Effect of Treated Wastewater on the Distribution of Antyibiotic-Resistant Microorganisms in the Aquatic Environment

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The effect of waste treatment plants in Pushchino, Russia on abundance of antibiotic-resistant microorganisms and determinants of multiple drug resistance in the Oka River water and sediments was investigated. Treated wastewater was found to contribute to contamination of the Oka surface water layer with aminoglycoside-resistant strains. The role of Pushchino waste treatment plants in the dissemination of multidrug-resistant strains and plasmids of the А/С incompatibility groups (IncA/C) was demonstrated. Waste treatment plants were shown to affect both the total abundance of eubacteria in sediments and to assect their composition, increasing the relative abundance of pseudomonads.

Full Text

Микроорганизмы играют решающую роль в экосистемах пресных водоемов. Однако структура водных микробных сообществ весьма лабильна и подвержена как естественным природным, так и антропогенным факторам. Постоянно повышающийся уровень антимикробных препаратов в окружающей среде в настоящее время является глобальной экологической проблемой, поскольку приводит к селекции резистентных к ним бактерий и появлению новых детерминант устойчивости. Реки являются важным связующим звеном между городскими и сельскими экосистемами. Антимикробные препараты и антибиотикоустойчивые микроорганизмы попадают в водную среду путем сброса сточных вод очистных сооружений в поверхностные или грунтовые воды, ливневых стоков с сельскохозяйственных угодий, а также в результате применения антибиотиков в аквакультуре (Carvalho, Santos, 2016). В России работы по изучению загрязнения водной среды фармацевтическими препаратами начаты в 2009 году исследованиями Института водных проблем РАН. В ходе исследований 2009‒2013 годов на водных объектах-источниках питьевого водоснабжения и водозаборах водоочистных сооружений г. Москва были выявлены соединения, проявляющие бактерицидную активность (например, ампициллин, тетрациклин, ципрофлоксацин и другие) (Barenboim, Kozlova, 2018).

Река Ока с площадью водосбора 245 тыс. км2 и общей длиной 1500 км является рыбохозяйственным водным объектом высшей категории. Ниже г. Серпухов р. Ока, в соответствии с удельным комбинаторным индексом загрязненности воды (УКИЗВ), относится к 4 классу качества, разряда “А” (грязная). Загрязнение поверхностных вод бассейна Оки связано с повышенным содержанием соединений азота, фосфора и органических веществ, что обычно обусловлено естественными условиями формирования речного стока и антропогенной нагрузкой промышленных и сельскохозяйственных предприятий (Джамалов и соавт., 2017). Город Пущино Московской области (около 20 тысяч населения) не содержит на своей территории крупных производств, поэтому основным источником попадания в водную среду антибиотиков и антибиотикорезистентных штаммов служат коммунально-бытовые сточные воды.

Целью работы являлось изучение влияния сточных вод очистных сооружений г. Пущино на изменение состава микробного сообщества на примере бактерий рода Pseudomonas, а также на содержание в воде и седиментах реки Ока антибиотикорезистентных микроорганизмов и детерминант множественной лекарственной устойчивости.

Три пляжа в окрестностях г. Пущино были выбраны для отбора проб воды и седиментов: городской пляж г. Пущино (№ 2), пляж отеля Царьград (№ 1), расположенный в 3 км вверх по течению, и малопосещаемый пляж в 1.8 км вниз по течению (№ 3), расположенный приблизительно в 250 м вниз от стока очистных сооружений г. Пущино в Оку. Пляж отеля Царьград, который на момент отбора проб был больше года закрыт для посещения, выбран в качестве контрольной точки минимального антропогенного воздействия. Пробы воды на глубине 0.5 м и донных отложений у береговой линии под слоем воды 5 см были взяты из трех точек с каждого исследуемого сайта. Температура воды всех трех сайтов была 24C, температура воздуха ‒ от 24 до 26.2C. Штаммы выращивали при 28C на агаризованной среде LB (Sambrook et al., 1989), как без антибиотика, так и с добавлением одного из следующих антибиотиков: меропенем (40 мкг/мл), цефтазидим (40 мкг/мл), цефепим (40 мкг/мл), тетрациклин (30 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гентамицин (10 мкг/мл). Концентрации антибиотиков подбирали в соответствии с работой (Кошелева и соавт., 2021). Общую численность культивируемых микроорганизмов, культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов и псевдомонад определяли методом прямого высева серии разведений в трех повторах для каждой пробы, как было описано ранее (Кошелева и соавт., 2021). Общ ая численность культивируемых микроорганизмов (ОЧМ) на LB-агаре без антибиотика была одного порядка и составила 1.59 × 103 ± 30 КОЕ/мл для пляжа № 1, 1.35 × 103 ± 10 и 2.69 × 103 ± 30 для пляжей № 2 и № 3, соответственно. ОЧМ в пробах седиментов также была схожа между собой и составила 1.16 × 105 ± 1.5 × 103 КОЕ/мл для пляжа № 1, 2.75 × 105 ± 2.5 × 103 и 4.45 × 105 ± 103 для пляжей № 2 и № 3, соответственно. Таким образом, стоки очистных сооружений практически не влияют на общую численность культивируемых микроорганизмов.

Численность культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Общая численность антибиотикоустойчивых микроорганизмов (КОЕ/мл образца), изолированных методом прямого высева из проб седиментов (а) и воды (б) реки Ока. Tc ‒ тетрациклин, Km ‒ канамицин, Sm ‒ стрептомицин, Gm — гентамицин, Caz — цефтазидим, Fep — цефепим, Mer — меропенем.

 

Обнаружено почти десятикратное увеличение содержания микроорганизмов, устойчивых к аминогликозидам (канамицину, стрептомицину и гентамицину) в пробах воды, отобранных ниже сброса сточных вод очистных сооружений. Микроорганизмы, устойчивые к цефалоспоринам III и IV поколения, были обнаружены во всех пробах, однако их концентрация также была выше в воде зоны пляжа № 3. Крайне низкая численность микроорганизмов, устойчивых к тетрациклину (1‒2 КОЕ/мл) в образцах воды и седиментов всех трех зон может свидетельствовать об отсутствии загрязнения исследуемого участка р. Оки отходами животноводства (рис. 1). Ранее нами было показано, что, в то время как обработка сточных вод очистными сооружениями г. Пущино приводила к значительному снижению численности микроорганизмов, устойчивых к тетрациклину, то для микроорганизмов, устойчивых к канамицину, стрептомицину и хлорамфениколу, общая численность была сходной и не изменялась на всех стадиях очистки (Кошелева и соавт., 2021). В случае гентамицина численность в процессе очистки даже слегка возрастала, что, вероятно, связано с участием мобильных генетических элементов в распространении GmR–фенотипа. Таким образом, наблюдается корреляция между всплеском численности микроорганизмов, устойчивых к аминогликозидам, в воде пляжа № 3 и поступаемыми в реку очищенными сточными водами.

Пресноводные псевдомонады могут быть постоянными или эфемерными членами различных микробных консорциумов в городском водном цикле. Ранее нами было показано, что одними из наиболее часто встречающихся культивируемых антибиотикоустойчивых микроорганизмов в очистных сооружениях г. Пущино являются бактерии рода Pseudomonas (Кошелева и соавт., 2021). Из проб воды и седиментов с трех исследуемых пляжей на среде для выделения псевдомонад (PIA) были изолированы микроорганизмы, которые дополнительно проверяли на способность к флуоресценции на среде King B и устойчивость к используемым антибиотикам. Анализ антибиотикорезистентности исследуемых штаммов показал, что только 16% культивируемых штаммов псевдомонад, изолированных из проб пляжа отеля Царьград, устойчивы к трем и более используемым антибиотикам, а 18% — чувствительны ко всем используемым. Для городского пляжа и пляжа за очистными сооружениями эти доли достигали 47 и 17%, и 75 и 1.5%, соответственно. Очевидно влияние стоков очистных сооружений на распространение мультирезистентных штаммов.

Для выявления в пробах эубактерий и псевдомонад проводили количественную ПЦР (qPCR) с парами праймеров к фрагменту гена 16S рРНК бактерий — S-D-Bact-0907-a-S-20 и S-D-Bact-1054-a-A-20 (Leser et al., 2002) и к гипервариабельной области V3‒V4 гена 16S рРНК Pseudomonas spp. — Pse435F и Pse686R (Bergmark et al., 2012). ДНК из образцов воды и седиментов выделяли с использованием ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit (“Zymo Research”, США) по протоколу фирмы-производителя. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (“Thermo Scientific”, США), согласно протоколу фирмы-изготовителя. ПЦР в реальном времени осуществляли в циклере ДТлайт 4 (“ДНК-Технология”, Россия) с использованием 2.5-кратной реакционной смеси (“Синтол”, Россия), согласно инструкции производителя. Значения порогового цикла (Ct) рассчитывали, как среднее из 3-х повторов для каждого образца. Для построения стандартной кривой использовали серии 10-кратных разведений фрагментов гена 16S рРНК Pseudomonas putida и Citrobacter freundii. Эффективность ПЦР составила 86‒99%, коэффициент детерминации R2 > 0.99. После пересчета с использованием стандартов результаты выражали как число рибосомальных оперонов на 1 г образца. Результаты qPCR демонстрируют схожее содержание как эубактерий, так и псевдомонад в пробах воды исследованных участков (табл. 1).

 

Таблица 1. Количественное определение двух групп микроорганизмов методом qPCR в пробах воды и седиментов реки Оки

Пробы

Численность копий микробных генов 16S рРНК на 1 г образца, оцененная с помощью количественной ПЦР

Соотношение численности Pseudomonas к общему числу Eubacteria (%)

Eubacteria

Pseudomonas

 

Пляж отеля Царьград (№ 1)

Вода

2.60 × 106

2.40 × 104

0.92

Седименты

1.87 × 106

3.71 × 104

1.99

Городской пляж (№ 2)

Вода

2.43 × 106

2.12 × 104

0.87

Седименты

2.14 × 106

5.38 × 104

2.52

Пляж за очистными сооружениями (№ 3)

Вода

2.60 × 106

2.25 × 104

0.87

Седименты

4.83 × 106

2.23 × 105

4.62

 

Однако в пробах седиментов пляжа № 3, испытывающего влияние стоков очистных сооружений г. Пущино, обнаружено повышенное содержание как эубактерий (в 2.5 раза по сравнению с контрольным пляжем), так и бактерий рода Pseudomonas (в 6 раз). Процентное содержание псевдомонад от общего количества эубактерий было также самое большое в пробах седиментов пляжа № 3. Таким образом, стоки очистных сооружений влияют как на общее содержание эубактерий в донных отложениях, так и увеличивают процентное содержание пседвомонад в них (в том числе культивируемых мультирезистентных штаммов), изменяя, тем самым, состав микробного сообщества.

Сточные воды очистных сооружений, помимо влияния на состав микробных сообществ, могут являться источником антимикробных препаратов и микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам. Образцы ДНК из проб воды и седиментов исследуемых участков реки Оки тестировали методом ПЦР на наличие генов, ассоциированных с интегронами I-го типа: гена интегразы, intI1, гена устойчивости к четвертичным аммонийным соединениям, qacE/qacΔE1 (Кошелева и соавт., 2021), и R-плазмид группы несовместимости А/С (IncA/C) (Johnson et al., 2007). Считается, что интегронам класса I принадлежит ведущая роль в распространении множественной лекарственной устойчивости (Partridge et al., 2018). Плазмиды IncA/C преобладают среди патогенных штаммов Enterobacteriaceae и отвечают за распространение клинически значимых генов устойчивости: цефалоспориназы, blaCMY, и карбапенемазы, blaNDM, а также несут детерминанты устойчивости к фторхинолонам, аминогликозидам и др. (Carattoli et al., 2012). Маркерные последовательности на наличие интегронов I-го типа были обнаружены во всех исследованных образцах; причем методом количественной ПЦР в реальном времени не удалось выявить существенную разницу между “чистым” пляжем отеля Царьград и пляжем, испытывающим влияние очистных сооружений г. Пущино. Напротив, ампликоны repA IncA/C плазмид были обнаружены только в пробах воды пляжа № 3, что свидетельствует в пользу вклада очистных сооружений в распространение плазмид резистентности этой группы в водной среде.

Таким образом, в работе продемонстрировано влияние очистных сооружений на микробное сообщество водного бассейна р. Ока, в том числе на культивируемую антибиотикоустойчивую часть микробного сообщества, а также на распространение IncA/C плазмид резистентности в водной среде.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № FMRM-2022-0014).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались люди или животные.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

T. Yu. Izmalkova

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Author for correspondence.
Email: tatiz@pbcras.ru
Russian Federation, Pushchino, 142290

O. I. Sazonova

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Email: tatiz@pbcras.ru
Russian Federation, Pushchino, 142290

I. A. Kosheleva

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Email: tatiz@pbcras.ru
Russian Federation, Pushchino, 142290

References

  1. Джамалов Р.Г., Никаноров А.М., Решетняк О.С., Сафронова Т.И. Воды бассейна Оки: химический состав и источники загрязнения // Вода и экология: проблемы и решения. 2017. Т. 71. № 3. С. 114‒132.
  2. Кошелева И.А., Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Сиунова Т.В., Гафаров А.Б., Соколов С.Л., Боронин А.М. Антибиотикорезистентные микроорганизмы и детерминанты множественной лекарственной устойчивости у бактерий рода Pseudomonas в очистных сооружениях г. Пущино // Микробиология. 2021. Т. 90. С. 179‒190.
  3. Kosheleva I.A., Izmalkova T.Y., Sazonova O.I., Siunova T.V., Gafarov A.B., Sokolov S.L., Boronin A.M. Antibiotic-resistant microorganisms and multiple drug resistance determinants in Pseudomonas bacteria from the Pushchino wastewater treatment facilities // Microbiology (Moscow). 2021. V. 90. P. 187–197.
  4. Barenboim G.M., Kozlova M.A. Pollution of sources of drinking water supply of large cities with pharmaceuticals (the example of Moscow, Russia) // Water Resources. 2018. V. 45. P. 941‒952.
  5. Bergmark L., Poulsen P.H.B., Abu Al-Soud W., Norman A., Hansen L.H., Sørensen S.J. Assessment of the specificity of Burkholderia and Pseudomonas qPCR assays for detection of these genera in soil using 454 pyrosequencing // FEMS Microbiol. Lett. 2012. V. 333. P. 77‒84.
  6. Carattoli A., Villa L., Poirel L., Bonnin R.A., Nordmann P. Evolution of IncA/C blaCMY-2-carrying plasmids by acquisition of the blaNDM-1 carbapenemase gene // Antimicrob. Agents Chemother. 2012. V. 56. P. 783‒786.
  7. Carvalho I.T., Santos L. Antibiotics in the aquatic environment: a review of the European scenario // Environ. Int. 2016. V. 94. P. 736–757.
  8. Fierer N., Jackson J.A., Vilgalys R., Jackson R.B. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 4117–4120.
  9. Johnson T.J., Wannemuehler Y.M., Johnson S.J., Logue C.M., White D.G., Doetkott C., Nolan L.K. Plasmid replicon typing of commensal and pathogenic Escherichia coli isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 1976‒1983.
  10. Leser T.D., Amenuvor J.Z., Jensen T.K., Lindecrona R.H., Boye M., Møller K. Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiota revisited // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 673‒690.
  11. Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance // Clin. Microbiol. Rev. 2018. V. 31. P. 1‒61.
  12. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The total number of antibiotic-resistant microorganisms (CFU/ml of the sample) isolated by direct seeding from sediment samples (a) and water (b) of the Oka River. Tc ‒ tetracycline, Km ‒ kanamycin, Sm ‒ streptomycin, Gm — gentamicin, Caz — ceftazidime, Fep — cefepime, Mer — meropenem.

Download (100KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».