Knockout of Hsp70 genes modulates age-related transcriptomic changes in leg muscles, reduces locomotion speed and lifespan of Drosophila melanogaster

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The study investigated the effect of knockout of six Hsp70 genes (orthologues of the mammalian genes Hspa1a, Hspa1b, Hspa2 and Hspa8) on age-related changes in gene expression in the legs of Drosophila melanogaster, which contain predominantly skeletal muscle bundles. For this, the leg transcriptomic profile was examined in males of the w1118 control line and the Hsp70– line on the 7th, 23rd and 47th days of life. In w1118 flies, an age-related decrease in the locomotion (climbing) speed (a marker of functional state and endurance) was accompanied by a pronounced change in the transcriptomic profile of the leg skeletal muscles, which is conservative in nature. In Hsp70– flies, the median lifespan was shorter and the locomotion speed was significantly lower compare to the control; at the same time, complex changes in the age-related dynamics of the skeletal muscle transcriptome were observed. Mass spectrometry-based quantitative proteomic showed that 47-day-old Hsp70– flies, compared with w1118, demonstrated multidirectional changes in the content of key enzymes of glucose metabolism and fat oxidation (glycolysis, pentose phosphate pathway, Krebs cycle, beta-oxidation and oxidative phosphorylation). Such dysregulation may be associated with a compensatory increase in the expression of other genes encoding chaperones (small Hsp, Hsp40, 60, and 70), which regulate specific sets of target proteins. Taken together, our data show that knockout of six Hsp70 genes slightly reduces the median lifespan of flies, but significantly reduces the locomotion speed, which may be associated with complex changes in the transcriptome of the leg skeletal muscles and with multidirectional changes in the content of key enzymes of energy metabolism.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Увеличение доли пожилых людей, наблюдаемое в развитых странах в последнее десятилетие, делает актуальным изучение механизмов старения. При старении происходит постепенное снижение функциональных и адаптационных возможностей организма и развитие возрастных патологий. Один из интегральных признаков старения – уменьшение массы и функциональных возможностей скелетной мускулатуры – выражается в снижении способности мышц окислять жиры и углеводы, аэробной работоспособности (выносливости) и силы мышц [1, 2]. Эти изменения ведут к нарушению углеводно-жирового обмена, развитию метаболических заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, саркопении и ряду других нарушений [3–6]. Совокупность этих изменений может быть причиной старческой астении (немощи) и значительного снижения качества жизни, что подчеркивает важность изучения влияния старения (и соответствующих механизмов) на функции скелетных мышц.

Выделяют более 10 молекулярно-клеточных признаков старения, среди которых большое внимание привлекает нарушение клеточного протеостаза [7]. Ключевыми регуляторами протеостаза являются белки теплового шока и, в частности, одно из наиболее консервативных семейств этих белков – Hsp70 (Hspa) [8]. Белки этого семейства выполняют разнообразные функции, такие как de novo фолдинг белков, контроль качества и фолдинг совместно с белками Hsp90 и шаперонинами, участие в мембранном транспорте и регуляции активности белков, сборка белковых комплексов, защита белков от деградации и регуляция их протеолиза, а также предотвращение стресс-индуцируемого образования белковых агрегатов, импорт и фолдинг митохондриальных белков [9, 10]. Наиболее хорошо изучены функции белков, кодируемых генами-паралогами Hspa1a (Hsp72-1) и Hspa1b (Hsp72-2). Белок, кодируемый Hspa1a, играет важную роль в регенерации скелетных мышц в ответ на различные стимулы, включая сократительную активность [11], а также в регуляции чувствительности к инсулину, биогенеза митохондрий и аэробной работоспособности (выносливости) [12, 13]. Эти процессы значительно нарушаются в скелетных мышцах при старении, поэтому не стала неожиданностью связь Hspa1a с возрастзависимым снижением чувствительности к инсулину [14, 15] и мышечной силы [16]. Нужно отметить, что влияние генов семейства Hsp70 (Hspa) на возрастные изменения скелетных мышц изучено явно недостаточно, в частности, отсутствуют данные об их воздействии на транскриптом при старении.

Ключевым подходом к изучению функции генов считается нокаут. Семейство Hsp70 (Hspa) состоит более чем из 10 генов, и подавление экспрессии одного из них может компенсировать другие гены этого семейства, что затрудняет интерпретацию результатов таких экспериментов. Поэтому для исследования влияния генов семейства Hsp70 (Hspa) на возрастные изменения транскриптома скелетных мышц мы использовали линию Drosophila melanogaster с нокаутом шести генов Hsp70 (Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb, Hsp70Bc), ортологов генов Hspa1a, Hspa1b, Hspa2 и Hspa8 млекопитающих. Для определения зависящих от возраста и Hsp70 изменений экспрессии генов мы выделяли РНК и белки из ног мух, состоящих преимущественно из мышечных пучков и хитинового каркаса [17]. Использовали широкозахватные методы РНК-секвенирования и количественный масс-спектрометрический анализ протеома. Кроме того, оценивали влияние нокаута генов Hsp70 на скорость локомоций в тесте на отрицательный геотаксис – показатель, характеризующий функциональное состояние и выносливость мух [18], и на продолжительность жизни мух с обычным и хронически повышенным уровнем двигательной (локомоторной) активности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Линии D. melanogaster и условия их культивирования. Самки D. melanogaster хуже адаптируются к увеличению двигательной активности, чем самцы [19]. Поэтому исследование проводили на самцах линии w1118 (Vienna Drosophila Resource Center, ID 60000) и Hsp70– (генотип w1118; Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B) (Bloomington Drosophila Stock Center, ID 8841) с нокаутом шести генов этого семейства (Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb, Hsp70Bc) [20] из 13. Отсутствие экспрессии этих генов подтверждено анализом покрытия их открытой рамки считывания (РНК-секвенирование) (рис. 1а). Мух содержали при 22 °C, влажности 45–55% и 12-часовом цикле свет – темнота, на пищевой среде (5% сахарозы, 10% пекарских дрожжей, 5% манной крупы, 0.7% агара, 0.1% пропионовой кислоты). Мух культивировали при постоянной плотности не менее двух поколений; самцов отбирали в парах диэтилового эфира в течение 36 ч после вылета имаго и помещали по 30 особей в 50 мл полипропиленовые пробирки с вентилируемой крышкой и 5 мл пищевой среды. Корм меняли каждые 3 суток.

 

Рис. 1. Нокаут шести генов семейства Hsp70 снижает медианную продолжительность жизни D. melanogaster и оказывает выраженное негативное влияние на скорость локомоций в тесте на отрицательный геотаксис. а – Нормированное количество прочтений (РНК-секвенирование), приходящееся на открытую рамку считывания каждого гена. n = 12 пулов (ноги 15 мух) каждой линии. б и в – Доля выживших мух с обычным и хронически повышенным уровнем двигательной (локомоторной) активности. Представлено значение p для сравнения кривых, а также для медианной и максимальной продолжительности жизни (доля выживших 50 и 10%); n >150 в каждой линии. TP – тренировка. г – Возрастные изменения скорости локомоций в тесте на отрицательный геотаксис. Одной и тремя звездочками представлены значения p < 0.05 и < 0.001 соответственно. n = 5–6 пулов (10–30 мух в пуле) каждой линии.

 

Анализ выживаемости. Число мертвых мух подсчитывали каждые 2 суток. Различия в продолжительности жизни в разных группах определяли с помощью инструмента OASIS2 [21] при уровне значимости 0.05 по логарифмическому тесту Мантеля – Кокса (n >150 для каждой линии); различия в медианной и максимальной продолжительности жизни (50 и 10% выживших соответственно) – по точному критерию Фишера.

Возрастные изменения скорости локомоций. Локомоции (перемещение вверх по стенке пробирки) инициировали с использованием теста на отрицательный геотаксис [18] и самодельного прибора, который каждые 15 с поворачивал пробирки на 180о вокруг поперечной оси, как описано ранее [22]. Через 5 мин после начала теста записывали видео (в течение 6 мин) для определения положения каждой мухи и скорости ее движения по вертикали (программа FreeClimber [23]).

Возрастные изменения транскриптома и протеома скелетной мышцы. Мух обеих линий анестезировали диэтиловым эфиром на 7, 23 и 47 сутки жизни, конечности отделяли в фосфатно-солевом буфере, а затем помещали в охлажденный буфер RLT (“Qiagen”, Германия) для выделения РНК или в буфер для выделения белка (см. ниже).

Влияние хронического увеличения локомоторной активности на продолжительность жизни мух. Мух (n = 180 в каждой линии) тренировали в пробирках для культивирования в течение 4 недель (4–32-е сутки жизни). Использовали прибор (см. выше), который ежедневно, начиная с 12 ч, каждые 15 с поворачивал пробирки на 180° вокруг поперечной оси: в первые 2 суток тренировочного периода в течение 30 мин, во вторые 2 суток – 60 мин, далее – 90 мин. Выживаемость мух регистрировали, как описано выше. Контрольных (нетренирующихся) мух (n = 180 каждой линии) содержали в пробирках с ограниченным объемом (высота 1.5 см) согласно [22].

РНК-секвенирование и обработка данных. Ноги 15 мух гомогенизировали в 1.5 мл пробирке с помощью полипропиленового пестика и дрели (200 об./мин, ~ 30 с) в RLT буфере (“Qiagen”) с 1%-ным бета-меркаптоэтанолом и инкубировали (55 °C, 10 мин) с протеинкиназой К (“Евроген”, Россия). Суммарную РНК выделяли на колонке (Clean RNA Standard, “Евроген”). Концентрацию РНК оценивали с помощью флуориметра (Qubit 4, “Thermo Scientific”, США). Целостность РНК определяли с помощью капиллярного электрофореза (TapeStation, “Agilent”, Германия) в аликвоте общей РНК (200 мкг) после обработки ДНКазой I (“Thermo Scientific”). Суммарную РНК (500 мкг) использовали для приготовления цепьспецифичной библиотеки с помощью набора NEBNext Ultra II Directional RNA Library Preparation kit (“NEB”, США) и секвенировали (75 нуклеотидов, один конец) со средней глубиной 25 млн. прочтений на образец, используя секвенатор NextSeq 550 (“Illumina”, США), как описано ранее [24].

Прочтения низкого качества и адаптерные последовательности удаляли (Timomatic tool, версия 0.36), прочтения выравнивали по первичной сборке генома BDGP6.94. Подсчитывали уникальные прочтения известных экзонов каждого гена с использованием пакета Rsubread (среда R) и аннотации Ensembl (BDGP6.94). Затем анализировали дифференциально экспрессируемые белоккодирующие гены (метод DESeq2, анализ непарных образцов с поправкой Бенджамини – Хохберга) и удаляли гены с низким уровнем экспрессии (TPM <1) (kallisto v0.46.2). Дифференциально экспрессируемые гены определяли как гены с изменением экспрессии  >1.25 и padj <0.05.

Количественный масс-спектрометрический протеомный анализ и обработка данных. Ноги 10 мух гомогенизировали, как описано выше, в 140 мкл лизирующего буфера (4% додецилсульфата натрия, 0.1 М Трис и 0.1 М дитиотреитол рН 7.6). Лизат кипятили (95ºC, 5 мин), переносили в микропробирку AFA и обрабатывали ультразвуком (средняя мощность 20 Вт, 30 с × 4) с помощью фокусированного ультразвукового генератора ME220 (все – “Covaris”, США). После центрифугирования (5 мин, 30000 g) концентрацию белка в супернатанте измеряли флуориметрическим методом (Qubit 4), затем 100 мкг белка загружали на центрифужный фильтр YM-10 (“Millipore”, Ирландия) и гидролизовали с помощью метода FASP, используя ферменты Lys-C и трипсин (Lys-C 1:150, Trypsin Gold 1:100, оба – “Promega”, США) в течение ночи при температуре 37°C, как описано ранее [25].

Каждый образец анализировали трижды с помощью системы ВЭЖХ Ultimate 3000 RSLCnano (“Thermo Scientific”) и гибридного квадрупольно-орбитального масс-спектрометра Q Exactive HF-X (“Thermo Scientific”) с использованием наноэлектроспрея в режиме положительной ионизации (“Thermo Scientific”), как описано ранее [26]. Градиент (140 мин) был сформирован подвижной фазой A (0.1% муравьиной кислоты) и B (80% ацетонитрила, 0.1% муравьиной кислоты) при потоке 0.4 мкл/мин. Ионизирующее напряжение составляло 2.1 кВ. Масс-спектры получены с разрешением 120000 в диапазоне 380–1500 m/z; ионы фрагментов сканировали по массе с разрешением 60000 в диапазоне m/z от 115 до верхнего значения m/z, соответствующего массе зарядового числа иона-предшественника. Все тандемные МС-сканирования проводили на ионах с зарядовым числом от z = 2+ до z = 4+. Синхронный отбор родительских ионов позволял одновременно выделить до 40 ионов-фрагментов (МС2). Максимальное время накопления ионов установлено равным 50 мс для родительских ионов и 100 мс для фрагментов. Целевые значения AGC были установлены на 107 и 2 × 105 для ионов-предшественников и фрагментов соответственно.

Определение пептидов, белков и интенсивности репортерных ионов проводили с использованием платформы MaxQuant (1.6.11; Институт биохимии Макса Планка) при стандартных настройках (FDR для пептидов 1%, N-концевое ацетилирование и окисление метионина в качестве переменных модификаций и карбамидометилирование цистеина в качестве фиксированной модификации); для устранения влияния системных факторов небиологических эффектов использовали функции “Isobaric much between runs” и “PSM-level weighted ratio normalization” [27]. После фильтрации (потенциальные контаминанты, обратные пептиды и пептиды, идентифицированные только по сайту) рассчитывали отношение интенсивностей репортерных ионов (Hsp70–/w1118) для каждого белка, идентифицированного по >1 уникальному пептиду, с использованием платформы Perseus (1.6.5; Институт биохимии Макса Планка). Дифференциально экспрессируемые белки определяли с помощью T-критерия Уэлча с q-значением (p-значение, скорректированное по Бенджамини – Хохбергу) < 0.05. Если белковая группа состояла из нескольких белков, то выбирали белок с наибольшей экспрессией соответствующей мРНК.

Статистический анализ. Физиологические данные представлены как медианы и межквартильный разброс. Данные повторных измерений анализировали с использованием двухфакторной (время и генотип) модели со смешанными эффектами с тестом множественных сравнений Сидака (уровень значимости 0.05).

Анализ функционального обогащения биологических процессов и клеточных компонентов выполняли относительно референсного набора генов (белоккодирующие гены с TPM > 1) с помощью DAVID 6.8 (padj < 0.05 точный тест Фишера с поправкой Бенджамини) с использованием баз данных GENE ONTOLOGY BP/CC DIRECT и KEGG PATHWAY. Динамику экспрессии генов, относящихся к некоторым обогащенным функциональным группам, оценивали с использованием нормированной экспрессии (z-шкала) каждого гена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние нокаута генов Hsp70 на продолжительность жизни D. melanogaster

Медианная продолжительность жизни мух линии Hsp70– оказалась на 14% (p = 0.01) меньше, чем у мух контрольной линии w1118, при этом не выявлено различий в максимальной продолжительности жизни (рис. 1б). Снижение продолжительности жизни мух Hsp70–отмечено ранее [28], однако подавление экспрессии Hsp70 с помощью РНК-интерференции не повлияло на этот показатель [29].

Увеличение физической активности повышает качество и/или продолжительность жизни разных организмов (человека [30, 31], грызунов [32, 33], а также мух [34–38]). Поэтому мы решили проверить, окажет ли нокаут генов Hsp70 негативное влияние на прирост продолжительности жизни, вызванный физическими нагрузками. В нашей работе повышенная локомоторная активность (4–32-е сутки жизни) привела к увеличению медианной и максимальной продолжительности жизни не только мух линии w1118 (на 26 и 9% соответственно), но и Hsp70– (на 30 и 15% соответственно) (рис. 1в). Это означает, что увеличение продолжительности жизни, вызванное тренировками, не регулируется Hsp70. По-видимому, нокаут генов Hsp70 вызывает несильный негативный эффект, поскольку он полностью компенсируется влиянием хронически повышенной двигательной активности.

Нокаут генов Hsp70 снижает скорость локомоций у D. melanogaster

В первые сутки после вылупления у мух наблюдаются выраженные изменения экспрессии генов, размеров и функциональных возможностей скелетных мышц, связанные с ростом и развитием [17], поэтому все исследования проводили, начиная с 7-х суток жизни. Скорость локомоций (перемещение вверх) в тесте на отрицательный геотаксис широко используется для оценки функционального состояния и выносливости мух [18]. Нами обнаружено, что скорость локомоций у молодых самцов Hsp70–в 2 раза ниже (padj < 0.001), чем в контрольной линии w1118 (рис. 1г). Это согласуется с данными о том, что сверхэкспрессия Hspa1a в скелетных мышцах мышей приводит к увеличению скорости и времени бега до отказа активности окислительных ферментов и содержания митохондрий в мышцах, а также к максимальной скорости потребления O2 организмом [12, 13]. У мух w1118 в возрасте 3 нед. наблюдается резкое снижение скорости локомоций, что соответствует данным [35, 39], однако у мух Hsp70– скорость локомоций не изменяется значимо и остается на очень низком уровне (рис. 1г). Возрастные изменения скорости локомоций у мух w1118 согласуются с многочисленными изменениями в летательных мышцах старых мух: со снижением плотности митохондрий и нарушением их структуры, с увеличением продукции активных форм кислорода, нарушением структуры мышечных волокон, саркомеров и эндоплазматического ретикулума и с накоплением полиубиквитинированных белковых агрегатов [40–42].

В дальнейшем профиль экспрессии генов в мышцах ног D. melanogaster изучали на 7- (молодые особи), 23- (до резкого снижения скорости локомоций контрольных мух) и 47-е сутки (при сопоставимой скорости локомоций) (рис. 1г).

Сравнение возрастных изменений транскриптома в мышцах ног мух w1118 и млекопитающих

Исследование динамики транскриптомного профиля в мышцах ног показало, что большинство возрастных изменений, наблюдаемых у 23-суточных мух w1118 относительно молодых, сохранились у 47-суточных мух (рис. 2а, табл. S1, см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/2/supp_Kukushkina_rus.zip), а количество генов, экспрессия которых изменилась к 47-м суткам, увеличилось в 2–3 раза, что говорит о прогрессировании возрастных изменений. В дополнение к этому анализ функционального обогащения показал, что после 23 суток жизни (сопоставление 47 и 23-суточных мух, а также 23 и 7-суточных мух) значительно изменяется выраженность транскриптомных изменений: увеличивается количество генов, входящих в функциональную категорию “иммунный ответ”, “фолдинг белков”, “цитоскелет” (рис. 2б) и “митохондрия” (рис. 2в), снижается обогащение генами категорий “трансляция”, “протеолиз/лизосома”, “биосинтез кофакторов”, “метаболизм углеводов” (рис. 2б) и “плазматическая мембрана” (рис. 2в).

 

Рис. 2. Старение вызывает выраженные и прогрессирующие изменения транскриптомного профиля ног (состоящих преимущественно из пучков мышечных волокон) мух w1118. Нокаут шести генов семейства Hsp70 модулирует возрастные изменения транскриптома скелетных мышц ног. а – Количество уникальных и общих генов, экспрессия которых у 23- и 47-суточных мух отличается от экспрессии у 7-суточных мух. n = 4 пула (ноги 15 мух) каждой линии. б и в – Анализ функционального обогащения генами, экспрессия которых увеличилась (б) и снизилась (в). Представлено количество генов в каждой функциональной категории; тепловая карта показывает p-значение.

 

Сравнение совокупных изменений у мух разного возраста (47 суток vs. 7) выявило наиболее значимое обогащение генами, экспрессия которых снизилась, а именно генами, кодирующими белки митохондрий (окислительные ферменты и др.), мембранные белки и синаптические белки мотонейронов, ферменты метаболизма глюкозы/гликогена и аминокислот, белки саркомеров и внеклеточного матрикса (рис. 2в). Генами, экспрессия которых повысилась, обогащены функциональные категории, связанные с ядерными белками, протеолизом/протеасомами, фолдингом белков, трансляцией/рибосомами и внеклеточным матриксом (рис. 2б). Эти изменения хорошо согласуются с возрастными изменениями транскриптома летательных мышц D. melanogaster (линия B3) [41] и скелетных мышц грызунов и человека [43–46], в которых снижается экспрессия генов, ассоциированных с многочисленными митохондриальными белками (включая рибосомные), регуляторами транскрипции, углеводного, жирового и аминокислотного обмена и с саркомерными белками, а увеличивается экспрессия генов, связанных с воспалительным и иммунным ответом, клеточной адгезией и секрецией. Это свидетельствует о консервативности механизмов регуляции возрастных изменений экспрессии генов в скелетной мышце и косвенно говорит об адекватности выбранного нами экспериментального подхода. К возрастным изменениям транскриптома скелетных мышц (ног) мух w1118, отличным от изменений у млекопитающих, относится увеличение экспрессии различных ядерных белков, регуляторов транскрипции и рибосомных белков, менее существенное повышение экспрессии генов иммунного ответа и секретируемых белков (рис. 2б), а также снижение экспрессии генов синаптических белков (рис. 2в).

Интересно отметить, что мы обнаружили множество возрастных изменений в экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока: увеличение Hsp10, генов Cct, кодирующих комплекс, содержащий шаперонин TCP-1, атипичных Hsp70 и Hsp90, а также разнонаправленные изменения генов малых Hsp, Hsp40, Hsp70 (экспрессия 22 и 11 мРНК из 76 экспрессируемых увеличилась и снизилась соответственно; табл. S2, см. Дополнительные материалы), некоторые из них были отмечены ранее в летательных мышцах [47]. При этом нами не найдено возрастных изменений в экспрессии генов Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb, Hsp70Bc, что согласуется с данными о посттранскрипционной регуляции увеличения содержания белков Hsp70 в летательных мышцах старых мух [47].

Нокаут генов Hsp70 модулирует возрастную динамику транскриптома в ногах мух

Изменения транскриптома у мух Hsp70– (47-суточных vs. 7-суточных) были несколько меньше, чем в контроле (~1000–1500 мРНК vs. ~1500–2000 мРНК соответственно; рис. 2а, табл. S1, см. Дополнительные материалы), при этом отмечено нарушение возрастной динамики экспрессии многих генов. Так, анализ функционального обогащения показал, что изменения экспрессии генов, кодирующих регуляторы трансляции, ферменты биосинтеза кофакторов, углеводного обмена (рис. 2б) и мембранные белки (рис. 2в), происходили в начальный период жизни мух линии w1118, тогда как в линии Hsp70– изменения экспрессии наблюдались с 23-х по 47-е сутки или отсутствовали. Обратная ситуация отмечена в случае генов иммунного ответа, белков цитоскелета (рис. 2б), митохондрий и регуляторов метаболизма лекарственных средств (рис. 2в). Анализ возрастной динамики экспрессии генов, относящихся к этим и некоторым другим функциональным категориям, подтвердил это наблюдение (рис. 3). Кроме того, совокупные возрастные изменения (47 vs. 7 суток) в экспрессии генов, кодирующих регуляторы трансляции, протеолиза (рис. 2б и рис. 3), метаболизма липидов и белки мотонейронов/синапсов, различались между линиями (рис. 2в и рис. 3). Суммарно эти данные показывают, что гены Hsp70 оказывают комплексное, но относительно небольшое влияние на возрастные изменения экспрессии множества генов в скелетных мышцах ног мух.

 

Рис. 3. Нокаут шести генов семейства Hsp70 нарушает возрастную динамику экспрессии генов. Линией представлены величины нормированной экспрессии (z-шкала) каждого гена некоторых обогащенных функциональных групп из рис. 2б и в. Приведены названия и номера функциональных категорий; n = 4 пула (ноги 15 мух) каждой линии.

 

Нокаут генов Hsp70 вызывает разнонаправленные изменения в экспрессии генов ключевых ферментов метаболизма глюкозы и жиров

Для исследования влияния генотипа (Hsp70– vs. w1118) на экспрессию генов мы сопоставили транскриптомные и протеомные профили 47-суточных мух (при сопоставимой скорости локомоций; рис. 1г). Масс-спектрометрический анализ позволяет детектировать преимущественно высокопредставленные мышечные белки (белки саркомеров, митохондрий, внеклеточного матрикса и др.) [48, 49], поэтому в нашей работе Hsp70-зависимые изменения в низкопредставленных сигнальных/регуляторных белках остались практически неохарактеризованными. В результате анализа в скелетных мышцах ног мух детектировано 724 белка, экспрессия 247 из которых у мух линии Hsp70–увеличилась, а 72 снизилась, причем изменение содержания трети белков коррелировало с изменением уровня соответствующих мРНК (рис. 4а, табл. S1, см. Дополнительные материалы). Оказалось, что белками, имеющими разный паттерн регуляции на уровне мРНК, обогащены различные функциональные категории (рис. 4б), что согласуется с наблюдениями для скелетной мышцы человека [50]. Так, белки, содержание которых увеличилось при повышении экспрессии их генов, были ассоциированы с категорией “окислительное фосфорилирование” и включали субъединицы митохондриальных комплексов I, III и V (АТPаза), а также вакуолярной V-АТPазы (рис. 4б,в). Более 170 белков, содержание которых увеличилось без изменения содержания их мРНК, были ассоциированы с категориями “рибосома” и “трансляция” и включали ряд рибосомных белков (рис. 4), в том числе важный регулятор трансляции – рибосомный белок S6 (RpS6). Белками, содержание которых снизилось на фоне снижения экспрессии их генов, обогащены категории “цитозоль”, “метаболизм” и “пентозофосфатный путь” (рис. 4б). Интересно, что среди белков, снижение содержания которых произошло без изменения экспрессии их генов, оказались четыре субъединицы цитохромоксидазного комплекса III и цитохром с – терминальные участки электрон-транспортной цепи (рис. 4б,в), что говорит о разнонаправленной регуляции субъединиц ферментов дыхательных комплексов. Координированная экспрессия белков дыхательных комплексов важна для нормального окислительного фосфорилирования [51], тогда как нарушение стехиометрии может снизить устойчивость дыхательных комплексов к действию активных форм кислорода [52]. Эти рассуждения согласуются с повышенным содержанием у мух Hsp70– ферментов антиоксидантной защиты (каталаза [Cat]; тиоредоксинпероксидаза 1 [Jafrac1]; пероксиредоксин 5 [Prx5]; супероксид-дисмутаза 2 [Sod2]) (табл. S1, см. Дополнительные материалы), что можно рассматривать как компенсаторный ответ на увеличение повреждающего действия/продукции активных форм кислорода. Разнонаправленные изменения обнаружены и в случае таких ключевых путей энергетического метаболизма, как снижение содержания ферментов пентозофосфатного пути (отмечено выше), снижение и увеличение содержания различных ферментов гликолиза, цикла Кребса, транспорта и бета-окисления жирных кислот (рис. S1, см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/2/supp_Kukushkina_rus.zip).

 

Рис. 4. Нокаут шести генов семейства Hsp70 вызывает разнонаправленные изменения в содержании ключевых ферментов метаболизма глюкозы и жиров (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кребса, бета-окисление и окислительное фосфорилирование) в мышцах ног 47-суточных мух. а – Изменения содержания мРНК и белка в скелетных мышцах ног мух Hsp70– относительно мух w1118. мРНК n = 4 пула (ноги 15 мух) каждой линии; белок n = 7–8 пулов (ноги 10 мух) для каждой линии. б – Анализ функционального обогащения показал, что белками с разным паттерном регуляции на уровне мРНК обогащены различные функциональные категории. Представлено количество генов в каждой категории; тепловая карта показывает значение p. в – Разнонаправленные изменения содержания белков окислительного фосфорилирования в ногах 47-суточных мух Hsp70– и мух w1118 (см. рис. S1, Дополнительные материалы). N.S. – изменение содержания белка не детектировано; N.D. – белок не детектирован.

 

Чем могут быть вызваны разнонаправленные изменения содержания ферментов энергетического метаболизма? Интересно, что делеция генов Hsp70 привела к (компенсаторному) увеличению экспрессии других генов семейства Hsp70 (Hsc70-1 и Hsc70-2) и семейства Hsp40 (CG5504, CG7130, CG7394, CG32640, l(3)80Fg), кодирующих важные регуляторы цикла шаперонов Hsp70, а также генов малых белков теплового шока (CG7409, CG13133, Hsp23, Hsp26, Hsp27 и Hsp67Bc) (всего 13 из 75 экспрессируемых мРНК); при этом снижение экспрессии показано лишь у одного шаперона (Sec63) (табл. S2, см. Дополнительные материалы). Обнаружено также увеличение содержания малых белков теплового шока (CG7409, l(2)efl) и других белков-шаперонов (CG11267, Hsp60A) (всего 4 из 12 детектированных белков; табл. S2, см. Дополнительные материалы) в ногах мух линии Hsp70– по сравнению с контрольной линией. Нужно отметить, что разные семейства белков теплового шока регулируют специфические наборы белков, что, по-видимому, связано с их физико-химическими свойствами и клеточной локализацией [53, 54]. Белковые продукты нескольких генов с повышенной экспрессией (CG5504, CG7394, CG11267 и Hsp60A) у мух Hsp70– локализуются в митохондриях, а малые белки теплового шока участвуют в регуляции морфологии и функции митохондрий [55]. Учитывая важную роль шаперонов в регуляции стабильности, протеолиза и транспорта/митохондриального импорта многих клеточных белков (и большинства митохондриальных белков) [9, 10], можно предположить, что разнонаправленные изменения экспрессии ряда ферментов энергетического метаболизма вызваны разнонаправленным изменением экспрессии шаперонов разных семейств. Интересно, что подобные изменения произошли на фоне увеличения экспрессии рибосомных белков (маркер производительности трансляционного аппарата) у мух Hsp70– (рис. 3, рис. 4б и рис. S1, см. Дополнительные материалы), что может быть дополнительным фактором, затрудняющим поддержание протеостаза в мышце.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами показано, что возрастное снижение скорости локомоций мух w1118 – показателя функционального состояния и выносливости – сопровождается выраженными изменениями транскриптомного профиля скелетных мышц ног, носящими консервативный характер. Это дополняет результаты предыдущих работ об использовании этой модели для исследования возрастных изменений скелетной мышцы [40–42].

Делеция шести генов Hsp70 уменьшила медианную продолжительность жизни мух, однако не оказала негативного влияния на прирост продолжительности их жизни, вызванный длительным повышением двигательной активности. Это свидетельствует о контекстспецифичном и небольшом влиянии нокаута генов Hsp70 на продолжительность жизни мух. Напротив, в тесте на отрицательный геотаксис (показатель, характеризующий выносливость) скорость локомоций у мух Hsp70– была значительно снижена, что происходило на фоне комплексных изменений возрастной динамики транскриптома мышц ног. Количественный протеомный анализ выявил у 47-суточных мух Hsp70– разнонаправленные изменения в содержании ключевых ферментов метаболизма глюкозы и окисления жиров (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кребса, бета-окисление и окислительное фосфорилирование). Такая дисрегуляция может быть связана с компенсаторным увеличением экспрессии генов, кодирующих другие шапероны (этого и других семейств), которые регулируют специфичные для них наборы белков-мишеней.

Таким образом, нокаут шести генов Hsp70 несколько уменьшает медианную продолжительность жизни мух, но выраженно снижает скорость их локомоций, что может быть связано с комплексными изменениями транскриптома скелетных мышц ног и с разнонаправленными изменениями в содержании ключевых ферментов энергетического метаболизма.

Авторы благодарны Научно-исследовательскому институту биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича (Москва) за возможность использования масс-спектрометрического оборудования центра коллективного пользования “Протеом человека”.

Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 21-15-00405.

В работе соблюдены все принципы ухода и использования животных.

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Данные РНК-секвенирования, полученные в этом исследовании, доступны в базе данных NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером GSE239395.

×

About the authors

I. V. Kukushkina

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: danil-popov@yandex.ru

Биологический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Russian Federation, Moscow, 123007; Moscow, 119234

P. A. Makhnovskii

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: danil-popov@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 123007

V. G. Zgoda

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Email: danil-popov@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119121

N. S. Kurochkina

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: danil-popov@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 123007

D. V. Popov

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: danil-popov@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 123007

References

  1. Furrer R., Handschin C. (2023) Drugs, clocks and exercise in ageing: hype and hope, fact and fiction. J. Physiol. 601, 2057–2068.
  2. Karakelides H., Irving B.A., Short K.R., O’Brien P., Nair K.S. (2010) Age, obesity, and sex effects on insulin sensitivity and skeletal muscle mitochondrial function. Diabetes. 59, 89–97.
  3. Cervenka I., Agudelo L.Z., Ruas J.L. (2017) Kynurenines: tryptophan’s metabolites in exercise, inflammation, and mental health. Science. 357, eaaf9794.
  4. Demontis F., Piccirillo R., Goldberg A.L., Perrimon N. (2013) The influence of skeletal muscle on systemic aging and lifespan. Aging Cell. 12, 943–949.
  5. Pedersen B.K., Febbraio M.A. (2012) Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat. Rev. Endocrinol. 8, 457–465.
  6. Pedersen B.K., Saltin B. (2015) Exercise as medicine – evidence for prescribing exercise as therapy in 26 different chronic diseases. Scand. J. Med. Sci. Sports. 25(Suppl 3), 1–72.
  7. Lopez-Otin C., Blasco M.A., Partridge L., Serrano M., Kroemer G. (2023) Hallmarks of aging: аn expanding universe. Cell. 186, 243–278.
  8. Brocchieri L., Conway de Macario E., Macario A.J. (2008) HSP70 genes in the human genome: сonservation and differentiation patterns predict a wide array of overlapping and specialized functions. BMC Evol. Biol. 8, 19.
  9. Rosenzweig R., Nillegoda N.B., Mayer M.P., Bukau B. (2019) The Hsp70 chaperone network. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 665–680.
  10. Pfanner N., Warscheid B., Wiedemann N. (2019) Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 267–284.
  11. Senf S.M. (2013) Skeletal muscle heat shock protein 70: diverse functions and therapeutic potential for wasting disorders. Front. Physiol. 4, 330.
  12. Henstridge D.C., Bruce C.R., Drew B.G., Tory K., Kolonics A., Estevez E., Chung J., Watson N., Gardner T., Lee-Young R.S., Connor T., Watt M.J., Carpenter K., Hargreaves M., McGee S.L., Hevener A.L., Febbraio M.A. (2014) Activating HSP72 in rodent skeletal muscle increases mitochondrial number and oxidative capacity and decreases insulin resistance. Diabetes. 63, 1881–1894.
  13. Chung J., Nguyen A.K., Henstridge D.C., Holmes A.G., Chan M.H., Mesa J.L., Lancaster G.I., Southgate R.J., Bruce C.R., Duffy S.J., Horvath I., Mestril R., Watt M.J., Hooper P.L., Kingwell B.A., Vigh L., Hevener A., Febbraio M.A. (2008) HSP72 protects against obesity-induced insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1739–1744.
  14. Chichester L., Wylie A.T., Craft S., Kavanagh K. (2015) Muscle heat shock protein 70 predicts insulin resistance with aging. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 70, 155–162.
  15. Silverstein M.G., Ordanes D., Wylie A.T., Files D.C., Milligan C., Presley T.D., Kavanagh K. (2015) Inducing muscle heat shock protein 70 improves insulin sensitivity and muscular performance in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 70, 800–808.
  16. McArdle A., Dillmann W.H., Mestril R., Faulkner J.A., Jackson M.J. (2004) Overexpression of HSP70 in mouse skeletal muscle protects against muscle damage and age-related muscle dysfunction. FASEB J. 18, 355–357.
  17. Soler C., Daczewska M., Da Ponte J.P., Dastugue B., Jagla K. (2004) Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131, 6041–6051.
  18. Sujkowski A., Wessells R. (2018) Using Drosophila to understand biochemical and behavioral responses to exercise. Exerc. Sport. Sci. Rev. 46, 112–120.
  19. Sujkowski A., Ramesh D., Brockmann A., Wessells R. (2017) Octopamine drives endurance exercise adaptations in Drosophila. Cell Rep. 21, 1809–1823.
  20. Gong W.J., Golic K.G. (2004) Genomic deletions of the Drosophila melanogaster Hsp70 genes. Genetics. 168, 1467–1476.
  21. Han S.K., Lee D., Lee H., Kim D., Son H.G., Yang J.S., Lee S.V., Kim S. (2016) OASIS 2: online application for survival analysis 2 with features for the analysis of maximal lifespan and healthspan in aging research. Oncotarget. 7, 56147–56152.
  22. Mendez S., Watanabe L., Hill R., Owens M., Moraczewski J., Rowe G.C., Riddle N.C., Reed L.K. (2016) The TreadWheel: a novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11, e0164706.
  23. Spierer A.N., Yoon D., Zhu C.T., Rand D.M. (2021) FreeClimber: automated quantification of climbing performance in Drosophila. J. Exp. Biol. 224, jeb229377.
  24. Popov D.V., Makhnovskii P.A., Shagimardanova E.I., Gazizova G.R., Lysenko E.A., Gusev O.A., Vinogradova O.L. (2019) Contractile activity-specific transcriptome response to acute endurance exercise and training in human skeletal muscle. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 316, e605–e614.
  25. Wisniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. (2009) Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6, 359–362.
  26. Popov D.V., Makhnovskii P.A., Zgoda V.G., Gazizova G.R., Vepkhvadze T.F., Lednev E.M., Motanova E.S., Lysenko E.A., Orlov O.I., Tomilovskaya E.S. (2023) Rapid changes in transcriptomic profile and mitochondrial function in human soleus muscle after 3-day dry immersion. J. Appl. Physiol. (1985). 134, 1256–1264.
  27. Yu S.H., Kyriakidou P., Cox J. (2020) Isobaric matching between runs and novel PSM-level normalization in MaxQuant strongly improve reporter ion-based quantification. J. Proteome Res. 19, 3945–3954.
  28. Shilova V.Y., Zatsepina O.G., Garbuz D.G., Funikov S.Y., Zelentsova E.S., Schostak N.G., Kulikov A.M., Evgen’ev M.B. (2018) Heat shock protein 70 from a thermotolerant Diptera species provides higher thermoresistance to Drosophila larvae than correspondent endogenous gene. Insect. Mol. Biol. 27, 61–72.
  29. Xiao C., Hull D., Qiu S., Yeung J., Zheng J., Barwell T., Robertson R.M., Seroude L. (2019) Expression of heat shock protein 70 is insufficient to extend Drosophila melanogaster longevity. G3 (Bethesda). 9, 4197–4207.
  30. Campisi J., Kapahi P., Lithgow G.J., Melov S., Newman J.C., Verdin E. (2019) From discoveries in ageing research to therapeutics for healthy ageing. Nature. 571, 183–192.
  31. Goh J., Wong E., Soh J., Maier A.B., Kennedy B.K. (2023) Targeting the molecular & cellular pillars of human aging with exercise. FEBS J. 290, 649–668.
  32. Bisset E.S., Heinze-Milne S., Grandy S.A., Howlett S.E. (2022) Aerobic exercise attenuates frailty in aging male and female C57Bl/6 mice and effects systemic cytokines differentially by sex. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 77, 41–46.
  33. Garcia-Valles R., Gomez-Cabrera M.C., Rodriguez-Manas L., Garcia-Garcia F.J., Diaz A., Noguera I., Olaso-Gonzalez G., Vina J. (2013) Life-long spontaneous exercise does not prolong lifespan but improves health span in mice. Longev. Healthspan. 2, 14.
  34. Wen D.T., Zheng L., Ni L., Wang H., Feng Y., Zhang M. (2016) The expression of CG9940 affects the adaptation of cardiac function, mobility, and lifespan to exercise in aging Drosophila. Exp. Gerontol. 83, 6–14.
  35. Wen D.T., Wang W.Q., Hou W.Q., Cai S.X., Zhai S.S. (2020) Endurance exercise protects aging Drosophila from high-salt diet (HSD)-induced climbing capacity decline and lifespan decrease by enhancing antioxidant capacity. Biol. Open. 9, bio045260.
  36. Li Q.F., Wang H., Zheng L., Yang F., Li H.Z., Li J.X., Cheng D., Lu K., Liu Y. (2019) Effects of modest hypoxia and exercise on cardiac function, sleep-activity, negative geotaxis behavior of aged female Drosophila. Front Physiol. 10, 1610.
  37. Ebanks B., Wang Y., Katyal G., Sargent C., Ingram T.L., Bowman A., Moisoi N., Chakrabarti L. (2021) Exercising D. melanogaster modulates the mitochondrial proteome and physiology. The effect on lifespan depends upon age and sex. Int. J. Mol. Sci. 22, 11606.
  38. Piazza N., Gosangi B., Devilla S., Arking R., Wessells R. (2009) Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4, e5886.
  39. Sujkowski A., Bazzell B., Carpenter K., Arking R., Wessells R.J. (2015) Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila health span by overlapping mechanisms. Aging (Albany NY). 7, 535–552.
  40. Demontis F., Piccirillo R., Goldberg A.L., Perrimon N. (2013) Mechanisms of skeletal muscle aging: insights from Drosophila and mammalian models. Dis. Model. Mech. 6, 1339–1352.
  41. Hunt L.C., Jiao J., Wang Y.D., Finkelstein D., Rao D., Curley M., Robles-Murguia M., Shirinifard A., Pagala V.R., Peng J., Fan Y., Demontis F. (2019) Circadian gene variants and the skeletal muscle circadian clock contribute to the evolutionary divergence in longevity across Drosophila populations. Genome Res. 29, 1262–1276.
  42. Chechenova M., Stratton H., Kiani K., Gerberich E., Alekseyenko A., Tamba N., An S., Castillo L., Czajkowski E., Talley C., Bryantsev A. (2023) Quantitative model of aging-related muscle degeneration: a Drosophila study. bioRxiv. Feb. 21, 2023.02.19.529145 doi: https://doi.org/10.1101/2023.02.19.529145
  43. Borsch A., Ham D.J., Mittal N., Tintignac L.A., Migliavacca E., Feige J.N., Ruegg M.A., Zavolan M. (2021) Molecular and phenotypic analysis of rodent models reveals conserved and species-specific modulators of human sarcopenia. Commun. Biol. 4, 194.
  44. Lagerwaard B., Nieuwenhuizen A.G., Bunschoten A., de Boer V.C.J., Keijer J. (2021) Matrisome, innervation and oxidative metabolism affected in older compared with younger males with similar physical activity. J. Cachexia Sarcopenia Muscle. 12, 1214–1231.
  45. Su J., Ekman C., Oskolkov N., Lahti L., Strom K., Brazma A., Groop L., Rung J., Hansson O. (2015) A novel atlas of gene expression in human skeletal muscle reveals molecular changes associated with aging. Skelet. Muscle. 5, 35.
  46. Hunt L.C., Graca F.A., Pagala V., Wang Y.D., Li Y., Yuan Z.F., Fan Y., Labelle M., Peng J., Demontis F. (2021) Integrated genomic and proteomic analyses identify stimulus-dependent molecular changes associated with distinct modes of skeletal muscle atrophy. Cell Rep. 37, 109971.
  47. Wheeler J.C., Bieschke E.T., Tower J. (1995) Muscle-specific expression of Drosophila hsp70 in response to aging and oxidative stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 10408–10412.
  48. Попов Д.В., Виноградова О.Л., Згода В.Г. (2019) Подготовка образцов скелетной мышцы человека для протеомных исследований с использованием изобарической метки iTRAQ. Молекуляр. биология. 53, 685‒691.
  49. Deshmukh A.S., Murgia M., Nagaraj N., Treebak J.T., Cox J., Mann M. (2015) Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Mol. Cell Proteomics. 14, 841–853.
  50. Makhnovskii P.A., Zgoda V.G., Bokov R.O., Shagimardanova E.I., Gazizova G.R., Gusev O.A., Lysenko E.A., Kolpakov F.A., Vinogradova O.L., Popov D.V. (2020). Regulation of proteins in human skeletal muscle: the role of transcription. Sci. Rep. 10, 3514.
  51. Rudler D.L., Hughes L.A., Viola H.M., Hool L.C., Rackham O., Filipovska A. (2021) Fidelity and coordination of mitochondrial protein synthesis in health and disease. J. Physiol. 599, 3449–3462.
  52. Khalimonchuk O., Bird A., Winge D.R. (2007) Evidence for a pro-oxidant intermediate in the assembly of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 282, 17442–17449.
  53. Mymrikov E.V., Daake M., Richter B., Haslbeck M., Buchner J. (2017) The chaperone activity and substrate spectrum of human small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 292, 672–684.
  54. Bo Zheng N., Ruan L., Kline J.T., Omkar S., Sikora J., Texeira Torres M., Wang Y., Takakuwa J.E., Huguet R., Klemm C., Segarra V.A., Winters M.J., Pryciak P.M., Thorpe P.H., Tatebayashi K., Li R., Fornelli L., Truman A.W. (2022) Comprehensive characterization of the Hsp70 interactome reveals novel client proteins and interactions mediated by posttranslational modifications. PLoS Biol. 20, e3001839.
  55. Adriaenssens E., Asselbergh B., Rivera-Mejias P., Bervoets S., Vendredy L., De Winter V., Spaas K., de Rycke R., van Isterdael G., Impens F., Langer T., Timmerman V. (2023) Small heat shock proteins operate as molecular chaperones in the mitochondrial intermembrane space. Nat. Cell Biol. 25, 467–480.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Knockout of six Hsp70 family genes reduces the median lifespan of D. melanogaster and has a pronounced negative effect on the speed of locomotion in the negative geotaxis test. a – Normalized number of reads (RNA sequencing) per open reading frame of each gene. n = 12 pools (legs of 15 flies) of each line. b and c – Proportion of surviving flies with normal and chronically elevated levels of motor (locomotor) activity. The p value is shown for comparison of curves, as well as for the median and maximum lifespan (proportion of survivors 50 and 10%); n > 150 in each line. TP – training. d – Age-related changes in the speed of locomotion in the negative geotaxis test. One and three asterisks represent p values ​​< 0.05 and < 0.001, respectively. n = 5–6 pools (10–30 flies per pool) of each line.

Download (287KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Aging induces pronounced and progressive changes in the transcriptome profile of the legs (composed predominantly of muscle fiber bundles) of w1118 flies. Knockout of six Hsp70 family genes modulates age-related changes in the transcriptome of leg skeletal muscles. (a) Number of unique and common genes that are expressed differently in 23- and 47-day-old flies compared to 7-day-old flies. n = 4 pools (legs of 15 flies) of each strain. (b and c) Functional enrichment analysis of genes that are up-regulated (b) and down-regulated (c). The number of genes in each functional category is shown; the heat map shows the p-value.

Download (1MB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Knockout of six genes of the Hsp70 family disrupts the age-related dynamics of gene expression. The line represents the normalized expression values ​​(z-scale) of each gene of some enriched functional groups from Fig. 2b and c. The names and numbers of functional categories are given; n = 4 pools (legs of 15 flies) of each line.

Download (732KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Knockout of six Hsp70 family genes causes opposite changes in the levels of key enzymes of glucose and lipid metabolism (glycolysis, pentose phosphate pathway, Krebs cycle, beta-oxidation, and oxidative phosphorylation) in the leg muscles of 47-day-old flies. a – Changes in mRNA and protein levels in skeletal leg muscles of Hsp70– flies relative to w1118 flies. mRNA n = 4 pools (legs of 15 flies) for each line; protein n = 7–8 pools (legs of 10 flies) for each line. b – Functional enrichment analysis showed that proteins with different patterns of regulation at the mRNA level were enriched in different functional categories. The number of genes in each category is shown; the heat map shows the p-value. c – Opposite changes in the content of oxidative phosphorylation proteins in the legs of 47-day-old Hsp70– flies and w1118 flies (see Fig. S1, Supplementary Materials). N.S. – no change in protein content detected; N.D. – no protein detected.

Download (640KB)
Indexing metadata
6. Supplementary Figure S1
Download (174KB)
Indexing metadata
7. Supplementary Table S1
Download (2MB)
Indexing metadata
8. Supplementary Table S2
Download (20KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».