или пучками на разном уровне, бутылковидной формы с утолщением у основания, размером 10‒30 × 1.5‒2.3 мкм. Верхняя конидия эллиптическая или коротко цилиндрическая размером 3.2‒6.0 × 3.0 мкм, другие шаровидные диаметром 2.3‒3.0 мкм (рис. 2).

 

Рис. 2. Бесполое размножение штамма C. militaris 11-3 на среде SNA (7 сут).

 

По результатам молекулярно-генетических исследований с использованием праймеров ITS и TEF-1α штамм 11-3 был отнесен к виду C. militaris (рис.3).

 

Рис. 3. Филогенетиче ское дерево на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма 11-3 (Siberia) и последовательностей C. militaris из NCBI GenBank: а ‒ с использованием праймеров ITS (бутстреп-значения более 40% указаны рядом с кластерами); б ‒ с использованием праймеров TEF-1α (бутстреп-значения более 50% указаны рядом с кластерами). В качестве внешней группы использовали Metarhizium rileyi.

 

На филогенетическом дереве, построенном на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма 11-3 и последовательностей C. militaris из NCBI GenBank с использованием праймеров TEF-1α, штамм попадает в обособленную кладу (рис. 3б). На основании сравнения макро- и микроморфологических признаков все исследуемые штаммы были отнесены к виду C. militaris.

Идентификация нуклеозидов. Анализ экстрактов из биомассы трех штаммов показал наличие метаболита 1 с R_f 0.55 и метаболита 2 с R_f 0.63, при этом стандарт кордицепина имел R_f 0.60 (рис. 4).

 

Рис. 4. Хроматограмма экстрактов под УФ-светом (λ = 254 нм) из биомассы штаммов C. militaris : 1 ‒ 11-3; 2 ‒ 11-4; 3 ‒ 11-5; 4 ‒ стандарт кордицепина.

 

УФ-спектр метаболитов имел близкие значения максимальных полос поглощения: метаболит 1 при λ_max 211, 260 нм, метаболит 2 при λ_макс 209, 261 нм, а стандарт кордицепина λ_макс 211, 259 нм. Молекулярный ион метаболита 1 в положительных ионах имел массу 268 (M + H)⁺, при этом в МС/МС спектре преобладал фрагментный ион с m/z 136, соответствующий катиону аденина. Молекулярный ион стандарта кордицепина показал массу 252 (M + H)⁺, а МС/МС содержал аналогичный фрагментный ион с m/z 136. На основании этих полученных данных метаболит 1 был идентифицирован как аденозин. Метаболит 2 имел положительный молекулярный ион 282 (M + H)⁺, который также содержал ион с m/z 136, что соответствовало по литературным данным кордизинину В (2-метиладенозин) (Yang et al., 2011).

Аденозин является основным нуклеозидом, накапливаемым Cordyceps spp. Он выполняет важную роль в биохимических процессах в организме, таких как передача энергии (АТФ и АДФ) и сигналов в клетках. В ответ на стресс или ранение аденозин проявляет в основном цитопротекторное действие, защищая ткани от повреждения в случаях гипоксии, ишемии или судорог (Kitakaze, Hori, 2000; Nakav et al., 2008). Аденозин опосредует свои эффекты через активацию рецепторов, связанных с G-белком, а именно A ₁, A_2A, A_2B и A₃ (Gessi et al., 2014). В частности, в клетках кожи этот эндогенный нуклеозид, действуя на один или несколько рецепторов, может участвовать в защите и восстановлении поврежденной ткани. Кроме того, сообщается, что аденозин подавляет рост опухолевых клеток посредством активации различных внешних и внутренних сигнальных путей. В обоих путях аденозин активирует каспазы митохондриально-зависимым и/или независимым образом (Yang et al., 2007).

Кордизинин В впервые был выделен из мицелия C. sinensis (Yang et al., 2011). Как аденозин, так и кордизинин B показали индуцирующую CRE-опосредованную транскрипцию в клетках PC 12, что важно в лечении нарушения памяти при болезни Альцгеймера (Ohizumi et al., 2021). Это действие, по крайней мере частично, является результатом активации аденозиновых рецепторов А₁, А_2А и А_2В.

Известный для C. militaris кордицепин (3'-дезоксиаденозин) у изученных штаммов не был обнаружен. Кордицепин представляет собой соединение широкого спектра действия, обладающее противовоспалительной, болеутоляющей, противоопухолевой, антибактериальной, антивирусной и инсектицидной активностью (Liu et al., 2015). Известно, что биосинтез кордицепина начинается с аденозина и протекает последовательно путем фосфорилирования, дефосфорилирования и восстановления. В геноме продуцирующего кордицепин C. militaris было идентифицировано четыре гена кордицепинсинтетазы cns1-cns4. По данным разных авторов содержание кордицепина в мицелии у штаммов C. militaris может колебаться от следовых количеств до 8570 мг/л, а в плодовых телах от 0.6 до 77.4 мг/г (Kontogiannatos et al., 2021). Такую изменчивость в продукции кордицепина объясняют штаммовыми различиями. Геном штаммов C. militaris оказывает влияние как на способность образовывать плодовые тела, так и на способность к биосинтезу кордицепина (Kontogiannatos et al., 2021). Отсутствие биосинтеза кордицепина у исследованных штаммов может быть связано с неактивным состоянием генов кордицепинсинтетазы cns1-cns4.

Таким образом, изученные сибирские штаммы С. militaris являются продуцентами двух нуклеозидов – аденозина и кордизинина В. Следует отметить, что наличие у С. militaris кордизинина В, как одного из основных метаболитов, обнаружено впервые.

Влияние способа культивирования и различных источников углерода и азота на образование БАС штаммами С. militaris. В табл. 1 приведены показатели роста, биосинтеза ПС и нуклеозидов при глубинном и поверхностном культивировании сибирских штаммов C. militaris в средах с глюкозой или сахарозой.

 

Таблица 1. Показатели роста, биосинтеза ПС и нуклеозидов при глубинном и поверхностном выращивании штаммов C. militaris c разными углеводами

Показатели	Углевод	Культивирование штаммов
		11-3		11-4		11-5
		Глубинное	Поверхностное	Глубинное	Поверхностное	Глубинное	Поверхностное
Биомасса, г/л	Глюкоза	27.2 ± 1.5	13.9 ± 1.2	20.1 ±1.3	29.5 ± 1.8	20.3 ± 1.4	20.7 ± 1.5
	Сахароза	28.1 ± 1.2	13.3 ± 0.9	23.1 ±1.4	31.2 ± 1.5	27.5 ± 1.3	24.6 ± 1.4
Внеклеточные ПС, г/л	Глюкоза	4.8 ± 0.4	2.8 ± 0.3	3.7 ± 0.4	1.3 ± 0.2	4.6 ± 0.3	1.2 ± 0.1
	Сахароза	4.2 ± 0.8	2.8 ± 0.3	4.8 ± 0.7	1.8 ± 0.3	5.1 ± 1.2	1.1 ± 0.3
Внутриклеточные ПС, г / л	Глюкоза	0.9 ± 0.1	1.4 ± 0.2	0.5 ± 0.1	1.2 ± 0.2	0.7 ± 0.1	1.1 ± 0.3
	Сахароза	0. 8 ± 0.1	1.0 ± 02	0.4 ± 0.1	1. 2 ± 0.3	0. 9 ± 0.2	1.3 ± 0.2
Сумма полисахаридов, г/л	Глюкоза	5.7	4.2	4.2	2.5	5.4	2.3
	Сахароза	5.0	3.8	5.2	3.0	6.0	2.4
Аденозин, мг / л	Глюкоза	122 ± 12	35 ± 4	141 ± 11	162 ± 15	100 ±16	101 ± 14
	Сахароза	171 ± 13	33 ± 6	141 ± 17	209 ± 23	118 ± 15	165 ± 34
Кордизинин В, мг / л	Глюкоза	101 ± 9	29 ± 2	90 ± 10	180 ± 21	63 ± 12	122 ± 19
	Сахароза	138 ± 21	27 ± 2	60 ± 12	190 ± 15	83 ± 12	145 ± 23
Сумма нуклеозидов, мг/л	Глюкоза	223	64	231	342	163	223
	Сахароза	309	60	201	399	201	310

 

Можно видеть, что урожай биомассы на сахарозе был выше по сравнению с глюкозой, независимо от способа выращивания штаммов. Нуклеозиды (аденозин и кордизинин В) были идентифицированы только в мицелии. Их содержание было выше при росте на сахарозе по сравнению с глюкозой и в зависимости от штамма и способа выращивания колебалось от 60 до 399 мг/л. Во всех пробах соотношение аденозина к кордизинину В было примерно одинаково.

ПС образовывались как в среде культивирования штаммов, так и в мицелии. На продукцию ПС большее влияние оказывал способ выращивания грибов, чем углеродный субстрат. При глубинном культивировании штаммов 11-3, 11-4 и 11-5 накопление суммарных ПС было в 1.4, 1.7 и 2.5 раза выше по сравнению с поверхностным. При этом доля внеклеточных ПС при глубинном культивировании, независимо от природы углевода, составляла 85‒90%, а при поверхностном была ниже – 46‒67% от суммы ПС.

Источник углерода является одним из наиболее важных питательных веществ для биосинтеза ПС. Отходы сельского хозяйства, такие как рисовые отруби, барда, картофельная декстроза и другие побочные продукты могут применяться в качестве источника углерода для ферментации Cordyceps (Chen et al., 2016). Ферменты гриба модифицируют сложные углеводы до моносахаридных остатков, которые используются в биосинтезе полисахаридов. Глюкоза и сахароза являются самыми распространенными и благоприятными источниками углерода для роста биомассы и производства ПС в большинстве микробных ферментаций (Mao et al., 2005; Radchenkova et al., 2011; Wu et al., 2014). Максимальное значение концентрации ПС 5.7 г/л было получено при культивировании штамма С. militaris в среде, содержащей 40 г/л глюкозы и 10 г/л дрожжевого экстракта (Wang et al., 2019). Cравнение полученных нами данных с литературными показало, что изученные штаммы являются высокоактивными продуцентами ПС. Их суммарное содержание у штамма 11-5 при глубинном культивировании на сахарозе достигало 6.0‒6.7 г/л по сравнению с известными у С. militaris ‒ от 0.4 до 5.7 г/л (Yang et al., 2020).

Большое количество исследований для увеличения продукции ПС грибами С. militaris посвящено источникам азота и соотношению С : N в среде культивирования (Yang et al., 2020). При выращивании С. militaris обычно используют как органические (пептоны, гидролизаты казеина, дрожжевой экстракт и др.), так и неорганические источники азота (аммоний и нитрат). Влияние пяти источников азота на рост и биосинтез БАС изучали при глубинном культивировании штамма С. militaris 11-5 в среде с глюкозой. В исходных средах отношение С: N ~ 20: 1.

Из результатов табл. 2 можно видеть, что при использовании нитрата, гидролизата казеина, триптона и абиопептида урожай биомассы был в 1.3, 1.3, 1.3, 1.6 и 2 раза ниже, соответственно, по сравнению с глутаматом. Но глутамат, нитрат, гидролизат казеина не способствовали биосинтезу ПС культурой. Суммарное количество ПС на триптоне и абиопептиде было в 2‒3 раза выше по сравнению с другими источниками азота. Содержание нуклеозидов было примерно в 2 раза выше в среде с абиопептидом по сравнению с другими источниками азота. При использовании абиопептида культурой аденозин преобладал и составил 73% от суммы нуклеозидов. Таким образом, в нашем исследовании наибольшая продукция ПС и нуклеозидов штаммом С. militaris 11-5 наблюдалось при использовании абиопептида.

 

Таблица 2. Влияние источников азота на показатели роста, биосинтеза ПС и нуклеозидов C. militaris 11-5

Показатели	Источник азота
	Глутамат	Нитрат натрия	Гидролизат казеина	Триптон	Абиопептид
Биомасса, г/л	33.2 ± 1.9	25.4 ± 1.4	24.8 ± 1.7	20.3 ± 1.7	17.0 ± 0.8
Внеклеточные ПС, г/л	2.5 ± 0.4	1.7 ± 0.3	2.5 ± 0.2	5.1 ± 0.5	6.0± 0.6
Внутриклеточные ПС, г/л	1.1 ± 0.3	0.3 ± 0.1	0.4 ± 0.1	0.9 ± 0.2	0.7 ± 0.1
Сумма ПС, г/л	3.6	2.0	2.9	6.0	6.7
Аденозин, мг/л	136 ± 21	144 ± 2 8	94 ± 17	100 ± 22	264 ± 23
Кордизинин В, мг / л	96 ± 13	118 ± 17	74 ± 12	122 ± 17	126 ± 19
Сумма нуклеозидов, мг / л	232	262	168	222	390

 

Динамика роста и накопления полисахаридов C. militaris 11-5. C целью выяснения особенностей роста и биосинтеза ПС было проведено культивирование штамма С. militaris 11-5 ферментере. Гриб выращивали в среде, содержащей сахарозу и абиопептид, в условиях лимита по кислороду: значения рО₂ находились около 1% от насыщения воздухом. Это было достигнуто небольшой скоростью подачи воздуха (до 2 л/мин) и скоростью вращения мешалки до 400 об./мин. В процессе культивирования гриба, помимо глубинного роста, также наблюдался пристеночный (поверхностный) рост мицелия выше уровня среды. Культуральная суспензия была гомогенной и имела бледно желто-коричневый цвет. Вегетативный мицелий был представлен разветвленными равномерно септированными гифами до 3 мкм в диаметре, которые в отдельных случаях формировали мицелиальные тяжи. С 5 сут роста наблюдалось формирование фиалид и образование конидий. Далее происходило массовое прорастание этих конидий и дальнейший рост гиф.

На рис. 5 представлена динамика роста гриба, изменения концентрации углеводов и ПС в среде культивирования.

 

Рис. 5. Динамика роста, синтеза ПС и потребления углеводов C. militaris 11-5: 1 ‒ биомасса, г/л; 2 – углеводы, г/л; 3 – ПС, г/л.

 

Можно видеть, что активный рост мицелия и потребление углеводов наблюдались до 41 ч. Затем происходило снижение этих показателей, что связано с уменьшением концентрации углеводов в среде до 4 г/л. При внесении сахарозы до 24 г/л на 65 ч культивирования активный рост и потребление субстрата грибом восстановилось. Таким образом, показано, что биосинтез внеклеточных ПС культурой зависел от концентрации углеродного субстрата в среде. Биосинтез ПС наблюдался при концентрации углевода не ниже 10 г/л, а при дальнейшем снижении концентрации субстрата происходило потребление ПС культурой. Выход полисахаридов от потребленного субстрата (Y _пc/s) составил 0.12. Максимальные удельные скорости роста (μ), потребления сахарозы (q_caх) и биосинтеза ПС (q_ПС) наблюдались в первые сутки роста и составили 0.038 ч-^1, 0.44 г/г·ч, 0.28 г/г·ч соответственно. Таким образом, в процессе культивирования гриба наблюдался двухфазный характер образования ПС, связанный с повторным внесением углевода в среду. Снижение концентрации ПС связано с низким уровнем углеводов в среде. По-видимому, ПС можно рассматривать как запасные источники углерода, которые начинают потребляться культурой при низких значениях концентрации углеродного субстрата в среде.

Таким образом, наше исследование показало, что сибирские штаммы С. militaris, выделенные в Красноярском крае из погибших гусениц сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetverikov, отличаются от известных штаммов этого вида отсутствием биосинтеза кордицепина. Это может быть связано с неактивным состоянием генов кордицепинсинтетазы cns1-cns4. Сибирские штаммы являются высокоактивными продуцентами биологически активных соединений, таких как полисахариды, аденозин и кордизинин В. Кордизинин В у вида С. militaris обнаружен впервые. Суммарное содержание полисахаридов при глубинном культивировании С. militaris 11-5 на сахарозе достигало 6.0‒6.7 г/л, что сопоставимо с литературными данными. Следовательно, исследованные штаммы представляют интерес для биотехнологии. Полисахариды можно рассматривать как запасные источники углерода, которые начинают потребляться культурой, при недостаточной концентрации углеродного субстрата в среде. Исследование моносахаридного состава полисахаридов еще предстоит изучить.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая с татья не содержит результатов исследований, где в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование проводилось в рамках Государственного задания и частично поддержано грантом РНФ № 23-26-00052 (htts://rscf.ru/project/23-26-00052).

About the authors

T. V. Antipova

FRC Pushchino Centre for Biological Research, Russian Academy of Sciences; All-Russian Institute of Plant Protection

Author for correspondence.
Email: tatantip@rambler.ru

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms

Russian Federation, Pushchino, 142290; Pushkin, 196608, Saint-Petersburg

V. P. Zhelifonova

FRC Pushchino Centre for Biological Research, Russian Academy of Sciences

Email: tatantip@rambler.ru

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms

Russian Federation, Pushchino, 142290

B. P. Baskunov

FRC Pushchino Centre for Biological Research, Russian Academy of Sciences

Email: tatantip@rambler.ru

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms

Russian Federation, Pushchino, 142290

Y. A. Litovka

V.N. Sukachev Institute of Forest, FRC KSC, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Reshetnev Siberian State University of Science and Technology

Email: tatantip@rambler.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk, 660036; Krasnoyarsk, 660037

М. М. Patrusheva

V.N. Sukachev Institute of Forest, FRC KSC, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Reshetnev Siberian State University of Science and Technology

Email: tatantip@rambler.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk, 660036; Krasnoyarsk, 660037

V. B. Keshelava

Institute for Biological Instrumentation of the Russian Academy of Sciences

Email: tatantip@rambler.ru
Russian Federation, Pushchino, 142290

E. S. Mikhaylov

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; RosBioTech University at Pushchino

Email: tatantip@rambler.ru

Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; Fundamental Biotechnology Department, RosBioTech University at Pushchino

Russian Federation, Pushchino, 142290; Pushchino, 142290

I. N. Chistiakov

ООО “Pushchino Biotechnologies”

Email: tatantip@rambler.ru
Russian Federation, Pushchino, 142290

I. N. Pavlov

V.N. Sukachev Institute of Forest, FRC KSC, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Reshetnev Siberian State University of Science and Technology

Email: tatantip@rambler.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk, 660036; Krasnoyarsk, 660037

References

Supplementary files