Новый галоалкалофильный представитель рода Salisediminibacterium, способный эффективно восстанавливать хромат

Полный текст

Хром — ценный поливалентный металл. Основным источником хрома в природе являются ультраосновные магматические породы. Известно порядка 40 хромсодержащих минералов (Николаев и соавт., 2021). В природе стабильными являются трех- и шестивалентная формы хрома (Cr(III) и Cr(VI), соответственно). Соединения Cr(III) малорастворимы и представлены в форме малоподвижного гидроксида (Liang et al., 2021), напротив, шестивалентный хром представлен преимущественно в форме подвижного аниона CrO₄^{2 –} (Водяницкий, 2009, Bartlett, 1991). Канцерогенный и мутагенный эффект Cr(VI) объясняется его высокой подвижностью и реакционной способностью (Pushkar et al., 2021). По некоторым оценкам, токсичность Cr(VI) в 100‒1000 раз выше, чем у Cr(III) (Dhal et al., 2013).

Основными производителями обогащенного феррохрома являются Южная Африка, Индия, Казахстан, Китай, Турция; на их долю приходится более 80% мировой добычи хромовой руды (Высоцкий, 2006). Широкое использование хрома в металлургической, кожевенной и химической промышленности сопряжено с образованием различных отходов. Годовой выброс хромсодержащих отходов достигает в Европе — 420 × 10³, Азии – 370 × 10³ и в Северной Америке — 290 × 10³ т Cr/год (Водяницкий, 2009). Большинство методов очистки отходов основаны на реакции восстановления Cr(VI) до Cr(III) с последующим осаждением c щелочами. Однако существующие химические и электрохимические методы очистки эффективны только в условиях высоких концентраций хрома, дорогостоящи и требуют повышенного внимания к образующимся продуктам очистки (Barrera-Diaz et al., 2012). Методы биоочистки являются перспективным направлением (Pradhan et al., 2017). Способность к восстановлению хроматов отмечается преимущественно у Proteobacretia, Firmicutes, Actinobacteria (Huang et al., 2017). Большинство исследований охватывают условия pH, близкие к нейтральным, и с малой соленостью. Поиск организмов, способных проводить реакцию восстановления Cr(VI) в щелочных соленых условиях, характерных для гальванических и кожевенных производств, является актуальной задачей на сегодняшний день.

В настоящей работе представлены результаты исследования фенотипических свойств, таксономического положения и особенностей восстановления токсичного хромата штамма Salisediminibacterium МВ1000.

Штамм MB1000 новой галоалкалофильной хроматредуцирующей бактерии был выделен из накопительной культуры нитратредуцирующих бактерий, инокулятом служили осадки содовых озер Кулундинской степи на минеральной среде с нитратом в аэробных условиях. Последующее разделение культур проводили в анаэробных условиях методом предельных разведений на жидкой модифицированной среде ЛБ* состава (г/л): Na₂CO₃ — 6.5; NaHCO₃ — 2; NaCl — 25; K₂HPO₄ – 0.5; MgSO₄ ∙ 7H₂0 — 0.1; NH₄Cl — 0.1; дрожжевой экстракт — 0.1; среда LB BD (USA) — 15; K₂CrO₄ – 3.8; ацетат натрия — 1. Далее штамм MB1000 поддерживали на минеральной среде без нитрата в аэробных условиях в среде состава (г/л): Na₂CO₃ – 13; NaHCO₃ — 4; NaCl — 50; K₂HPO₄ — 0.5; MgSO₄ ∙ 7H₂0 — 0.1; NH₄Cl — 0.1; дрожжевой экстракт — 0.1; ацетат натрия — 1.

Для определения филогенетического положения штамма MB1000 было проведено частичное секвенирование гена 16S рРНК (ЦКП “Биоинженерия”, ФИЦ Биотехнологии РАН) с универсальными праймерами 11f и 357f. Анализ полученной последовательности (933 п.н.) проведен в базе данных NCBI. Последовательность выделенного штамма была выровнена с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы Mafft v.7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html). Построение филогенетического древа реализовано в программе Mega6.

Световую микроскопию с фазовым контрастом проводили на микроскопе Olimpus ВХ41, оборудованном фотоаппаратурой. Электронную микроскопию проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400 (“Jeol”, Япония) с приставкой для рентгеновского микроанализа.

Количество биомассы определяли, измеряя оптическую плотность раствора при длине волны 600 нм на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometr basic.

Определение концентрации Cr(III) в формирующемся в процессе культивирования осадке определяли путем растворения осадка в 2н HCl с образованием окрашенных комплексов общей формулой [Cr(H₂O)₆]Cl₃. Cветопоглощение измеряли при длине волны 580 нм.

Определение концентрации Cr(VI) проводили дифенилкарбазидным методом (Лаврухина, Юкина, 1979) с изменениями (Шаповалова и соавт., 2009).

Эксперимент по установлению предельно допустимой концентрации хромата проводили на минеральных средах стандартного состава с разным количеством дрожжевого экстракта (50, 500 и 2500 мг/л) и концентрацией хрома — 15, 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л. На среде ЛБ* проверена возможность восстановления Cr(VI) в аэробных и анаэробных условиях c добавлением 100, 500 и 2000 мг Cr(VI)/л. В аэробном эксперименте посев проводили в пенициллиновые флаконы на 20 мл под ватную пробку. Анаэробные условия создавали путем вакуумирования и продувки аргоном пенициллиновых флаконов на 20 мл, герметично закрытых резиновыми пробками.

Мультисубстратное тестирование с использованием различных органических доноров электронов проведено анаэробно для лактата, ацетата, сахарозы и глицерина, в концентрации 1 г/л на минеральной среде. Исходная концентрация Cr(VI) — 50 мг/л. Также возможность восстановления была проверена для следующих анионов — нитрата, ванадата, селенита и хромата на минеральной среде в анаэробных условиях с ацетатом (1 г/л). Исходная концентрация нитрата — 1 г/л. Для остальных металлов концентрация — 50 мг Ме/л. Объем среды во всех экспериментах составлял 10 мл. Объем посевного материала, предварительно культивированного 2‒4 сут на минеральной среде — 0.1 мл. Культивирование проводили при 30C в статичных условиях. Все эксперименты выполнены в 3-х кратной повторности. В качестве контроля использовали среды со всеми добавками без бактерий (химический контроль) или с бактериями, но без донора/акцептора электронов (биологический контроль).

Клетки выделенного штамма MB1000 подвижные, имеют палочковидную форму (0.5‒0.6 × × 2.3‒2.7 мкм), в присутствии хромата в среде образуют биопленку. Проведенный филогенетический анализ показал, что штамм MB1000 относится к роду Salisediminibacterium семейства Bacillaceae. Согласно результатам сравнения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с базой данных NCBI Blast, наибольший уровень сходства на основании нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК установлен с Salisediminibacterium beveridgei (сходство нуклеотидной последовательности 99.46%) (Baesman et al., 2009) и Salisediminibacterium selenitireducens 98.71% (Blum et al., 1998) (рис. 1).

 

Рис. 1. Положение штамма MB1000 на филогенетическом древе представителей семейства Bacilliaceae. Филогенетическое древо построено методом ближайших соседей (Neighbour-Joining) с использованием бутстреп-анализа на 100 альтернативных филогенетических деревьев. Значения бутстреп-анализа меньше 50% скрыты.

 

Культивирование на минеральных средах с различным содержанием дрожжевого экстракта и Cr(VI) в анаэробных условиях показало, что с увеличением концентрации органического вещества в среде увеличивается скорость и эффективность процесса восстановления хроматов. Также увеличивается значение максимальной концентрации Cr(VI) в среде, при которой идет активный рост штамма MB1000. Так, на минеральной среде, содержащей 100 мг дрожжевого экстракта, штамм MB1000 восстанавливал до 99.9% от исходных 15 мг Cr(VI)/л и до 37.5, 30.4 и 7.9% от исходных 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л за 3 сут. В то же время, при концентрации дрожжевого экстракта 2500 мг/л выделенный штамм восстанавливает до 87.7, 99.9, 99.4 и 74.9% Cr(VI) от исходных 15, 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л за 3 сут, соответственно. На среде, содержащей 500 мг дрожжевого экстракта, получены промежуточные значения восстановительной активности.

При сравнении роста и восстановительной активности штамма MB1000 на среде ЛБ* в аэробных и в анаэробных условиях показано, что при начальной концентрации 100 и 500 мг Cr(VI)/л за 3 сут восстанавливается до 99.7 и 20.8% Cr(VI) в анаэробных условиях и до 98.4 и 47.7% в аэробных, соответственно. При начальной концентрации 2000 мг Cr(VI)/л за 2 месяца культивирования восстанавливается 14.9% Cr(VI) в анаэробных условиях и 79.5% в аэробных.

В результате мультисубстратного тестирования показана возможность роста штамма MB1000 на лактате, ацетате, сахарозе и глицерине в качестве единственного донора электрона и хромате в качестве акцептора. При этом восстанавливается до 50.3, 32.1, 99.8, 56.4% от исходных 50 мг Cr(VI)/л в минеральной среде в анаэробных условиях. В анаэробных условиях штамм MB1000 способен использовать в качестве акцептора электронов, помимо хромата, также ванадат, нитрат и селенит в присутствии ацетата.

В процессе культивирования штамма MB1000 на средах с хромом на дне пенициллиновых флаконов накапливается органоминеральный осадок серо-фиолетового цвета. Последовательное 4-х кратное низкоскоростное центрифугирование (200 g, 5‒10 с) позволяет частично разделить осадок на компоненты: биомассу (остающуюся во взвешенном состоянии) и минеральный осадок. Результаты рентгеновского микроанализа показывают значительное содержание хрома в минеральной фракции осадка (рис 2.).

 

Рис. 2. Рентгеновский микроанализ минерального осадка.

 

При растворении этого осадка в 2н HCl образуется окрашенный голубовато-зеленый раствор. Спектрофотометрический анализ показывает, что полученный раствор имеет максимумы поглощения при длине волны 324, 418 и 528 нм. Пики при 418 и 528 нм соответствуют максимумам поглощения химически чистого раствора CrCl₃ ∙ 6H₂O, что подтверждает локализацию восстановленного Cr(III) в минеральной фракции образующегося осадка.

Таким образом, выделенный из щелочных осадков штамм MB1000 является факультативно анаэробным галоалкалофильным хемогетеротрофом. Ранее описанные представители рода Salisediminibacterium были выделены из осадков щелочных водоемов — S. selenitireducens MLS10 и S. beveridgei MLTejB из Mono Lake (США), S. halotolerans halo-2 из Xiarinaoer lake (Китай), S. haloalkalitolerans 10nlg Lonar lake (Индия) и 7 штаммов S. locisalis из содовых озер Chagannor (Китай), Natron (Танзания), Elmenteita (Кения) (Márquez et al., 2011; Gupta et al., 2020). Специфичной особенностью штамма MB1000 является рост на хромате в анаэробных условиях на соленых щелочных минеральных и органических средах. Штамм S. beveridgei MLTejB на хромате не растет, а в случае остальных штаммов это свойство не проверялось. Таким образом, эта способность впервые выявлена у представителей рода Salisediminibacterium. Штамм MB1000 способен расти на нитрате (как и S. selenitireducens, S. beveridgei, S. haloalkalitolerans), селените (как и S. selenitireducens, S. beveridgei) и ванадате (для всех остальных не проверялось). Полученные результаты дают предпосылки к использованию выделенного организма для биоочистки сточных вод гальванических и некоторых химических производств в условиях высокой щелочности, солености и сложного непостоянного состава среды.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. В. Игнатенко

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ Биотехнологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: khijniaktv@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

Т. В. Хижняк

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ Биотехнологии РАН

Email: khijniaktv@yandex.ru
Россия, Москва, 119071

Список литературы

Дополнительные файлы