Structural and genetic relationship of the O-antigens of the type strains Azospirillum agricola CC-HIH038 and Azospirillum doebereinerae GSF71

Full Text

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ДПС – дезацилированный полисахарид; ЛПС – липополисахарид; ОПС – О-специфический полисахарид; Ds-Na-ПААГ электрофорез – электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; GT – гликозилтрансфераза; ЯМР – ядерный магнитный резонанс; HSQC – протон-детектированная гетероядерная одноквантовая корреляция; ROESY – двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат; COSY – корелляционная спектроскопия; TOCSY – тотальная корреляционная спектроскопия; HMBC – гетероядерная корреляция через несколько связей; δ_С, δ_Н – значения химических сдвигов атомов ¹³C и ¹H соответственно.

 

Азотфиксирующие свободноживущие грамотрицательные бактерии р. Azospirillum широко известны как типичные представители группы бактерий, стимулирующих рост растений, в английской аббревиатуре PGPR (plant growth promoting rhizobacteria). Отсутствие строгой специфичности азоспирилл в отношении растения-хозяина, очевидно, определяется универсальностью многих бактериальных эффектов к широкому кругу потенциальных растений-партнеров. Механизм стимулирующего воздействия бактерий на растения активно исследуется, и азоспириллы являются признанными модельными объектами ассоциативных растительно-бактериальных взаимодействий (Fukami et al., 2018; Pedraza et al., 2020). Род Azospirillum включает 25 валидированных видов, изолированных преимущественно из сельскохозяйственных почв, ризосферы и корней растений, а также из таких разнообразных мест обитания, как загрязненные почвы, продукты ферментации, сульфидные и горячие источники, болота и озера, карстовые пещеры и микробные топливные элементы (Nievas et al., 2023). Спектр физиологической активности азоспирилл, посредством которого они оказывают стимулирующее действие на рост и развитие растений, включает продукцию фитогормонов, фиксацию атмосферного азота, солюбилизацию фосфатов, оптимизацию минерального питания растений, секрецию вторичных метаболитов, являющихся сигнальными молекулами, увеличивающих пролиферацию корневой системы, индуцирующих системную устойчивость растений и т.д. (Cassán et al., 2020).

С истоков изучения биохимии взаимодействия растений и свободноживущих диазотрофных бактерий многие научные изыскания были направлены на выявление молекул, выполняющих ведущую роль в выборе партнера ассоциативного симбиоза, и/или метаболитов, играющих ключевую роль на различных этапах взаимодействия. Среди основных претендентов на эту роль в большинстве исследований оказались гликополимеры поверхности бактерий (Caroff, Novikov, 2020). Для многих эффективных штаммов азоспирилл, как показали структурные исследования полисахаридов последних десятилетий (Федоненко и соавт., 2015), источником высокомолекулярных внеклеточных полисахаридов (полисахаридов капсулы и экстраклеточных полисахаридов) являются мембранные липополисахариды (ЛПС) (Konnova et al., 1994). Это стимулирует интерес к изучению структуры ЛПС и локализации генов его биосинтеза.

Липополисахариды (ЛПС) азоспирилл – основные структурные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий, покрывающие значительную часть поверхности бактериальной клетки, – вовлечены в начальные стадии формирования ассоциаций с растениями-хозяевами (Caroff, Novikov, 2020). Амфифильная молекула ЛПС гидрофобным компонентом, липидом А, встроена во внешнюю мембрану бактерий, а гидрофильным фрагментом – О-специфическим полисахаридом (ОПС), связанным с липидом А через олигосахарид кора, – экспонируется в окружающую среду. Бактериальные ОПС, в том числе ОПС азоспирилл, характеризуются высоким структурным разнообразием (Федоненко и соавт., 2015). Генетика биосинтеза ОПС подробно изучена для энтеробактерий, тогда как для почвенных микроорганизмов сведения об организации генов, ответственных за сборку ОПС и его экспорт на внешнюю мембрану, фрагментарны. За последние годы нами были получены данные о структурах ОПС типовых штаммов двенадцати видов азоспирилл, а для трех видов – A. zeae N7^T, A. melinis TMCY 0552^T и A. palustre B2^T – был проведен анализ генов, вовлеченных в биосинтез их ОПС (Сигида и соавт., 2022).

Целью настоящей работы являлось изучение структуры и характеристика генов биосинтеза ОПС типового штамма бактерий A. agricola CC-HIH038^T, выделенного из образцов культивируемой почвы, собранных на острове Тайвань, и сравнение с таковыми для ранее исследованных штаммов азоспирилл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучаемый штамм, условия культивирования бактерий и выделение липополисахарида. Штамм Azospirillum agricola CC-HIH038^T (IBPPM 625) предоставлен Коллекцией ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (http://collection.ibppm.ru). Культивирование бактерий проводили в колбах Эрленмейера в жидкой малатно-солевой среде с витаминами (Konnova et al., 1994) до окончания экспоненциальной фазы роста с использованием шейкера-инкубатора ЕS-20/60 (“BioSan”, Латвия) при температуре 30°С и 120 об./мин. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин с применением центрифуги Allegra X-30R (“Beckman Coulter”, США), ресуспендировали в 0.15 М растворе NaCl; механическим перемешиванием удаляли с поверхности капсульный материал, как описано ранее (Konnova et al., 1994). Клетки высушивали ацетоном и тонко диспергировали.

ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток горячим 45%-м водным раствором фенола без разделения слоев (Кульшин и соавт., 1987). Экстракты освобождали от остатков фенола диализом с помощью мембран MEMBRA-CEL® с пределом исключения 14 кДа (“Viscase”, Франция), концентрировали на роторном испарителе Laborota 4000 (“Heidolph”, Германия). Экстракт ЛПС титровали 40%-ой CCl₃ COOH до конечного значения рН 2.7 и декантировали после осаждения белков центрифугированием, диализовали и лиофилизовали на сушке Bench Top 2K (“VirTis”, США).

Получение О-специфического полисахарида осуществляли мягким кислотным гидролизом ЛПС 2%-ой CН₃COOH при 100°С в течение 4 ч с последующим осаждением центрифугированием (12000 g, 30 мин) нерастворимого в воде липида А. Водорастворимую часть гидролизата разделяли гель-хроматографией на колонке с Toyopearl TSK HW-50 (S) (“Tosoh Bioscience’, Япония) в 1% AcOH. Элюцию контролировали с помощью дифференциального проточного рефрактометра (“Knauer”, Германия). Фракцию высокомолекулярного ОПС концентрировали и лиофилизировали.

Дезацилирование препарата ОПС проводили в 12.5% растворе NH₄OH при 37°С в течение 16 ч. Полученный препарат дезацилированного полисахаридида (ДПС) выделяли на колонке с Toyopearl TSK HW-50 (S) (“Tosoh Bioscience”, Япония) в 1% AcOH.

Ds-Na-ПААГ электрофорез препаратов ЛПС выполняли, как описано ранее (Hitchcock, Brown, 1983). Визуализацию компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра (Tsai, Frasch, 1982).

Газо-жидкостная хроматография. Анализ моносахаридого состава и абсолютных конфигураций сахаров после гидролиза ОПС 2M CF₃COOH (120°С, 2 ч) осуществляли методом ГЖХ ацетатов полиолов (Sawardeker et al., 1965) и ацетилированных 2-(S)-октилгликозидов (Leontein et al., 1978) на хроматографе GC-2010 (“Shimadzu”, Япония) с капиллярной колонкой DB-5 (“Agilent”, США). Градиент температуры от 160°C (1 мин) до 290°C, скорость нагрева 7°C/мин.

Состав жирных кислот ЛПС определяли методом ГЖХ на хроматографе GС-2010 (“Shimadzu”, Япония), снабженном колонкой DB-5 (“Agilent”, США). Градиент температуры от 110°C (5 мин) до 290°C (30 мин), скорость нагрева 5°C/мин. Метилирование выполняли методом, описанным в работе (Mayer et al., 1985).

ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР записывали на спектрометре Avance-700 II (“Bruker”, Германия) в растворе 99.96%-ой D₂O при 30°С, (внутренний стандарт – триметилсилилпропаноат- d₄, δ_C –1.6 и δ_H 0.0). Образцы предварительно лиофилизовали дважды из 99.9%-ой D₂O. Двумерные спектры записывали с использованием стандартного математического обеспечения компании “Bruker” (Германия); для сбора и обработки данных использовали программу TOPSPIN 2.1. В экспериментах TOCSY и ROESY время смешивания составляло 150 и 200 мс соответственно.

Анализ генов биосинтеза О-антигенов. Гены биосинтеза l-Rha были извлечены из полногеномных сиквенсов A. agricola CC-HIH038^T (GCF_017876095.1) и A.doebereinerae GSF71^T (GCF_003989665.1). Предсказание функций идентифицированных последовательностей генов проводили путем выравнивания соответствующих и известных белковых последовательностей (полученных из GenBank), участвующих в биосинтезе O-антигенов других бактерий, с помощью инструмента BLAST (Altschul et al., 1997). Трехбуквенные (wzm и wzt) и четырехбуквенные обозначения (rfbA – rfbD, galE) присвоены генам в соответствии с их аннотациями, а также результатами попарных выравниваний их нуклеотидных последовательностей. Изображение генных кластеров изучаемых штаммов азоспирилл было получено с помощью визуализатора Easyfig версии 2.2.5 (Sullivan et al., 2011). Гомологию нуклеотидных последовательностей генов оценивали с помощью попарных выравниваний соответствующих последовательностей, выполненных с помощью сервиса BLASTn.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика липополисахарида и анализ структуры О-специфического полисахарида A. agricola CC-HIH038^T. Методом водно-фенольной экстракции из высушенной биомассы бактерий A. agricola HIH038^T был выделен ЛПС. Ds-Na-электрофорез препарата ЛПС с окрашиванием серебром (рис. 1) демонстрировал типичную для ЛПС азоспирилл картину с преобладанием молекул ЛПС в верхней части геля, свидетельствующим о высокой степени замещения корового олигосахарида цепями О-специфического полисахарида.

 

Рис. 1. Электрофореграмма препаратов липополисахаридов в 13.5% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия: A. agricola CC-HIH038^T (1), Pseudomonas putida TSh-18 B2 (2).

 

Анализ состава жирных кислот в ЛПС выявил присутствие характеристичных для бактерий рода Azospirillum (Сигида и соавт., 2022) 3-гидрокситетрадекановой, 3-гидроксигексадеканой, гексадекановой и октадеценовой кислот, а также еще одного компонента, который по времени удерживания был предварительно идентифицирован нами как 3-гидроксиоктадекановая кислота. В результате анализа моносахаридов методами ГЖХ ацетатов полиолов и ацетилированных (S)-октилгликозидов в составе ОПС A. agricola HIH038 ^T были идентифицированы l-Rha и d-GlcNAc в соотношении 3 : 1.

ОПС был подвергнут комплексному анализу методом спектроскопии ЯМР. Спектр ¹³C ЯМР ОПС (рис. 2) содержал сигналы четырех аномерных углеродов при δ 100.1‒103.4 м.д., трех C H₃-C групп (C-6 Rha) при δ 17.7, 17.8 и 17.9 м.д., одной O C H₂-C группы (C-6 GlcNAc) при δ 64.4 м.д., одного атома углерода, связанного с азотом, при δ 56.6 м.д., сигналы О-ацетильных групп при δ 21.5 (CH₃₎, 174.1 и 175.3 м.д. (CO), и шестнадцать сигналов других атомов углерода моносахаридных остатков при δ 69.3‒82.5 м.д.

 

Рис. 2. ¹³C-ЯМР-спектр О-специфического полисахарида A. agricola CC-HIH038^T. Арабские цифры относятся к атомам углерода в моносахаридных остатках, обозначенных, как указано в табл. 1.

 

В спектре отсутствовали сигналы в диапазоне при δ 83‒88 м.д., характеристичные для фуранозидов (Bock, Pedersen, 1983), что свидетельствовало о том, что все моносахаридные остатки находятся в пиранозной форме. В сильнопольной области ¹H ЯМР спектра присутствовало пять сигналов протонов в диапазоне δ 4.76‒5.31 м.д., трех C H₃-C групп (H-6 Rha) при δ 1.24‒1.32 м.д., сигналы О-ацетильных групп при δ_H 2.12 и 2.16 м.д. и других протонов моносахаридных остатков в диапазоне δ 3.57‒4.14 м.д.

Спектры ¹³C и ¹H ЯМР ОПС были отнесены с помощью 2D экспериментов ¹H, ¹H COSY, TOCSY, ROESY и ¹H, ¹³C HSQC и HMBC (табл. 1).

 

Таблица 1. Данные ¹³С и ¹Н-спектров ЯМР интактного и дезацилированного О-специфического полисахарида A. agricola CC-HIH038^T (химические сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток	Химические сдвиги
	Моносахарид						OAc
	Н-1 C-1	H-2 C-2	H-3 C-3	H-4 C-4	H-5 C-5	H-6 (a,6) C-6	СH3	CO
Интактный О-специфический полисахарид
→ 3)- α- l-Rha p 2Ac-(1 → A	5.10 100.1	5.31 72.6	4.06 79.5	3.57 72.0	3.90 70.2	1.31 17.8	2.12 21.5	174.1
→ 3)- α- l-Rha p-(1 → B	5.00 103.4	4.14 71.1	3.90 79.7	3.58 72.5	3.82 70.4	1.32 17.9
→ 3)- α- l-Rha p-(1 → C	4.84 102.5	3.88 71.7	3.78 79.4	3.53 72.4	4.02 70.3	1.24 17.7
→ 3)- b- d-Glc p NAc6Ac-(1 → D	4.76 102.7	3.86 56.6	3.62 82.5	3.61 69.3	3.65 74.4	4.27, 4.34 64.4	2.16 21.5	175.3
Дезацилированный полисахарид
→ 3)- α- l-Rha p-(1 → A’	5.03 103.2	4.28 71.0	3.93 81.1	3.52 72.1	3.86 70.5	1.29 17.8
→ 3)- α- l-Rha p-(1 → B’	5.00 103.4	4.14 71.2	3.89 79.6	3.56 72.5	3.82 70.6	1.32 17.9
→ 3)- α- l-Rha p-(1 → C’	4.85 102.5	3.88 71.7	3.80 79.3	3.54 72.5	4.03 70.3	1.25 17.7
→ 3)- b- d-Glc p NAc-(1 → D’	4.76 103.2	3.88 56.7	3.63 82.8	3.54 69.6	3.47 77.0	3.77, 3.93 61.9

Примечание. Сигналы NAc-группы: δ 2.04. δ _С 23.4 (CH ₃₎, δ_С 175.5 (CO) ОПС и δ_H 2.05. δ_С 23.4 (CH ₃₎, δ_С 175.6 (CO) в ДПС.

 

Прослеживание корреляций в ¹H, ¹H COSY и TOCSY спектрах, в сочетании со значениями констант спин-спинового взаимодействия ³J_H,H (Altona, Haasnoot, 1980) и химическими сдвигами атомов углерода в ¹³C ЯМР спектрах, позволило выявить спин-спиновые системы трех остатков Rha (A – С) и одного остатка GlcNAc (D).

Относительно сильнопольное положение сигналов С-5 остатков A, B и С при δ 70.2-70.4 м.д. и относительно слабопольное положение сигнала С-5 остатка D при δ 74.4 м.д. свидетельствовали об α-конфигурации остатков A, B и С и β-конфигурации остатка D (Bock, Pedersen, 1983). Наличие характеристичных для α-аномеров H-1/H-2 корреляций у остатков A, B и С и характеристичных для β-аномеров H-1/H-3, H-1/H-5 корреляций у остатка D в спектрах ¹H, ¹H ROESY подтверждало аномерные конфигурации моносахаридных остатков (риc. 3).

 

Рис. 3. Фрагмент ¹H, ¹H ROESY спектра О-специфического полисахарида A. agricola CC-HIH038^T.  Арабские цифры относятся к протонам в моносахаридных остатках, обозначенных, как указано в табл. 1.

 

Значительное смещение сигналов С-3 всех моносахаридных остатков, по сравнению с незамещенными моносахаридами (Bock, Pedersen, 1983), указывало на позиции гликозилирования. Последовательность моносахаридов в повторяющемся звене ОПС была определена на основании межзвеньевых корреляций между аномерными протонами и протонами при связьевых углеродах в спектре ¹H, ¹H ROESY (рис. 3): A H-1/ B H-3 при δ 5.10/3.90 м.д.; B H-1/ C H-3 при δ 5.00/3.78 м.д., C H-1/ D H-3 при δ 4.84/3.62 м.д., D H-1/ A H-3 при δ 4.76/4.06 м.д. В спектре ¹ H, ¹³ C HMBC (рис. 4) ОПС присутствовали соответствующие корреляции между аномерными протонами и трансгликозидными углеродами: A H-1/ B С-3 при δ 5.10/79.7 м.д.; B H-1/ C С-3 при δ 5.00/79.4 м.д., C H-1/ D С-3 при δ 4.84/82.5 м.д., D H-1/ A С-3 a при δ 4.76/79.5 м.д.

 

Рис. 4. Фрагмент ¹H, ¹³С HMBC спектра О-специфического полисахарида A. agricola CC-HIH038^T. Соответствующие участки ¹H и ¹³C ЯМР спектров расположены вдоль горизонтальной и вертикальной осей соответственно. Арабские цифры относятся к корреляциям С/H в моносахаридных остатках, обозначенных, как указано в табл. 1.

 

Таким образом, ОПС A. agricola CC-HIH038^T имеет следующую структуру →3)-α- l-Rha p 2Ac-(1→3)-α- l-Rha p-(1→3)-α- l-Rha p-(1→3)-β- d-Glc p NAc6Ac-(1→.

Для подтверждения данной структуры ОПС был дезацилирован в мягких щелочных усло- виях, и полученный препарат ДПС был исследован с применением ¹H и ¹³C ЯМР спектроскопии, как описано выше для ОПС (табл. 1). Относительно слабопольное положение сигналов H-2, С-2 остатка А и H-6(a; b), C-6 остатка D в спектре ОПС, по сравнению с ДПС (рис. 2, табл. 1) в сочетании с кратностью интегральной интенсивности сигналов ¹H спектров ОПС свидетельствовали о полном О-ацетилировании остатка A в положении 2 и остатка D в положении 6.

Ранее нами была установлена структура ОПС A. doebereinerae GSF71^T, отличающегося от исследуемого в данной работе ОПС степенью О-ацетилирования остатка GlcNAc (~ 20%) (Sigida et al., 2019).

Сравнительный анализ генов, ответственных за биосинтез ОПС, у A. agricola CC- HIH038^T и A. doebereinerae GSF71^T. Род Azospirillum включает 25 видов, и для большинства типовых штаммов установлены структуры О-антигенов, в составе которых отмечено преобладание l-рамнозы (Федоненко и соавт., 2015, Сигида и соавт., 2022). Известно, что структура О-антигенов грамотрицательных бактерий может быть использована в качестве хемотаксономического критерия, а анализ генов кластеров, ответственных за биосинтез О-антигенов, позволяет оценить их эволюционные взаимосвязи.

Рамноза для большого числа бактерий имеет очень важное значение, поскольку входит в состав полисахаридов клеточной стенки у грамположительных бактерий и липополисахаридов у многих грамотрицательных бактерий. Гены, кодирующие ферменты биосинтеза l-рамнозы, обозначаются в разных организмах как rml, rfb или rff A, B, C и D (Mistou et al., 2016).

Для выяснения генетической основы родства близких по структуре ОПС A. agricola CC-HIH038^T и A. doebereinerae GSF71^T был выполнен анализ данных полногеномного секвенирования исследуемых штаммов. Было показано, что локусы биосинтеза ОПС двух исследуемых штаммов очень схожи по содержанию генов и организации (рис. 5).

 

Рис. 5. Схематичное расположение кластеров генов биосинтеза О-антигенов A. doebereinerae GSF71^Т и A. agricola CC-HIH038^Т. Светло-серыми стрелками обозначены гены биосинтеза моносахаридов, темно-серыми – гликозилтрансферазы, черными – гены процессинга wzt и wzm, белыми – гены с неизвестными функциями.

 

Они содержали наборы генов, транскрибирующихся в одном направлении и кодирующих ферменты биосинтеза нуклеотиддифосфатного производного l-Rha (rfbA, rfbB, rfbC, rfb D), гликозилтрансферазы, а также ферменты процессинга, обеспечивающие трансмембранный перенос повторяющегося звена (wzt, wzm). Характеристики всех открытых рамок считывания и их гомологов, выявленных нами с помощью биоинформатического анализа, приведены в табл. 2. Следует отметить, что довольно часто кластер генов, участвующих в биосинтезе О-антигена, ограничен двумя консервативными генами, например, у Escherichia coli и родственных им бактерий он расположен на хромосоме между консервативными генами galF и gnd (Liu et al., 2020). Пока нам не удалось выявить аналогичной закономерности у азоспирилл, что, возможно, обусловлено ограниченностью сведений об организации их генных кластеров биосинтеза О-антигенов.

Инициация синтеза полимерной цепи ОПС, как правило, начинается с переноса N-ацетилглюкозамин-1-фосфата на ундекапренилфосфат и образования так называемого “праймера ОПС”. Эта реакция катализируется GlcNAc-1-фосфат-трансферазой (WecA), относящейся к семейству трансфераз (PNPT), участвующих в сборке гликанов бактериальной клеточной поверхности (Woodward, Naismith, 2016). В составе ОПС A. agricola CC-HIH038 ^T и A. doebereinerae GSF71^T выявлен остаток GlcNAc, который, с высокой долей вероятности, можно считать первым в биологическом повторяющемся звене. Однако нам не удалось идентифицировать в геномах обоих штаммов гены гомологичные wecA, охарактеризованным у других бактерий.

Гены биосинтеза нуклеотидного предшественника d-GlcNAc относятся к так называемым генам “домашнего хозяйства” и обычно не входят в специфическую область генного кластера ОПС. Три остальных моносахарида в повторяющемся звене ОПС исследуемых штаммов представлены 3-замещенными остатками l-Rha p, синтез предшественника которых дезокситимидиндифосфат- l-рамнозы осуществляют четыре фермента: глюкозо-1-фосфаттимидилтрансфераза (RfbA), dTDP- d-глюкозо-4,6-дегидратаза (RfbB), dTDP-4-кето-6-дезокси- d-глюкозо-3,5-эпимераза (RfbC) и dTDP-4-кето- l-Rha редуктаза (RfbD) (Li et al., 2022), кодируемые генами rfbABCD, располагающимися в кластере в консервативном порядке (Madduri et al., 2001).

В локусе выявлен ген гликозилтрансферазы (GT) (табл. 2), биоинформатический анализ которого не демонстрировал существенной гомологии с охарактеризованными генами рамнозилтрансфераз у ограниченного числа бета- и гамма-протеобактерий (Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Neisseria spp., Bordetella spp., Acinetobacter baumannii), что может быть обусловлено вариабельностью структур данного фермента у представителей филогенетически удаленных групп. Следует отметить, что для классификации большого семейства гликозилтрансфераз используют три основных подхода, основанные на: а) анализе аномерной конфигурации реагентов и продуктов реакции, соответственно выделяющие инвертирующие или удерживающие (сохраняющие конфигурацию) GT; б) топологии GT, т.е. характеристике доменной структуры (укладки Россмана) и расположения доноров и акцепторов – GT-A, GT-B и GT-C; в) гомологии последовательностей – 135 различных семейств GT (по состоянию на 15 апреля 2024 г.) в базе данных Carbohydrate-Active enZYmes (http://www.cazy.org). При широкой распространенности у бактерий рамнозосодержащих полимеров очевидно присутствие отнесенных по классификации CAZy к классу GT-2 рамнозилтрансфераз, сведения о структурных и биохимических особенностях которых остаются лимитированы (Kenyon et al., 2021a, 2021b).

 

Таблица 2. Белки биосинтеза О-антигенов A. agricola CC-HIH038 ^T и A. doebereinerae GSF71 ^T и их ближайшие гомологи

Ген	Кодируемый белок	Штамм (код доступа)
		A. agricola CC-HIH038T (GCF_017876095.1)		A. doebereinerae GSF 71T (VTTN 01000010.1)
		С DS (ID белка)	Ближайший гомолог* покрытие/идентичность (длина совпадающего фрагмента)	С DS (ID белка)	Ближайший гомолог* Покрытие/идентичность (длина совпадающего фрагмента)
wzm	ABC-транспортная пермеаза	12456..13289 ** (WP_209782658.1)	Nitrospira sp. (MCA9458094.1) 97/ 60 (271)	44148..44981 (RUQ68956.1)	Nitrospira sp. (MCA9458094.1) 9 7 /60 (271)
wzt	ABC-транспортный AT Ф-связывающий белок	11084..12466 (WP_014190028.1)	Negativicutes bacterium (MDR3564473.1) 95/76 (440)	44971..46350 (RUQ68834.1)	Negativicutes bacterium (MDR3564473.1) 95/76 (440)
MT	SAM- зависимая метилтрансфераза класса 1	7295..10591 (WP_209782630.1)	Rhodospirillaceae bacterium (MBT4739842.1) 99/47 (1045)	46626..50132 (RUQ68835.1)	Rhodospirillaceae bacterium (MBT4739842.1) 94/47 (1045)
GT	Гликозилтрансфераза	6327..7286 (WP_209782629.1)	Rhodospirillaceae bacterium (MDX2225046.1) 91/57 (304)	50141..51085 (RUQ68836.1)	Pseudomonadota bacterium (MCA0201587.1) 90/58 (291)
GalE	UDP- глюкозо 4- эпимераза	5256..6278 (WP_209782628.1)	Thalassospira sp. TSL5-1 (WP_073954240.1) 94/65 (331)	51134..52156 (complement) (RUQ68837.1)	Alphaproteobacteria bacterium (GIK99467.1) 96/70 (332)
rfbC	dTDP-4-дегидро-маннозо 3,5-эпимераза	4475..5026 (complement) (WP_209782627.1)	Methylobacterium sp. B34 (WP _042673940.1) 100/ 79 (183)	52386..52937 (RUQ68838.1)	Methylobacterium sp. B34 (WP_042673940.1) 100 /78 (1 83)
rfbB	dTDP- глюкозо-4,6- дегидратаза	3302..4378 (complement) (WP_209782626.1)	Pararhodospirillum photometricum (WP_051013520.1) 97/79 (353)	53018..54097 (RUQ68839.1)	P. photometricum DSM 122 (CCG06590.1) 9 6 / 79 (358)
rfbD	dTDP-4-дегидроман-нозоредуктаза	2397..>3299 (complement) неполный RefSeq : WP _014190024.1	P. photometricum DSM 122 (CCG06589.1) 98/63 (300)	54094..54993 (RUQ68840.1)	Pararhodospirillum photometricum DSM 122 (CCG06589.1) 98/62 (300)
rfbA	Глюкозо-1-фосфат тимидил-трансфераза	1441..2304 (complement) (WP_209782624.1)	P. photometricum (WP _041795448.1) 100/79 (288)	55086..55949 (RUQ68841.1)	P. photometricum (WP_041795448.1) 98/80 (288)

*Бактерия (код GenBank ближайшего гомолога). **Нумерация в контиге Ga0451084_35.

 

Таким образом, генетические данные, в целом, согласуются с установленными структурами ОПС и могут быть использованы при разработке молекулярной основы для хемотипической классификации штаммов азоспирилл. Учитывая востребованность азоспирилл для биотехнологического использования, а также возникающие противоречия осуществляемого почти исключительно путем секвенирования 16S рРНК (Maronishe et al., 2017), в качестве альтернативных маркеров можно использовать хемотипирование на основании структур О-антигенов и сходство генов их биосинтеза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования Дальневосточного центра структурных молекулярных исследований (ЯМР- и масс-спектрометрии) (ЦСМИ ТИБОХ ДВО РАН).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

E. N. Sigida

FRC Saratov Scientific Centre of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sigida_e@ibppm.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049

V. S. Grinev

FRC Saratov Scientific Centre of Russian Academy of Sciences; Chernyshevky Saratov State University

Email: sigida_e@ibppm.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049; Saratov, 410012

M. S. Kokoulin

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: sigida_e@ibppm.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

S. A. Konnova

FRC Saratov Scientific Centre of Russian Academy of Sciences; Chernyshevky Saratov State University

Email: sigida_e@ibppm.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049; Saratov, 410012

Y. P. Fedonenko

FRC Saratov Scientific Centre of Russian Academy of Sciences

Email: sigida_e@ibppm.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049

References

Supplementary files