Alkalo-thermophilic iron-reducing bacteria of the Goryachinskoe thermal water deposit

全文:

Алкалотермофильные железоредуцирующие бактерии Горячинского месторождения термальных вод ¹

Процесс анаэробной железоредукции, осуществляемой микроорганизмами, использующими для получения энергии минералы трехвалентного железа, например, ферригидрит, интенсивно исследуется с 80-х годов прошлого века. На сегодняшний день известно более 150 видов прокариот, способных к диссимиляционному восстановлению железа, относящихся как к домену Bacteria, так и Archaea (Nixon et al., 2022). Подавляющее большинство железоредукторов – бактерии, представители более чем 20 семейств, что доказывает их высокое филогенетическое разнообразие (Waite et al., 2020; Li et al., 2021; Khomyakova et al., 2022a, 2022b; Nixon et al., 2022; Khomyakova et al., 2022b; Zavarzina et al., 2022; Zhang et al., 2022; Han et al., 2023; Zakharyuk et al., 2023; Boltyanskaya et al., 2023). Описанные на сегодняшний день железовосстанавливающие микроорганиз мы выделены из разнообразных экониш, включая анаэробные илы пресноводного и морского происхождения, болота, антропогенные местообитания, такие как метантенки и топливные элементы, а также подземные экосистемы. Наибольшее число видов выделено из морских и пресноводных осадков, морских и наземных гидротермальных систем и почв (Nixon et al., 2022). Большинство известных железоредукторов ‒ мезофилы, имеющие оптимум роста при температурах 25–35°С и значениях рН 6.5‒7.5. Однако примерно 40% описанных видов железоредукторов выделено из экстремальных мест обитания: известны термофильные, психрофильные, ацидофильные и алкалофильные представители этой метаболической группы (Nixon et al., 2022). Анализ распределения 141 вида железоредукторов в координатах рН и Т, проведенный Nixon и соавт., выявил несколько интересных закономерностей: несмотря на то, что термодинамические расчеты показывают возможность существования полиэкстремофильных железоредукторов, описанные на сегодняшний день микроорганизмы либо относятся к “нормальной” микрофлоре, либо приспособлены к экстремальным условиям только по одному из исследованных параметров – рН или Т. По мнению авторов исследования, такое распределение во многом является следствием предвзятости пробоотбора и существенно искажает реальную картину распространенности процессов железоредукции на Земле. Исправить ситуацию могло бы, с одной стороны, привлечение к анализу данных метагеномных исследований и выскопроизводительного секвенирования гипервариабельных участков генов 16S рРНК, с другой стороны, целенаправленное выделение в чистые культуры полиэкстремофильных железоредукторов, которое могло бы разрешить вопрос о возможности их существования или выявило бы биохимические или кинетические ограничения, препятствующие их развитию (Nixon et al., 2022).

Примером таких полиэкстремальных экосистем являются щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны, в частности, Горячинское месторождение подземных вод, расположенное на восточном берегу озера Байкал, приуроченное к Кики-Туринской зоне разломов. Эта значительная по ширине и протяженности тектонически ослабленная зона была заложена в протерозое, функционирует до настоящего времени и является юго-восточной границей Байкальской рифтовой системы, сложенной кристаллическими магматическими (граниты) и метаморфическими (гнейсы, гнейсограниты) породами (Ломоносов, 1974). Разломы и сопровождающие их зоны интенсивной трещиноватости формируют емкостную среду, вмещающую значительную часть естественных ресурсов трещинных вод этого района (Плюсин и соавт., 2013). Термальные воды Горячинского месторождения представляют собой типичные напорные трещинные воды, поднимающиеся с глубины порядка 1500‒1800 м. По химическому составу они относятся к слабоминерализованным азотным щелочным термам. Температура воды на выходе составляет 53‒55°С, дебит 1200 м³ /сут, рН 8.8‒9.2 (Ясницкая, Ткачук, 1961). Термальные щелочные воды этого месторождения образовались за счет взаимодействия метеорных вод с железосодержащими магматическими, метаморфическими и осадочными породами, подвергшимися дроблению и деформации в результате тектонических движений регионального масштаба, что привело к образованию многочисленных трещин (Плюсин и соавт., 2013), которые могут потенциально служить местообитаниями для подземной микрофлоры.

Таким образом, Горячинские термы представляют собой безусловный интерес в качестве объекта для целенаправленного поиска и выделения полиэкстремофильных железоредукторов, что и являлось целью настоящих исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор проб. Скважина 1/76, пробуренная в 1963 году на глубину 100 м, вскрывает трещинные сульфатно-натриевые воды с минерализацией 54.2 мг/л, рН 8.9, температурой 54°С в отложениях баргузинского интрузивного комплекса, представленного сильно раздробленными амфиболитовыми и гнейсо-плагиогранитными брекчиями, в интервале 30‒100 м (Ясницкая, Ткачук, 1961). Оголовок скважины находится в бетонном колодце, над которым построено надкаптажное деревянное сооружение (рис. S1а). За время эксплуатации скважины у основания колодца образовались грифоны, выходящие на поверхность и образующие ручей, впадающий в пруд, сформировавшийся разгружающимися подземными водами в 150 м западнее скважины. Проба № 1 (Е 108°18′26.03″, N 52°59′13.93″) представляла собой песчаный и каменистый грунт и воду ручья, отобранные у самого основания бетонного колодца. Проба № 2 (Е 108°18′27.97″, N 52°59′14.04″) была отобрана в 40 м ниже по течению ручья, образованного грифонами скважины 1/76 и термальным самоизливающимся источником, каптированным колодцем, расположенным в 20 м севернее скважины 1/76. Проба представляла собой илистые осадки, содержащие остатки прибрежной растительности и воду, отобранные с поверхности донных отложений ручья (рис. S1б). Проба № 3 представляла собой восстановленные илистые отложения, грунт и воду, отобранные там же с глубины 10 см (рН 8.8, Т 50°С). Пробы вносили в стерильные стеклянные флаконы объемом 50 мл, содержащие синтезированный ферригидрит (расчетная конечная суммарная концентрация трехвалентного железа 45 мМ), приготовленный, как описано ранее (Zavarzina et al., 2006), и полностью заполняли водой, отобранной из места отбора проб для поддержания анаэробных условий. Для пробы № 1 было поставлено три варианта: (1) без добавления дополнительных доноров; (2) с добавлением смеси органических кислот – формиат, ацетат, лактат и пируват (по 0.5 г/л каждого); (3) с добавлением дрожжевого экстракта (1 г/л). В пробы № 2 и 3, богатые органическим веществом, дополнительные доноры не вносили. В лаборатории перед инкубацией из каждого флакона было вытеснено 30 мл воды азотом. Продувку газом осуществляли в ламинаре через мембранный фильтр (0.22 мкм). Инкубацию проводили в темноте в течение 10 сут при Т 55°С (проба № 1) и 50°С (пробы № 2 и 3).

Выделение ДНК, подготовка и секвенирование библиотек ампликонов гена 16S рРНК. ДНК выделяли из осадков, отобранных в 5 мл стерильные пластиковые флаконы, параллельно с пробами для инкубации. Также ДНК выделяли из осадков и воды первичных накопительных культур, в которых было зафиксировано восстановление ферригидрита, и полученных в ходе дальнейших пересевов накопительных культур органо- и литотрофных алкалотермофильных железоредукторов. Для этого флаконы встряхивали и шприцем анаэробно отбирали по 5 мл суспензии, которую затем центрифугировали при 13000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость сливали, а осадки использовали для экстракции тотальной ДНК. ДНК выделяли при помощи набора FastDNA™ SPIN Kit for Soil (“MP Biomedicals”, США), согласно инструкции производителя.

Подготовку библиотек ампликонов V4 участка гена 16S рРНК проводили по описанной ранее методике (Gohl et al., 2016) с использованием пары праймеров 515F (5ꞌ-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3ꞌ; Hugerth et al., 2014) ‒ Pro-mod-805R (5ꞌ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ꞌ; Меркель и соавт., 2019). Секвенирование библиотек проводили на системе MiSeq™ (“Illumina Inc.”, США) с использованием картриджа для получения парно-концевых прочтений длиной 150 нуклеотидов. Биоинформатический анализ проводили аналогично описанному в работе (Merkel et al., 2021). Все данные секвенирования депонированы в NCBI BioProject PRJNA1117896.

Получение накопительных культур. В качестве посевного материала для получения накопительных культур алкалотермофильных железоредукторов использовали пробы (5% засев) из флаконов с первичными накопительными культурами, проявившими способность к железоредукции, визуально определяемой по потемнению осадка ферригидрита. В качестве минеральной основы использовали среду, приготовленную с соблюдением техники анаэробного культивирования под N₂ (100%), следующего состава (г/л): 0.15 KH₂PO_4; 0.15 NH₄Cl; 0.15 KCl; 0.15 MgCl₂ ⋅ 2H₂O; 0.15 CaCl₂ ⋅ 2H₂O; Na₂CO₃ 0.3; растворы витаминов (1 мл/л) (Wolin et al., 1963) и микроэлементов (1 мл/л) (Кевбрин, Заварзин 1992); рН подводили до значения 9.0 10% раствором NaOH. Разлив осуществляли в пробирки Хангейта по 10 или 5 мл под током N₂ (100%). В качестве доноров электронов для накопительных культур использовали смесь органических кислот, отдельные органические кислоты (формиат, ацетат, лактат или пируват по 1 г/л) или молекулярный водород (20% от газовой фазы). Инкубацию проводили при 55°С.

Состояние накопительных культур контролировали по изменению численности прямым подсчетом клеток, окрашенных красителем акридиновым оранжевым, с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Lab.A1 (“Carl Zeiss”, Германия) и образованию двухвалентного железа, определенного спектрометрически с феррозином (Stookey, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Восстановление ферригидрита в первичных накопительных культурах алкалотермофильных железоредукторов

Изменение цвета осадка ферригидрита было зафиксировано через 10 сут после начала инкубации во всех пробах, за исключением пробы № 1 без добавления дополнительных доноров. Качественные характеристики осадка (цвет, магнитность), результаты измерения двухвалентного железа, растворимого в 6Н НСl, рН и подсчета клеток суммированы в табл. 1. Морфологически в первичных накопительных культурах преобладали палочки разной длины, споровые и неспоровые, преимущественно неподвижные, и вибрионы (дополнительные материалы, рис. S2).

 

Таблица 1. Основные характеристики процесса восстановления ферригидрита первичными накопительными культурами алкалотермофильных железоредукторов

Проба	T инкуб., °С	рН после инкубации	Цвет осадка	Магнитность осадка	Fe(II), мМ	Количество клеток, кл. /мл
№ 1	55	8.9	Коричневый	Не магнитный	0.2	7.3 × 105
№ 1 + органические кислоты	55	8.49	Черный	Сильно магнитный	3.75	2.9 × 107
№ 1 + дрожжевой экстракт	55	8.16	Черный	Слабо магнитный	9.31	3.4 × 107
№ 2	50	7.88	Темно-коричневый	Не магнитный	4.75	6.9 × 107
№ 3	50	8.0	Черный	Слабо магнитный	4.38	1.1 × 108
Контроль *	55	8.9	Коричневый	Не магнитный	0	Не обнаружено

*В качестве контроля использовали флакон с ферригидритом и пробами донных осадков и воды источника Горячинск, перед инкубацией подвергшийся стерилизации при 1 атм и 120°С.

 

Филогенетический состав микробного сообщества проб воды и осадка и первичных накопительных культур, восстанавливающих ферригидрит

Проба № 1. Микробное сообщество пробы, отобранной в месте разгрузки грифона скважины 1/76, на уровне филумов характеризовалось достаточно высоким разнообразием. Основную часть сообщества (42%) составляли некультивируемые представители филума Pseudomonadota (синоним Proteobacteria), второе по распространенности место (14.7%) занимали представители Nitrospirota, третье (10.5%) представители филума Deinococcota (рис. 1).

 

Рис. 1. Таксономическое разнообразие микроорганизмов, ассоциированных с природными пробами № 1, 2 и 3 и накопительными культурами на уровне филумов.

 

При этом представленность большинства бактериальных таксонов на уровне семейств‒родов (менее 3%) (рис. 2, табл. S1), а большинство филотипов имело низкое сходство с известными таксонами, что значительно затруднило интерпретацию их метаболических возможностей. Из известных таксонов заметную часть сообщества составлял филотип, относящийся к роду Meiothermus (10.5% представленности).

 

Рис. 2. Таксономическое разнообразие микроорганизмов на уровне родов, ассоциированных с пробами и накопительными культурами Горячинского месторождения подземных вод. Условные обозначения: 1 – проба № 1; 1/Fe/орг – первичная накопительная культура, полученная при добавлении ферригидрита и смеси органических кислот; 1/Fe/дрож – первичная накопительная культура, полученная при добавлении ферригидрита и дрожжевого экстракта; 1/водород ‒ накопительная культура диссимиляционных алкалотермофильных железоредукторов, с водородом как донором электронов; 1/пируват ‒ накопительная культура диссимиляционных алкалотермофильных железоредукторов, с пируватом как донором электронов; 2 – проба № 2; 2/Fe – первичная накопительная культура, полученная при добавлении ферригидрита; 3 – проба № 3; 3/Fe – первичная накопительная культура, полученная при добавлении ферригидрита.

 

Представители этого рода – термофильные аэробные сахаролитики, способные также к нитратредукции, являются типичной микрофлорой термальных источников, в частности, щелочных гидротерм Бурятии, но обнаружены и в восстановительных условиях подземных водоносных горизонтов (Будагаева, Бархутова, 2015; Raposo et al., 2019; Лукина и соавт., 2023).

Проба №1/ферригидрит/органические кислоты. При добавлении в качестве акцептора электронов синтезированного ферригидрита и смеси органических кислот в качестве доноров электронов состав микробного сообщества существенно изменился. На уровне филумов уменьшилась доля представителей Pseudomonadota и Nitrospirota, за счет увеличения доли представителей Bacillota (синоним Firmicutes),Sva0485 и Actinomycetota (рис. 1). На уровне семейств‒родов основу первичной накопительной культуры составляли филотипы, близкие к родам Desulfotomaculum (21.1% представленности), Meiothermus (12.3%) и некультивируемым представителям филума Sva0485 (14.7%) (рис. 2, табл. S1). Способность к органотрофной железоредукции показана для некоторых видов рода Desulfotomaculum, например, D. reducens MI-1 (Otwell et al., 2018). Представители некультивируемой группы Sva0485 были впервые обнаружены в биопленках шахты Ричмонд (Bond et al., 2020) и описаны как потенциальные восстановители сульфата или окисного железа. С тех пор многочисленные исследования подтвердили присутствие бактерий клады Sva0485 (относительная численность ≥5%) в кислых экосистемах, связанных с разработкой сульфидных руд (включая воду, осадки и биопленки) (Tan et al., 2019). В некоторых случаях численность этой группы достигала более 50% сообщества, как в случае осадков, отобранных в горе Сян (Китай) (Hao et al., 2007). Предпринятая недавно реконструкция четырех композитных геномов представителей этой клады, полученных из осадков шахтных вод нескольких разработок юго-восточного Китая, позволила реконструировать их метаболизм на основе геномных данных и выделить их в новый порядок в статусе Candidatus внутри группы Sva0485 ‒ Ca. Acidulodesulfobacterales (Tan et al., 2019). Согласно проведенному анализу геномов, представители этого порядка являются ацидофильными факультативно анаэробными автотрофами, которые, вероятно, используют кислород в качестве акцептора электронов и Fe(II) или сульфиды в качестве донора электронов при развитии в кислородсодержащих средах сульфидных месторождений – шахтных водах и на поверхности биопленки. В то же время они могут осуществлять диссимиляционное восстановление сульфатов или Fe(III) и брожение в анаэробных условиях внутри биопленок и осадков (Tan et al., 2019). Следует отметить, что помимо кислых экосистем, эта группа была обнаружена также в конкрециях гидроксидов железа из четвертичных отложений Японии (представленность 9.4%), неактивном глубоководном черном курильщике (представленность 12.3‒13.8%) и железистых осадках из пресноводного озера Товути (Индонезия) (представленность ~2‒20%) (Yoshida et al., 2008; Sylvan et al., 2012; Vuillemin et al., 2018), т.е. в экосистемах с нейтральными или слабощелочными условиями. Представители этой группы, но с низким (88%) уровнем идентичности, согласно анализу BLAST были идентифицированы нами в зоне питания верхнемелового водоносного горизонта Ессентукского месторождения минеральных вод. Вскрываемые воды этого участка – пресные, карбонатно-натриевого типа, теплые, оксигенированные, характеризуются повышенными значениями рН 8.5 (Zavarzina et al., в печати). Существенное накопление (до 14.7%) представителей этой группы в микрокосме с ферригидритом и органическими кислотами, по сравнению с исходной пробой (ниже пределов обнаружения метода), не только подтверждает высказанные ранее предположения о метаболических особенностях этой глубокой ветви бактерий, связанных с преобразованием минералов железа, но и существенно расширяет представления об их экологии.

Проба №1/ферригидрит/дрожжевой экстракт. При добавлении в качестве акцептора электронов синтезированного ферригидрита и донора электронов дрожжевого экстракта на уровне филумов еще больше возрастала доля представителей Bacillota, а вместо филума Sva0485 преимущество получили филотипы, относящиеся к филуму Thermotogota (рис. 1). На более низком таксономическом уровне было зафиксировано накопление филотипов, относящихся к родам Fervidobacterium (14.0% представленности), Thermincola (11.0%) и Desulfurispora (8.1%) (рис. 2, табл. S1), хотя в целом сообщество отличалось высоким таксономическим разнообразием и состояло из 25 родов, представленность которых составила не менее 1%. Накопление представителей вышеуказанных родов по сравнению с исходной пробой, где они не были зафиксированы, было отмечено и в микрокосме с ферригидритом и органическими кислотами, однако там их представленность составляла не более 2% (рис. 2, табл. S1). Представители рода Fervidobacterium являются облигатными анаэробами-органотрофами, использующими широкий спектр сахаров, полисахаридов и пептидов, в частности, дрожжевой экстракт, встречающиеся в местообитаниях, связанных с наземной вулканической активностью, характеризующихся температурами около 65°С и низкой соленостью (Podosokorskaya et al., 2011). Интересно, что все без исключения представители этого рода способны к облегченному восстановлению элементной серы, а для наиболее филогенетически близких к ним представителей рода Thermosypho была показана способность к облегченному брожению за счет восстановления соединений Fe(III) (Chen et al., 2021).

Хемоорганотрофные представители рода Thermincola широко распространены в различных экосистемах, и их метаболизм основан, в том числе, на железоредукции с использованием органических кислот, например, ацетата в качестве донора электронов (Zavarzina et al., 2007; Byrne-Bailey, 2010), кроме того, доказана их способность к электрогенезу (Marshall, May, 2009). Единственный известный на сегодняшний день представитель рода Desulfurispora ‒ анаэробная термофильная бактерия, способная к восстановлению различных серных соединений, но не к железоредукции с использованием в качестве донора электронов водорода, органических кислот, спиртов и некоторых сахаров (Kaksonen et al., 2007). Однако есть сообщения о накоплении представителей этого рода при восстановлении железосодержащих минералов – шверцманита и ярозита, осаждающихся на геохимическом барьере при смешении кислых вод с нейтральными в сульфидных месторождениях (Bao et al., 2018). Таким образом, в первичной накопительной культуре с добавлением дрожжевого экстракта в качестве дополнительного донора электронов преимущество получили термофильные анаэробные микроорганизмы, способные к анаэробному брожению и, возможно, использующие минералы трехвалентного железа для сброса избыточных электронов, а также хемооргано- и хемолитотрофные бактерии, использующие органические кислоты, прежде всего, ацетат, а также молекулярный водород, накапливающиеся при разложении сложных органических веществ, в качестве доноров электронов при железоредукции и способные к активному росту в условиях повышенных значений рН.

Проба № 2. Микробное сообщество пробы, отобранной с поверхности илистых осадков в 50 м ниже по течению ручья, образованного при каптаже скважины 1/76, отличалось большим по сравнению с пробой № 1 таксономическим разнообразием, и на уровне филумов (рис. 1), и на уровне семейств‒родов (рис. 2, табл. S1) преимущественно бактериальных таксонов. Археи в пробе составляли не более 0.1%. Также, как и в пробе № 1, в сообществе доминировали представители филума Pseudomonadota (28.6%), однако уменьшилась доля представителей филумов Nitrospirota (2.2%) и Acidobacteriota (2.7%), но увеличилась доля представителей филумов Chloroflexota (12.9%). Существенную долю в сообществе пробы № 2 составляли филотипы, относящиеся к филуму Desulfobacterota (11.0%), не обнаруженные в пробе № 1. Интересным оказался тот факт, что добавление к пробе воды и ила синтезированного ферригидрита с последующей инкубацией в течение 10 сут при 50°С практически не оказало влияния на исходный состав сообщества (вторая цифра в перечислении филумов ниже). На уровне филумов сообщества пробы № 2 и первичной накопительной культуры с ферригидритом были представлены: Nitrospirota (2.2‒2.4%), Pseudomonadota (28.6‒26.9%), Actinomycetota (2.9‒7.6%), Deinococcota (9.6‒11.7%), Acidobacteriota (2.7‒4.6%), Chloroflexota (12.9‒17.2%), Bacteroidota (8.7‒5.7%), Desulfobacterota (11.0‒8.0%), Sva0485 (0.8‒2.0%), Planctomycetota (2.8‒3.3%), Verrucomicrobiota (2.9‒1.3%), Cyanobacteria (4.6‒1.0 %) (рис. 1).

На более низком таксономическом уровне наиболее многочисленными в микробном составе исходной пробы и первичной накопительной культуры были филотипы, относящиеся к роду Meiothermus (9.5‒11.6%) и некультивируемым представителям семейств Anaerolineaceae (7.0‒7.9%) и Hydrogenophilaceae (5.6‒4.1%) (рис. 2, табл. S1). Сообщества также отличались высоким таксономическим разнообразием и состояли из 19 (проба № 2) и 24 (первичная накопительная культура) родов, представленность которых составила не менее 1.0%. При этом прочие минорные таксоны, относительная представленность которых была менее 1.0%, составили 48.6 и 38.3% микробного состава пробы № 2 и первичной накопительной культуры соответственно. Таким образом, можно предположить, что микробное сообщество илистых отложений в месте отбора пробы № 2 в большой степени состоит из органотрофов, и добавление ферригидрита не оказало на них существенного влияния, поскольку внесенный ил содержал достаточное количество органики, а ферригидрит, вероятно, восстанавливался преимущественно за счет облегченного брожения, при сбросе избыточных электронов.

Проба № 3. Микробное сообщество пробы, отобранной с глубины 10 см (восстановленный слой), также отличалось исключительно высоким биоразнообразием, но в целом имело большое сходство с пробой № 2 (рис. 1, 2, табл. S1). В этом случае добавление к пробе воды и ила синтезированного ферригидрита и инкубация в течение 10 сут при 50°С существенно сказались на максимально представленном в исходной пробе филотипе. Бактерии, относящиеся к роду Aeromonas (17% представленности в пробе № 3) в первичной накопительной культуре полностью элиминировались. Их заместили бактерии, близкие к роду Meiothermus (4.3‒16.6%). На уровне филумов микробный состав исходной пробы № 3 и накопительной культуры с ферригидритом были представлены: Nitrospirota (3.1‒2.8%), Pseudomonadota (26.6‒25.9%), Actinomycetota (3.9‒6.3%), Deinococcota (4.3‒16.6%), Acidobacteriota (1.9‒4.3%), Chloroflexota (16.2‒15.4%), Bacteroidota (8.7‒4.7%), Desulfobacterota (14.0‒8.5%), Sva0485 (2.7‒1.0%), Planctomycetota (2.7‒3.7%), ТА06 (1.9‒0.1%) (рис. 1).

Получение накопительных культур диссимиляционных алкалотермофильных железоредукторов

Для получения накопительных культур диссимиляционных алкалотермофильных железоредукторов была использована первичная накопительная культура пробы № 1 с добавлением в качестве дополнительных доноров электронов смеси органических кислот, поскольку в данном случае повышалась вероятность накопления микроорганизмов, способных к диссимиляционной железоредукции. Первичная накопительная культура была пересеяна на анаэробную среду (рН 9.0) с ферригидритом в качестве акцептора электронов и молекулярным водородом (10%, об.), формиатом, ацетатом, лактатом или пируватом, добавленных в концентрации 1 г/л, в качестве донора электронов. После 7 сут инкубации при 55°С были отобраны пробы для определения образовавшегося двухвалентного железа, измерения рН, морфологии преобладающих клеток (табл. 2).

 

Таблица 2. Основные характеристики процесса восстановления ферригидрита накопительными культурами алкалотермофильных железоредукторов, полученных из пробы № 1 после инкубации при 55°С

Донор	рН после инкубации	Цвет осадка	Магнитность осадка	Fe(II), мМ	Морфология преобладающих клеток
Молекулярный водород	8.88	Темно-коричневый	Магнитный	5.71	Короткие палочки, образующие плотные колонии на частицах минералов
Формиат	8.8	Темно-коричневый	Не магнитный	1.34	Короткие палочки, образующие плотные колонии на частицах минералов
Ацетат	8.67	Темно-коричневый	Сильно магнитный	4.38	Вибрионы и длинные палочки
Лактат	8.57	Черный	Сильно магнитный	6.53	Вибрионы и длинные палочки
Пируват	7.94	Черный	Сильно магнитный	6.98	Вибрионы и длинные палочки
Контроль	8.9	Коричневый	Не магнитный	0	Не обнаружено

 

Оценка филогенетического состава была проведена для накопительных культур, с наиболее интенсивным восстановлением ферригидрита (пируват) и с молекулярным водородом, в случае которого было возможно развитие автотрофных диссимиляционных железоредукторов. Результаты профилирования полученных сообществ по гену 16S рРНК выявили существенное сокращение микробного разнообразия в полученных накопительных культурах (рис. 1, 2, табл. S1).

В накопительной культуре с пируватом в качестве донора электронов 95.9% сообщества составляли 5 филотипов, четыре из которых относились к филуму Bacillota (рис. 2, табл. S1). Представители рода Clostridium составляли 39.2% сообщества и были наиболее близки к Petroclostridium xylanilyticum и некультивируемым представителям Desulfotomaculum sp. со сходством 99.63%. Поскольку P. xylanilyticum ‒ типичная анаэробная органотрофная бактерия, разлагающая ксилан и не способная к железоредукции (Zhang et al., 2018), вероятнее всего обнаруженный филотип является представителем рода Desulfotomaculum. Этот род грамположительных органотрофных бактерий, для которых была показана способность не только к сульфатредукции, но и восстановлению металлов, в частности железа. Например, D. reducens MI-1 способен к восстановлению растворимых соединений окисного железа, а также нерастворимых оксидов и гидроксидов за счет облегченного сбраживания пирувата (Dalla Vecchia et al., 2014). Неожиданным стало накопление в пробе филотипа, относящегося к группе OPB41, ‒ до недавнего времени некультивируемых представителей филума Actinomycetota (синоним Actinobacteriota). Первые культивируемые бактерии этой группы, представляющие два новых рода в новом порядке Anaerosomatales и семействе Anaerosomataсeae – Anaerosoma tenue и Parvivirga hydrogeniphila были выделены недавно из грязевых вулканов Тамани и водоносного горизонта Ессентукского месторождения минеральных вод (Khomyakova et al., 2022). Филотип, составляющий в накопительной культуре с пируватом 32% прочтений, имел сходство 99.6% с P. hydrogeniphila, т.е., скорее всего, являлся штаммом этого вида или новым видом (Yarza et al., 2014).

P. hydrogeniphila является термофильным анаэробом и облигатным автотрофным железоредуктором, использующим в качестве доноров электрона только молекулярный водород или формиат. Несмотря на то, что клетки этого филотипа имеют схожую морфологию и тенденцию к образованию колоний на минеральных частицах (рис. 3), характерные для P. hydrogeniphila, типовой штамм этого вида не способен развиваться при значениях рН выше 8.5 (Khomyakova et al., 2022).

 

Рис. 3. Микрофотографии алкалотермофильного представителя рода Parvivirga, колонизирующего частицы ферригидрита на среде с молекулярным водородом в качестве донора электронов; а ‒ фазово-контрастная микроскопия; б ‒ флуоресцентная микроскопия того же препарата, окрашенного акридиновым оранжевым. Масштабная линейка ‒ 10 мкм.

 

Филотип, близкий к роду Thermotalea, составлял в накопительной культуре 7.2% прочтений. Единственный представитель рода ‒ Thermotalea metallivorans – анаэробная органотрофная бактерия, способная восстанавливать гидроксиды железа и марганца (Ogg et al., 2009). Два остальных филотипа, составлявшие 9.1 и 8.4% прочтений, относились к глубокой некультивируемой ветви Bacillota и некультивируемому роду Dichloromethanomonas в статусе Candidatus, представители которого, как предполагается, способны к анаэробному разложению дихлорметана (Kleindienst et al., 2017).

Накопительная культура на водороде характеризовалась практически идентичным составом сообщества с пируватом (рис. 2, табл. S1), однако филотип, близкий к P. hydrogeniphila, составлял в нем уже 52.3%, филотип, родственный C andidatus Dichloromethanomonas, обнаружен в нем не был, а 36.8% сообщества составлял филотип, близкий к Meiothermus, который ранее детектировался в исходной пробе и пробе с добавлением ферригидрита и органических кислот, составляя в них 10.5 и 12.3% прочтений соответственно.

Экологическая интерпретация полученных результатов

Известно, что выход Горячинских терм приурочен к разлому субширотного простирания. Источником трехвалентного железа, как потенциального акцептора электронов, здесь могут выступать железосодержащие минералы кристаллических пород ‒ биотит, роговая обманка и амфибол или гидроокислы железа в песчаниках, составляющие до 10‒20% водовмещающих пород (Ломоносов, 1974). Крайне важным является факт, что поток холодных вод в районе Горячинских терм имеет радиальный характер и направлен к очагу разгрузки, который, таким образом, имеет локальный характер и обусловлен сосредоточенным поступлением термальной воды с глубины по узкой зоне дробления кристаллических пород верхнепротерозойского возраста (рис. 4) (Плюсин и соавт., 2013).

Питание и пополнение подземных вод в данном районе происходит за счет атмосферных осадков и, в меньшей степени, конденсационных вод. В отношении формирования азотных терм Горячинска большинство исследователей придерживаются инфильтрационной гипотезы, согласно которой пресные холодные воды, попадая по трещинам на глубину, под воздействием высоких температур агрессивно взаимодействуют с вмещающими породами, изменяя свой первоначальный катионно-анионный и газовый состав (Пиннекер, 1969; Ломоносов, 1974). Исходно кислородно-азотные по газовому составу, они расходуют кислород на окислительно-восстановительные реакции, в частности, с участием двухвалентного железа, и, постепенно нагреваясь, переходят в чистые азотные термальные воды. Микроэлементный состав термальных вод Горячинска близок к составу пород Баргузинского интрузивного комплекса, в то время как содержание органического вещества идентично таковому в поверхностных водах (Гановичева, 1969). По мнению И.С. Ломоносова (1974), современные азотные термы Горячинска представляют собой разубоженные инфильтрационными водами силикатные растворы, сбросившие основной рудный груз при подъеме на поверхность. Сделанные геологические и гидрогеологические заключения позволяют предположить, что в исследуемом районе существует несколько пространственно ограниченных экологических ниш, пригодных для развития алкалотермофильных прокариот. К первой (I на рис. 4) следует отнести узкий участок дробления протерозойских кристаллических пород и залегающего выше маломощного слоя песчаника, формирующие локальную зону разгрузки термальных вод, обеспечивающую возможность развития подземной термофильной микрофлоры. Вторая (II на рис. 4) поверхностная экониша формируется в русле ручья, образованного разгружающимися термальными щелочными водами. По мере удаления от скважины каменисто-песчаное дно ручья заиливается за счет разлагающихся остатков высшей растительности, чему в большой степени способствуют ванночки, огороженные камнями, сделанные посетителями терм. Эти две экониши практически не различаются по температуре и рН, но резко контрастны по содержанию органического вещества – подземная алкалотермофильная микрофлора развивается в олиготрофных условиях, поверхностная ‒ в эвтрофных.

 

Рис. 4. Схематичный геолого-гидрогеологический разрез зоны тектонического дробления в районе Горячинского курорта. Составлен по фондовым материалам “Проект округа горно-санитарной охраны курорта Горячинск Бурятской АССР. Гидрогеологическое управление “Геоминвод”. Комплексная гидрогеологическая пария. Москва, 1984 г.”. Условные обозначения: 1 – пески четвертичного возраста; 2 – песчаники базальные, полимиктовые четвертичного возраста; 3 – песчаники; 4 – пегматиты; 5 ‒ протерозойские плагиограниты; 6 – протерозойские гнейсоплагиограниты; 7 – протерозойские сиенит диориты и кварцевые диориты; 8 – гранодиориты; 9 – тектоническая брекчия карбонатизированная; 10 – пьезометрическая поверхность термальных и холодных вод; 11 – зона тектонического дробления и трещиноватости пород; 12 – изотермы через 5°C; 13 – направление движения холодных вод; 14 – направление движения горячих вод; 15 – зона развития алкалотермофильных микроорганизмов: I – подземная; II- наземная; 16‒18 ‒ конструкция скважины 1/76: 16 – обсадная труба; 17 – дырчатый фильтр; 18 – отстойник.

 

Наши исследования в существенной степени подтвердили существование этих контрастных экониш. В результате проведенных исследований удалось доказать присутствие в них бактерий, способных к железоредукции в условиях повышенных температур и значений рН. Восстановление ферригидрита в пробах № 2 и 3, содержащих илистые осадки, богатые органикой, осуществлялось в основном за счет процесса облегченного брожения. Этот вывод обоснован тем фактом, что добавление ферригидрита практически не оказало влияния на состав и соотношение филотипов микробного сообщества первичных накопительных культур по сравнению с исходными пробами, что указывает на преимущественное развитие в них органотрофных анаэробных бактерий, осуществляющих разложение углеводных и белковых соединений. Гораздо перспективнее в смысле получения чистых культур диссимиляционных алкалотермофильных железоредукторов выглядит проба № 1, отобранная у грифона скважины 1/76 (рис. S1а). Содержания органики в исходной пробе оказалось недостаточным для восстановления ферригидрита в первичной накопительной культуре, а внесение дополнительных доноров электронов – смеси органических кислот или дрожжевого экстракта привело к существенному изменению исходного микробного состава пробы и позволило выявить филотипы, с высокой вероятностью ответственные за осуществление железоредукции в исследуемых условиях. Действительно, таксоны наиболее близкие к доминирующим в первичных накопительных культурах филотипам – представители родов Desulfotomaculum, Thermincola, некультивируемой группы Sva0485, по литературным данным являются хемоорганотрофными бактериями, способными к восстановлению железа в анаэробных условиях (Zavarzina et al., 2007; Byrne-Bailey, 2010; Otwell et al., 2018; Tan et al., 2019). Накопление представителей некультивируемой группы Sva0485 в присутствии органических кислот и ферригидрита расширило знания о ее распространении, поскольку до сих пор филотипы этой группы обнаруживались в местообитаниях, связанных с циклами железа и серы, но характеризующихся кислыми или нейтральными условиями.

В результате проведенных исследований удалось получить несколько устойчивых накопительных культур алкалотермофильных бактерий, способных к диссимиляционной железоредукции за счет окисления молекулярного водорода или органических кислот при рН 9.0 и температуре 55°С. Существенное накопление представителей рода Parvivirga в литоавтотрофных условиях позволяет сделать несколько выводов об экологии этих микроорганизмов. Высокая специализация рода Parvivirga, заключающаяся в облигатной литоавтотрофной железоредукции (Khomyakova et al., 2022), как способе получения энергии, позволяет утверждать, что выявленный нами филотип является представителем подземной микрофлоры Горячинских гидротерм. Отсутствие подходящих доноров электронов, а также окислительные условия в месте отбора проб объясняют его низкую представленность в исходной пробе и первичных накопительных культурах, находящуюся на пределе чувствительности метода: 0.02, 0.07% (дрожжевой экстракт), 1% (органические кислоты). В присутствии молекулярного водорода в анаэробных условиях эта группа получила значительное преимущество и составляла больше 50% сообщества.

Таким образом, наши исследования подтвердили сделанное ранее предположение Nixon et al. (2022) об отсутствии термодинамических, биохимических или кинетических ограничений для осуществления железоредукции в условиях повышенных температур и значений рН и позволяют надеяться на получение в скором времени чистых культур первых диссимиляционых алкалотермофильных железоредукторов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работы по выделению накопительных и чистых культур и анализу данных выполнены при поддержке проекта РНФ № 24-64-00023. Молекулярные исследования ААК, ААМ проведены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

 

¹ Дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI статьи: https://doi.org/10.31857/S0026365624060124

作者简介

D. Zavarzina

FRC “Fundamentals for Biotechnology” of the RA Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: zavarzinatwo@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

俄罗斯联邦, Moscow, 119071

A. Klyukina

FRC “Fundamentals for Biotechnology” of the RA Sciences

Email: zavarzinatwo@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

俄罗斯联邦, Moscow, 119071

A. Merkel

FRC “Fundamentals for Biotechnology” of the RA Sciences

Email: zavarzinatwo@mail.ru

Winogradsky Institute of Microbiology

俄罗斯联邦, Moscow, 119071

T. Maslova

Gubkin Russian State University of Oil and Gas

Email: zavarzinatwo@mail.ru

Faculty of Chemical Engineering and Ecology

俄罗斯联邦, Moscow, 119991

A. Maslov

Lomonosov Moscow State University

Email: zavarzinatwo@mail.ru

Geological Faculty

俄罗斯联邦, Moscow, 119234

参考

补充文件