A New Haloalkaliphilic Member of the Genus Salisediminibacterium Capable of Efficient Chromate Oxidation

Full Text

Хром — ценный поливалентный металл. Основным источником хрома в природе являются ультраосновные магматические породы. Известно порядка 40 хромсодержащих минералов (Николаев и соавт., 2021). В природе стабильными являются трех- и шестивалентная формы хрома (Cr(III) и Cr(VI), соответственно). Соединения Cr(III) малорастворимы и представлены в форме малоподвижного гидроксида (Liang et al., 2021), напротив, шестивалентный хром представлен преимущественно в форме подвижного аниона CrO₄^{2 –} (Водяницкий, 2009, Bartlett, 1991). Канцерогенный и мутагенный эффект Cr(VI) объясняется его высокой подвижностью и реакционной способностью (Pushkar et al., 2021). По некоторым оценкам, токсичность Cr(VI) в 100‒1000 раз выше, чем у Cr(III) (Dhal et al., 2013).

Основными производителями обогащенного феррохрома являются Южная Африка, Индия, Казахстан, Китай, Турция; на их долю приходится более 80% мировой добычи хромовой руды (Высоцкий, 2006). Широкое использование хрома в металлургической, кожевенной и химической промышленности сопряжено с образованием различных отходов. Годовой выброс хромсодержащих отходов достигает в Европе — 420 × 10³, Азии – 370 × 10³ и в Северной Америке — 290 × 10³ т Cr/год (Водяницкий, 2009). Большинство методов очистки отходов основаны на реакции восстановления Cr(VI) до Cr(III) с последующим осаждением c щелочами. Однако существующие химические и электрохимические методы очистки эффективны только в условиях высоких концентраций хрома, дорогостоящи и требуют повышенного внимания к образующимся продуктам очистки (Barrera-Diaz et al., 2012). Методы биоочистки являются перспективным направлением (Pradhan et al., 2017). Способность к восстановлению хроматов отмечается преимущественно у Proteobacretia, Firmicutes, Actinobacteria (Huang et al., 2017). Большинство исследований охватывают условия pH, близкие к нейтральным, и с малой соленостью. Поиск организмов, способных проводить реакцию восстановления Cr(VI) в щелочных соленых условиях, характерных для гальванических и кожевенных производств, является актуальной задачей на сегодняшний день.

В настоящей работе представлены результаты исследования фенотипических свойств, таксономического положения и особенностей восстановления токсичного хромата штамма Salisediminibacterium МВ1000.

Штамм MB1000 новой галоалкалофильной хроматредуцирующей бактерии был выделен из накопительной культуры нитратредуцирующих бактерий, инокулятом служили осадки содовых озер Кулундинской степи на минеральной среде с нитратом в аэробных условиях. Последующее разделение культур проводили в анаэробных условиях методом предельных разведений на жидкой модифицированной среде ЛБ* состава (г/л): Na₂CO₃ — 6.5; NaHCO₃ — 2; NaCl — 25; K₂HPO₄ – 0.5; MgSO₄ ∙ 7H₂0 — 0.1; NH₄Cl — 0.1; дрожжевой экстракт — 0.1; среда LB BD (USA) — 15; K₂CrO₄ – 3.8; ацетат натрия — 1. Далее штамм MB1000 поддерживали на минеральной среде без нитрата в аэробных условиях в среде состава (г/л): Na₂CO₃ – 13; NaHCO₃ — 4; NaCl — 50; K₂HPO₄ — 0.5; MgSO₄ ∙ 7H₂0 — 0.1; NH₄Cl — 0.1; дрожжевой экстракт — 0.1; ацетат натрия — 1.

Для определения филогенетического положения штамма MB1000 было проведено частичное секвенирование гена 16S рРНК (ЦКП “Биоинженерия”, ФИЦ Биотехнологии РАН) с универсальными праймерами 11f и 357f. Анализ полученной последовательности (933 п.н.) проведен в базе данных NCBI. Последовательность выделенного штамма была выровнена с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы Mafft v.7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html). Построение филогенетического древа реализовано в программе Mega6.

Световую микроскопию с фазовым контрастом проводили на микроскопе Olimpus ВХ41, оборудованном фотоаппаратурой. Электронную микроскопию проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400 (“Jeol”, Япония) с приставкой для рентгеновского микроанализа.

Количество биомассы определяли, измеряя оптическую плотность раствора при длине волны 600 нм на спектрофотометре Eppendorf BioSpectrometr basic.

Определение концентрации Cr(III) в формирующемся в процессе культивирования осадке определяли путем растворения осадка в 2н HCl с образованием окрашенных комплексов общей формулой [Cr(H₂O)₆]Cl₃. Cветопоглощение измеряли при длине волны 580 нм.

Определение концентрации Cr(VI) проводили дифенилкарбазидным методом (Лаврухина, Юкина, 1979) с изменениями (Шаповалова и соавт., 2009).

Эксперимент по установлению предельно допустимой концентрации хромата проводили на минеральных средах стандартного состава с разным количеством дрожжевого экстракта (50, 500 и 2500 мг/л) и концентрацией хрома — 15, 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л. На среде ЛБ* проверена возможность восстановления Cr(VI) в аэробных и анаэробных условиях c добавлением 100, 500 и 2000 мг Cr(VI)/л. В аэробном эксперименте посев проводили в пенициллиновые флаконы на 20 мл под ватную пробку. Анаэробные условия создавали путем вакуумирования и продувки аргоном пенициллиновых флаконов на 20 мл, герметично закрытых резиновыми пробками.

Мультисубстратное тестирование с использованием различных органических доноров электронов проведено анаэробно для лактата, ацетата, сахарозы и глицерина, в концентрации 1 г/л на минеральной среде. Исходная концентрация Cr(VI) — 50 мг/л. Также возможность восстановления была проверена для следующих анионов — нитрата, ванадата, селенита и хромата на минеральной среде в анаэробных условиях с ацетатом (1 г/л). Исходная концентрация нитрата — 1 г/л. Для остальных металлов концентрация — 50 мг Ме/л. Объем среды во всех экспериментах составлял 10 мл. Объем посевного материала, предварительно культивированного 2‒4 сут на минеральной среде — 0.1 мл. Культивирование проводили при 30C в статичных условиях. Все эксперименты выполнены в 3-х кратной повторности. В качестве контроля использовали среды со всеми добавками без бактерий (химический контроль) или с бактериями, но без донора/акцептора электронов (биологический контроль).

Клетки выделенного штамма MB1000 подвижные, имеют палочковидную форму (0.5‒0.6 × × 2.3‒2.7 мкм), в присутствии хромата в среде образуют биопленку. Проведенный филогенетический анализ показал, что штамм MB1000 относится к роду Salisediminibacterium семейства Bacillaceae. Согласно результатам сравнения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с базой данных NCBI Blast, наибольший уровень сходства на основании нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК установлен с Salisediminibacterium beveridgei (сходство нуклеотидной последовательности 99.46%) (Baesman et al., 2009) и Salisediminibacterium selenitireducens 98.71% (Blum et al., 1998) (рис. 1).

 

Рис. 1. Положение штамма MB1000 на филогенетическом древе представителей семейства Bacilliaceae. Филогенетическое древо построено методом ближайших соседей (Neighbour-Joining) с использованием бутстреп-анализа на 100 альтернативных филогенетических деревьев. Значения бутстреп-анализа меньше 50% скрыты.

 

Культивирование на минеральных средах с различным содержанием дрожжевого экстракта и Cr(VI) в анаэробных условиях показало, что с увеличением концентрации органического вещества в среде увеличивается скорость и эффективность процесса восстановления хроматов. Также увеличивается значение максимальной концентрации Cr(VI) в среде, при которой идет активный рост штамма MB1000. Так, на минеральной среде, содержащей 100 мг дрожжевого экстракта, штамм MB1000 восстанавливал до 99.9% от исходных 15 мг Cr(VI)/л и до 37.5, 30.4 и 7.9% от исходных 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л за 3 сут. В то же время, при концентрации дрожжевого экстракта 2500 мг/л выделенный штамм восстанавливает до 87.7, 99.9, 99.4 и 74.9% Cr(VI) от исходных 15, 30, 70 и 120 мг Cr(VI)/л за 3 сут, соответственно. На среде, содержащей 500 мг дрожжевого экстракта, получены промежуточные значения восстановительной активности.

При сравнении роста и восстановительной активности штамма MB1000 на среде ЛБ* в аэробных и в анаэробных условиях показано, что при начальной концентрации 100 и 500 мг Cr(VI)/л за 3 сут восстанавливается до 99.7 и 20.8% Cr(VI) в анаэробных условиях и до 98.4 и 47.7% в аэробных, соответственно. При начальной концентрации 2000 мг Cr(VI)/л за 2 месяца культивирования восстанавливается 14.9% Cr(VI) в анаэробных условиях и 79.5% в аэробных.

В результате мультисубстратного тестирования показана возможность роста штамма MB1000 на лактате, ацетате, сахарозе и глицерине в качестве единственного донора электрона и хромате в качестве акцептора. При этом восстанавливается до 50.3, 32.1, 99.8, 56.4% от исходных 50 мг Cr(VI)/л в минеральной среде в анаэробных условиях. В анаэробных условиях штамм MB1000 способен использовать в качестве акцептора электронов, помимо хромата, также ванадат, нитрат и селенит в присутствии ацетата.

В процессе культивирования штамма MB1000 на средах с хромом на дне пенициллиновых флаконов накапливается органоминеральный осадок серо-фиолетового цвета. Последовательное 4-х кратное низкоскоростное центрифугирование (200 g, 5‒10 с) позволяет частично разделить осадок на компоненты: биомассу (остающуюся во взвешенном состоянии) и минеральный осадок. Результаты рентгеновского микроанализа показывают значительное содержание хрома в минеральной фракции осадка (рис 2.).

 

Рис. 2. Рентгеновский микроанализ минерального осадка.

 

При растворении этого осадка в 2н HCl образуется окрашенный голубовато-зеленый раствор. Спектрофотометрический анализ показывает, что полученный раствор имеет максимумы поглощения при длине волны 324, 418 и 528 нм. Пики при 418 и 528 нм соответствуют максимумам поглощения химически чистого раствора CrCl₃ ∙ 6H₂O, что подтверждает локализацию восстановленного Cr(III) в минеральной фракции образующегося осадка.

Таким образом, выделенный из щелочных осадков штамм MB1000 является факультативно анаэробным галоалкалофильным хемогетеротрофом. Ранее описанные представители рода Salisediminibacterium были выделены из осадков щелочных водоемов — S. selenitireducens MLS10 и S. beveridgei MLTejB из Mono Lake (США), S. halotolerans halo-2 из Xiarinaoer lake (Китай), S. haloalkalitolerans 10nlg Lonar lake (Индия) и 7 штаммов S. locisalis из содовых озер Chagannor (Китай), Natron (Танзания), Elmenteita (Кения) (Márquez et al., 2011; Gupta et al., 2020). Специфичной особенностью штамма MB1000 является рост на хромате в анаэробных условиях на соленых щелочных минеральных и органических средах. Штамм S. beveridgei MLTejB на хромате не растет, а в случае остальных штаммов это свойство не проверялось. Таким образом, эта способность впервые выявлена у представителей рода Salisediminibacterium. Штамм MB1000 способен расти на нитрате (как и S. selenitireducens, S. beveridgei, S. haloalkalitolerans), селените (как и S. selenitireducens, S. beveridgei) и ванадате (для всех остальных не проверялось). Полученные результаты дают предпосылки к использованию выделенного организма для биоочистки сточных вод гальванических и некоторых химических производств в условиях высокой щелочности, солености и сложного непостоянного состава среды.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. V. Ignatenko

Winogradsky Institute of Microbiology, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: khijniaktv@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119071

T. V. Khijniak

Winogradsky Institute of Microbiology, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: khijniaktv@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119071

References

Supplementary files