Влияние стоков очистных сооружений на распространение антибиотикорезистентных микроорганизмов в водной среде

Полный текст

Микроорганизмы играют решающую роль в экосистемах пресных водоемов. Однако структура водных микробных сообществ весьма лабильна и подвержена как естественным природным, так и антропогенным факторам. Постоянно повышающийся уровень антимикробных препаратов в окружающей среде в настоящее время является глобальной экологической проблемой, поскольку приводит к селекции резистентных к ним бактерий и появлению новых детерминант устойчивости. Реки являются важным связующим звеном между городскими и сельскими экосистемами. Антимикробные препараты и антибиотикоустойчивые микроорганизмы попадают в водную среду путем сброса сточных вод очистных сооружений в поверхностные или грунтовые воды, ливневых стоков с сельскохозяйственных угодий, а также в результате применения антибиотиков в аквакультуре (Carvalho, Santos, 2016). В России работы по изучению загрязнения водной среды фармацевтическими препаратами начаты в 2009 году исследованиями Института водных проблем РАН. В ходе исследований 2009‒2013 годов на водных объектах-источниках питьевого водоснабжения и водозаборах водоочистных сооружений г. Москва были выявлены соединения, проявляющие бактерицидную активность (например, ампициллин, тетрациклин, ципрофлоксацин и другие) (Barenboim, Kozlova, 2018).

Река Ока с площадью водосбора 245 тыс. км² и общей длиной 1500 км является рыбохозяйственным водным объектом высшей категории. Ниже г. Серпухов р. Ока, в соответствии с удельным комбинаторным индексом загрязненности воды (УКИЗВ), относится к 4 классу качества, разряда “А” (грязная). Загрязнение поверхностных вод бассейна Оки связано с повышенным содержанием соединений азота, фосфора и органических веществ, что обычно обусловлено естественными условиями формирования речного стока и антропогенной нагрузкой промышленных и сельскохозяйственных предприятий (Джамалов и соавт., 2017). Город Пущино Московской области (около 20 тысяч населения) не содержит на своей территории крупных производств, поэтому основным источником попадания в водную среду антибиотиков и антибиотикорезистентных штаммов служат коммунально-бытовые сточные воды.

Целью работы являлось изучение влияния сточных вод очистных сооружений г. Пущино на изменение состава микробного сообщества на примере бактерий рода Pseudomonas, а также на содержание в воде и седиментах реки Ока антибиотикорезистентных микроорганизмов и детерминант множественной лекарственной устойчивости.

Три пляжа в окрестностях г. Пущино были выбраны для отбора проб воды и седиментов: городской пляж г. Пущино (№ 2), пляж отеля Царьград (№ 1), расположенный в 3 км вверх по течению, и малопосещаемый пляж в 1.8 км вниз по течению (№ 3), расположенный приблизительно в 250 м вниз от стока очистных сооружений г. Пущино в Оку. Пляж отеля Царьград, который на момент отбора проб был больше года закрыт для посещения, выбран в качестве контрольной точки минимального антропогенного воздействия. Пробы воды на глубине 0.5 м и донных отложений у береговой линии под слоем воды 5 см были взяты из трех точек с каждого исследуемого сайта. Температура воды всех трех сайтов была 24C, температура воздуха ‒ от 24 до 26.2C. Штаммы выращивали при 28C на агаризованной среде LB (Sambrook et al., 1989), как без антибиотика, так и с добавлением одного из следующих антибиотиков: меропенем (40 мкг/мл), цефтазидим (40 мкг/мл), цефепим (40 мкг/мл), тетрациклин (30 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гентамицин (10 мкг/мл). Концентрации антибиотиков подбирали в соответствии с работой (Кошелева и соавт., 2021). Общую численность культивируемых микроорганизмов, культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов и псевдомонад определяли методом прямого высева серии разведений в трех повторах для каждой пробы, как было описано ранее (Кошелева и соавт., 2021). Общ ая численность культивируемых микроорганизмов (ОЧМ) на LB-агаре без антибиотика была одного порядка и составила 1.59 × 10³ ± 30 КОЕ/мл для пляжа № 1, 1.35 × 10³ ± 10 и 2.69 × 10³ ± 30 для пляжей № 2 и № 3, соответственно. ОЧМ в пробах седиментов также была схожа между собой и составила 1.16 × 10⁵ ± 1.5 × 10³ КОЕ/мл для пляжа № 1, 2.75 × 10⁵ ± 2.5 × 10³ и 4.45 × 10⁵ ± 10³ для пляжей № 2 и № 3, соответственно. Таким образом, стоки очистных сооружений практически не влияют на общую численность культивируемых микроорганизмов.

Численность культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Общая численность антибиотикоустойчивых микроорганизмов (КОЕ/мл образца), изолированных методом прямого высева из проб седиментов (а) и воды (б) реки Ока. Tc ‒ тетрациклин, Km ‒ канамицин, Sm ‒ стрептомицин, Gm — гентамицин, Caz — цефтазидим, Fep — цефепим, Mer — меропенем.

 

Обнаружено почти десятикратное увеличение содержания микроорганизмов, устойчивых к аминогликозидам (канамицину, стрептомицину и гентамицину) в пробах воды, отобранных ниже сброса сточных вод очистных сооружений. Микроорганизмы, устойчивые к цефалоспоринам III и IV поколения, были обнаружены во всех пробах, однако их концентрация также была выше в воде зоны пляжа № 3. Крайне низкая численность микроорганизмов, устойчивых к тетрациклину (1‒2 КОЕ/мл) в образцах воды и седиментов всех трех зон может свидетельствовать об отсутствии загрязнения исследуемого участка р. Оки отходами животноводства (рис. 1). Ранее нами было показано, что, в то время как обработка сточных вод очистными сооружениями г. Пущино приводила к значительному снижению численности микроорганизмов, устойчивых к тетрациклину, то для микроорганизмов, устойчивых к канамицину, стрептомицину и хлорамфениколу, общая численность была сходной и не изменялась на всех стадиях очистки (Кошелева и соавт., 2021). В случае гентамицина численность в процессе очистки даже слегка возрастала, что, вероятно, связано с участием мобильных генетических элементов в распространении GmR^–фенотипа. Таким образом, наблюдается корреляция между всплеском численности микроорганизмов, устойчивых к аминогликозидам, в воде пляжа № 3 и поступаемыми в реку очищенными сточными водами.

Пресноводные псевдомонады могут быть постоянными или эфемерными членами различных микробных консорциумов в городском водном цикле. Ранее нами было показано, что одними из наиболее часто встречающихся культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов в очистных сооружениях г. Пущино являются бактерии рода Pseudomonas (Кошелева и соавт., 2021). Из проб воды и седиментов с трех исследуемых пляжей на среде для выделения псевдомонад (PIA) были изолированы микроорганизмы, которые дополнительно проверяли на способность к флуоресценции на среде King B и устойчивость к используемым антибиотикам. Анализ антибиотикорезистентности исследуемых штаммов показал, что только 16% культивируемых штаммов псевдомонад, изолированных из проб пляжа отеля Царьград, устойчивы к трем и более используемым антибиотикам, а 18% — чувствительны ко всем используемым. Для городского пляжа и пляжа за очистными сооружениями эти доли достигали 47 и 17%, и 75 и 1.5%, соответственно. Очевидно влияние стоков очистных сооружений на распространение мультирезистентных штаммов.

Для выявления в пробах эубактерий и псевдомонад проводили количественную ПЦР (qPCR) с парами праймеров к фрагменту гена 16S рРНК бактерий — S-D-Bact-0907-a-S-20 и S-D-Bact-1054-a-A-20 (Leser et al., 2002) и к гипервариабельной области V3‒V4 гена 16S рРНК Pseudomonas spp. — Pse435F и Pse686R (Bergmark et al., 2012). ДНК из образцов воды и седиментов выделяли с использованием ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit (“Zymo Research”, США) по протоколу фирмы-производителя. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (“Thermo Scientific”, США), согласно протоколу фирмы-изготовителя. ПЦР в реальном времени осуществляли в циклере ДТлайт 4 (“ДНК-Технология”, Россия) с использованием 2.5-кратной реакционной смеси (“Синтол”, Россия), согласно инструкции производителя. Значения порогового цикла (Ct) рассчитывали, как среднее из 3-х повторов для каждого образца. Для построения стандартной кривой использовали серии 10-кратных разведений фрагментов гена 16S рРНК Pseudomonas putida и Citrobacter freundii. Эффективность ПЦР составила 86‒99%, коэффициент детерминации R2 > 0.99. После пересчета с использованием стандартов результаты выражали как число рибосомальных оперонов на 1 г образца. Результаты qPCR демонстрируют схожее содержание как эубактерий, так и псевдомонад в пробах воды исследованных участков (табл. 1).

 

Таблица 1. Количественное определение двух групп микроорганизмов методом qPCR в пробах воды и седиментов реки Оки

Пробы		Численность копий микробных генов 16S рРНК на 1 г образца, оцененная с помощью количественной ПЦР		Соотношение численности Pseudomonas к общему числу Eubacteria (%)
		Eubacteria	Pseudomonas
Пляж отеля Царьград (№ 1)	Вода	2.60 × 106	2.40 × 104	0.92
	Седименты	1.87 × 106	3.71 × 104	1.99
Городской пляж (№ 2)	Вода	2.43 × 106	2.12 × 104	0.87
	Седименты	2.14 × 106	5.38 × 104	2.52
Пляж за очистными сооружениями (№ 3)	Вода	2.60 × 106	2.25 × 104	0.87
	Седименты	4.83 × 106	2.23 × 105	4.62

 

Однако в пробах седиментов пляжа № 3, испытывающего влияние стоков очистных сооружений г. Пущино, обнаружено повышенное содержание как эубактерий (в 2.5 раза по сравнению с контрольным пляжем), так и бактерий рода Pseudomonas (в 6 раз). Процентное содержание псевдомонад от общего количества эубактерий было также самое большое в пробах седиментов пляжа № 3. Таким образом, стоки очистных сооружений влияют как на общее содержание эубактерий в донных отложениях, так и увеличивают процентное содержание пседвомонад в них (в том числе культивируемых мультирезистентных штаммов), изменяя, тем самым, состав микробного сообщества.

Сточные воды очистных сооружений, помимо влияния на состав микробных сообществ, могут являться источником антимикробных препаратов и микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам. Образцы ДНК из проб воды и седиментов исследуемых участков реки Оки тестировали методом ПЦР на наличие генов, ассоциированных с интегронами I-го типа: гена интегразы, intI1, гена устойчивости к четвертичным аммонийным соединениям, qacE/qacΔE1 (Кошелева и соавт., 2021), и R-плазмид группы несовместимости А/С (IncA/C) (Johnson et al., 2007). Считается, что интегронам класса I принадлежит ведущая роль в распространении множественной лекарственной устойчивости (Partridge et al., 2018). Плазмиды IncA/C преобладают среди патогенных штаммов Enterobacteriaceae и отвечают за распространение клинически значимых генов устойчивости: цефалоспориназы, blaCMY, и карбапенемазы, blaNDM, а также несут детерминанты устойчивости к фторхинолонам, аминогликозидам и др. (Carattoli et al., 2012). Маркерные последовательности на наличие интегронов I-го типа были обнаружены во всех исследованных образцах; причем методом количественной ПЦР в реальном времени не удалось выявить существенную разницу между “чистым” пляжем отеля Царьград и пляжем, испытывающим влияние очистных сооружений г. Пущино. Напротив, ампликоны repA IncA/C плазмид были обнаружены только в пробах воды пляжа № 3, что свидетельствует в пользу вклада очистных сооружений в распространение плазмид резистентности этой группы в водной среде.

Таким образом, в работе продемонстрировано влияние очистных сооружений на микробное сообщество водного бассейна р. Ока, в том числе на культивируемую антибиотикоустойчивую часть микробного сообщества, а также на распространение IncA/C плазмид резистентности в водной среде.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № FMRM-2022-0014).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Т. Ю. Измалкова

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatiz@pbcras.ru
Россия, Московская область, Пущино, 142290

О. И. Сазонова

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Email: tatiz@pbcras.ru
Россия, Московская область, Пущино, 142290

И. А. Кошелева

ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Email: tatiz@pbcras.ru
Россия, Московская область, Пущино, 142290

Список литературы

Дополнительные файлы