Substrate efficiency of CY5-modified derivatives of deoxyuridine and deoxycytidine in the rolling circle amplification

P. A. Chirkova; Чиркова П. А.; S. A. Surzhikov; Суржиков С. А.; V. E. Kuznetsova; Кузнецова В. Е.; V. E. Shershov; Шершов В. Е.; A. V. Chudinov; Чудинов А. В.; S. A. Lapa; Лапа С. А.

doi:10.31857/S0026898425010086

Субстратная эффективность CY5-модифицированных производных дезоксиуридина и дезоксицитидина в реакции амплификации по типу катящегося кольца

Авторы: Чиркова П.А.¹, Суржиков С.А.¹, Кузнецова В.Е.¹, Шершов В.Е.¹, Чудинов А.В.¹, Лапа С.А.¹
Учреждения:
1. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Выпуск: Том 59, № 1 (2025)
Страницы: 126-132
Раздел: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
URL: https://journal-vniispk.ru/0026-8984/article/view/294731
DOI: https://doi.org/10.31857/S0026898425010086
EDN: https://elibrary.ru/HCQMZQ
ID: 294731

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Изучена кинетика амплификации и особенности индивидуального и совместного встраивания модифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов в изотермической амплификации ДНК по типу катящегося кольца (RCA). В исследование вошли синтезированные нами шесть пар Су-5-меченных трифосфатов дезоксиуридина (dU) и дезоксицитидина (dC) с аналогичными электронейтральными флуоресцентными заместителями внутри пары, но различающихся для разных пар. Выявлено влияние длины линкера между флуорофором и пиримидиновым основанием на плотность встраивания: нуклеотиды с длиной линкера в шесть атомов углерода встраиваются в растущую цепь ДНК лучше, чем с тремя атомами углерода. Обнаружено, что совместное введение в реакцию трифосфатов в эквивалентной суммарной концентрации не усиливает ингибирующий эффект, что дает основания для более детального изучения одновременного применения флуоресцентно-меченных dU и dC.

Ключевые слова

изотермическая амплификация по типу катящегося кольца, флуоресцентно-меченные dNTP

Полный текст

Введение

Амплификация нуклеиновых кислот — фундаментальный метод молекулярной биологии и генетических исследований. С помощью этого метода можно накопить количество ДНК- или РНК-фрагментов, необходимое для дальнейших анализов, таких как секвенирование, гибридизация и другие. Одно из наиболее перспективных направлений получения анализируемого образца ДНК — изотермическая амплификация, не требующая термоциклера [1], в том числе, реакция амплификации по типу “катящегося кольца” (rolling circle amplification, RCA) [2].

Использование флуоресцентных меток с высокими квантовыми выходами и возможность их введения в ДНК непосредственно в процессе амплификации позволяют повысить чувствительность и надежность диагностических систем, основанных на гибридизационном анализе либо амплификации на твердой подложке (биологические микрочипы). Одним из наиболее востребованных классов флуорофоров для введения меток в ДНК являются флуоресцентные цианиновые красители ряда Cy5 [3]. Cy5-пиримидиновые нуклеотиды способны эффективно встраиваться в формирующуюся цепь ДНК в процессе амплификации. Это позволяет визуализировать и измерять уровень амплификации в реальном времени, что имеет важное значение для мониторинга и оптимизации процесса [4]. Однако существует проблема ингибирования реакции, что может привести к формированию артефактов и искажению результатов амплификации. Возможным решением для поднятия чувствительности анализа может стать параллельное введение в реакцию разноименных Cy5-трифосфатов без увеличения их суммарной концентрации в реакционном растворе.

В настоящей работе проведено комплексное изучение субстратной эффективности синтезированных нами шести пар трифосфатов дезоксиуридина и дезоксицитидина в варианте изотермической амплификации RCA с использованием полимеразы BST 3.0. Эта работа расширяет начатые нами исследования двух пар модифицированных дезоксиуридинтрифосфатов [5]. Изучена кинетика амплификации с определением эффективности RCA (E_t) и плотность встраивания в растущую цепь ДНК каждого из меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов (K). Изучено влияние структуры флуорофора и природы самого трифосфата (dU или dC) на степень ингибирования реакции. В качестве модельной матрицы для амплификации использовали полногеномную ДНК одного из важных возбудителей пневмонии — золотистого стафилококка Staphylococcus aureus.

Экспериментальная часть

Штаммы. Геномная ДНК S. aureus (ATCC 25923) была выделена и деконтаминирована на базе ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск, Россия) согласно [6].

Праймеры и другие олигонуклеотиды. Праймеры для RCA-амплификации cконструировали с помощью сетевого ресурса Integrated DNA Technologies (idtdna.com), специфичность анализировали с использованием алгоритма BLAST (NIH, США). Использовали два праймера: прямой — 5ꞌ-CGATAGACGATACCTGCCATCG-3ꞌ и обратный — 5ꞌ-ATCGTCATCTGCATTCCATC-3ꞌ.

Для создания кольцевого видоспецифичного олигонуклеотида синтезировали линейный 90-мерный олигонуклеотид, Ph-TTAGAGGCATGTGGTTATGCTAGCAACAGATAGACAAGATGGAATGCAGATGACGATAGACGATACCTGCCATCGTTTTGGCTTGCATTA-3ꞌ, фосфорилированный по 5ꞌ-концу, где Ph — фосфат.

Твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляли с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA (“Applied Biosystems”, США) по стандартному регламенту и очищали на колонке BDS Hypersil C18 (“Thermo”, США).

RCA в режиме реального времени с флуоресцентно-меченными трифосфатами. Для создания закольцованного 90-мерного олигонуклеотида использовали T4-лигазу (“NEB”, США) и геномную ДНК S. aureus. Полученный кольцевой олигонуклеотид после очистки на микроколонках набора GeneGET Purification kit (“Thermo”) и измерения концентрации использовали в качестве матрицы в RCA.

Реакционная смесь содержала природные dNTP в концентрации 0.2 мМ, 1.6 ед. BST 3.0 ДНК-полимеразы (“New England Biolabs”, США) и соответствующий ей реакционный буфер в количестве, рекомендуемом производителем; различные меченые dUTP и dCTP [7–9] в концентрации 32 мкМ при индивидуальном введении или 16 мкМ каждого при совместном; кольцевую матрицу (10⁴ копий) и специфичные праймеры в концентрации 5 пмоль на 20 мкл реакционного объема. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Gentier 96E (“Tianlong”, Китай) в режиме реального времени по следующей программе: 50 мин при 65°C при съемке сигнала флуоресценции 1 раз в минуту, далее режим хранения (10°C). Накопление продукта реакции визуализировали с помощью интеркалирующего красителя EvaGreen (“Biotium”, США).

Очистка продуктов реакции. Продукты RCA освобождали от праймеров и трифосфатов дезоксинуклеозидов (в том числе меченых) с помощью набора GeneGET Purification kit (“Thermo”) в соответствии с инструкцией производителя. Полученный продукт в реакционном объеме 20 мкл смывали с колонки GeneGET равным объемом воды Milli-Q. С помощью электрофореза в агарозном геле и возбуждения флуоресценции на длине волны 630 нм контролировали степень очистки от флуоресцентно-меченных dNTP для исключения их влияния при последующем спектрофотометрическом определении количества метки, включившейся в ДНК.

Электрофорез в агарозном геле. Полученные в ходе изотермической амплификации продукты разделяли в 4%-ном агарозном геле (Agarose LE, “Helicon”, Россия) в течение 40 мин при 10 В/см, затем окрашивали в течение 10 мин с помощью SYBR Green I (“Molecular Probes”, США) в 1 × буфере TBE (“Хеликон”, Россия). Для визуализации использовали систему гельдокументирования ChemiScope 6200 Touch (“Clinx Science Instruments”, КНР). Общую детекцию ДНК осуществляли с использованием встроенных LED-светодиодов и светофильтров “Green light excitation/emission” и окрашивания SYBR Green I; избирательную детекцию олигонуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями ряда Cy5с, проводили с использованием встроенных LED-светодиодов и светофильтров “Red light excitation/emission”.

Спектрофотометрия. Спектрофотометрический анализ проводили на приборе NanoPhotometer NP80 (“Implen”, Германия) на длинах волн 260 и 647 нм для расчета выходов суммарной ДНК и включившейся флуоресцентной метки соответственно.

Результаты и обсуждение

В настоящей работе исследованы шесть пар модифицированных производных дезоксиуридина и дезоксицитина с аналогичными флуоресцентными заместителями внутри пары и различающиеся длиной линкера между флуорофором и азотистым основанием, а также длиной линкера между вторым гетероциклом флуорофора и четвертичной аммониевой группой, входящей в состав красителя. В качестве контрольной выбрали пару dU и dC, в которой Су5-краситель связан с азотистым основанием посредством линкера через сульфогруппу (U_к и C_к). В настоящее время меченый дезоксиуридинтрифосфат U_к широко используется в технологии гелевых микрочипов [6, 8]. Структурные формулы меченых дезоксинуклеотидов представлены на рис. 1, структуры R_1–4 указаны в табл. 1.

Рис. 1. Структурные формулы азотистых оснований и флуорофора. а — Флуоресцентно-меченный 5-аллиламин-2ꞌ-дезоксиуридин-5ꞌ-трифосфат (dUTP-Dye); б — флуоресцентно-меченный 5-аллиламин-2ꞌ-дезоксицитидин-5ꞌ-трифосфат (dСTP-Dye); в — флуоресцентный краситель (Dye). R1–4 приведены в табл. 1.

Таблица 1. Флуоресцентно-меченные нуклеозидтрифосфаты R_1–4

Нуклеозид- трифосфат	№_{синтеза}	R₁	R₂	R₃	R₄
dU_к	49	C₂H₅	SO₂NHCO(CH₂)₆CONHCH₂ (CH)₂dUTP	SO₃^-	C₂H₅
dC_к	129	C₂H₅	SO₂NHCO(CH₂)₆CONHCH₂ (CH)₂dCTP	SO₃^-	C₂H₅
dU₁	2	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dUTP	H	SO₃^-	C₂H₅
dC₁	128	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dCTP	H	SO₃^-	C₂H₅
dU₂	79	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dUTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₃N(CH₃)₃⁺
dC₂	128	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dCTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₃N(CH₃)₃⁺
dU₃	81	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dUTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₅N(CH₃)₃⁺
dC₃	128	(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dCTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₅N(CH₃)₃⁺
dU₄	80	(CH₂)₅CONH(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dUTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₃N(CH₃)₃⁺
dC₄	128	(CH₂)₅CONH(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dCTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₃N(CH₃)₃⁺
dU₅	82	(CH₂)₅CONH(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dUTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₅N(CH₃)₃⁺
dC₅	128	(CH₂)₅CONH(CH₂)₅CONHCH₂(CH)₂dСTP	SO₃^-	SO₃^-	(CH₂)₅N(CH₃)₃⁺

Мы определяли такие показатели субстратной эффективности модифицированных dU и dC, как величина E_t (эффективность амплификации), позволяющая оценить степень ингибирования RCA; выход целевого продукта; коэффициент встраивания “K”. Для повышения точности определения ингибирующего эффекта был скорректирован алгоритм расчета E_t, представленный в [5]: учитывали только время накопления сигнала от начала экспоненциального роста кривой накопления сигнала до выхода на плато вместо общего времени проведения реакции. Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сводная таблица показателей субстратной эффективности Cy5-меченных dU и dC

dNTP, мкМ	Выход продукта ± σ, мкг	E_t± σ	K ± σ
dU_к (32)	1.88 ± 0.02	1.21 ± 0.05	0.36 ± 0.005
dC_к (32)	2.14 ± 0.1	1.30 ± 0.02	0.20 ± 0.02
dU_к (16) + dC_к (16)	1.54 ± 0.29	1.24 ± 0.02	0.32 ± 0.01
dU₁ (32)	0.76 ± 0.02	1.11 ± 0.01	0.19 ± 0.02
dC₁(32)	2.09 ± 0.16	1.20 ± 0.01	0.12 ± 0.01
dU₁ (16) + dC₁(16)	0.96 ± 0.2	1.16 ± 0.02	0.20 ± 0.02
dU₂ (32)	1.94 ± 0.39	1.34 ± 0.04	0.09 ± 0.02
dC₂ (32)	2.25 ± 0.31	1.34 ± 0.04	0.07 ± 0.01
dU₂ (16) + dC₂ (16)	2.22 ± 0.42	1.38 ± 0.02	0.11 ± 0.01
dU₃ (32)	2.36 ± 0.03	1.34 ± 0.03	0.14 ± 0.005
dC₃ (32)	2.58 ± 0.21	1.35 ± 0.04	0.11 ± 0.02
dU₃(16) + dC₃ (16)	2.13 ± 0.17	1.39 ± 0.01	0.15 ± 0.01
dU₄ (32)	2.28 ± 0.17	1.30 ± 0.01	0.24 ± 0.005
dC₄ (32)	2.42 ± 0.05	1.29 ± 0.08	0.18 ± 0.03
dU₄(16) + dC₄ (16)	2.12 ± 0.24	1.38 ± 0.02	0.20 ± 0.03
dU₅ (32)	2.40 ± 0.13	1.31 ± 0.02	0.20 ± 0.02
dC₅ (32)	2.25 ± 0.22	1.34 ± 0.06	0.10 ± 0.01
dU₅ (16) +dC₅(16)	1.68 ± 0.3	1.36 ± 0.01	0.18 ± 0.02

Кинетику реакции изучали в RCA c применением полимеразы Bst 3.0. Концентрацию Cy5-dNTP определяли, проводя амплификацию с разными их концентрациями — от 16 до 64 мкМ. После сравнения таких показателей, как выход продукта и степень ингибирования реакции, выбрали оптимальную для индивидуального встраивания концентрацию меченых трифосфатов, равную 32 мкМ. При одновременном применении использовали по 16 мкМ dU и dC, т.е. их суммарная концентрация была равна оптимальной для индивидуального введения в реакцию. Степень ингибирования, показателем которого является эффективность амплификации E_t, рассчитывали по величине угла наклона прямого участка кривой накопления, представленной в логарифмическом масштабе [10]. Кривые накопления сигналов представлены на рис. 2. Видно, что одновременное введение в реакцию обоих модифицированных трифосфатов не приводит к снижению скорости накопления продукта.

Рис. 2. Кинетика амплификации RCA при индивидуальном и при совместном введении в реакцию меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов с эквивалентной суммарной концентрацией (пояснения в тексте). Для наглядности в каждой группе кривые нормированы по максимуму величины флуоресцентного сигнала.

Продукты реакции очищали на микроколонках с мембранами на основе диоксида кремния для последующего измерения плотности встраивания метки спектрофотометрическим методом. Это позволило количественно убрать непрореагировавшие флуоресцентно-меченные трифосфаты и тем самым гарантировать получение сигнала только от меток, которые встроились в цепи ДНК в процессе их роста. На рис. 3 представлена электрофореграмма в двухволновом режиме, позволяющая визуально оценить степень очистки от свободных флуоресцентно-меченных Cy5 dNTP.

Рис. 3. Визуализация степени очистки продуктов реакции от свободных флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов в двухканальном режиме возбуждения/детекции (“зеленый” канал 530/585 нм и “красный” канал 630/690 нм). а — Электрофореграмма продуктов RCA до очистки; б — после очистки. L — маркер длин дцДНК GeneRuler 50 bp; 1 — dU_к; 2 — dC_к; 3 — dU_к+dC_к; 4 — dU₃; 5 — dC₃; 6 — dU₃+dC₃; 7 — dU₅; 8 — dC₅; 9 — dU₅+dC₅.

Выход продукта определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Для оценки плотности встраивания метки использовали коэффициент встраивания “K” — соотношение поглощения образца на длине волны 647 нм (метка) и на 260 нм (ДНК).

Обнаружено влияние длины линкера между флуорофором и пиримидиновым основанием на плотность встраивания трифосфатов дезоксинуклеозидов. Удлинение линкера с трех до шести атомов углерода повысило способность полимеразы воспринимать меченые нуклеозидтрифосфаты в качестве субстрата. На рис. 4 представлены три электрофореграммы: “зеленый канал”, окраска SYBR, визуализация суммарного продукта реакции (а); “красный” канал, проявление флуоресценции Су5-меченных трифосфатов (б); двухволновой режим, содержащий сигналы с обоих каналов (в). Видно, что в каждой паре меченых dU и dC с аналогичным флуорофором и линкером большей плотностью встраивания обладает производное уридина. На рис. 4б визуально можно оценить влияние удлинения линкера на плотность встраивания. Однако совместное использование dU и dC с коротким линкером показало большую плотность встраивания, чем индивидульное. Это может говорить об отсутствии эффекта “суммарной концентрации” для таких нуклеозидтрифосфатов.

Рис. 4. Влияние длины линкера на плотность встраивания Cy5-нуклеотидов в RCA. а — Визуализация RCA на “зеленом” канале 530/585 нм; б — на “красном” канале 630/690 нм; в — в двухканальном режиме возбуждения и детекции. L — маркер длин дцДНК GeneRuler 50 bp; 1 — dU_к; 2 — dC_к; 3 — dU_к+ + dC_к; 4 — dU₃; 5 — dC₃; 6 — dU₃ + dC₃; 7 — dU₅; 8 — dC₅; 9 — dU₅ + dC₅.

Удлинение углеродной цепи между четвертичной аммониевой группой, входящей в состав красителя, и соответствующим (вторым) гетероциклическим фрагментом флуорофора в парах с коротким линкером позволило получить большую плотность встраивания меченых трифосфатов как при совместном, так и при индивидуальном введении. При этом в парах с длинным линкером такое же удлинение понизило плотность встраивания. Существенно большее влияние на субстратную эффективность оказывает длина линкера между азотистым основанием нуклеотида и флуорофором.

Заключение

Тестирование степени одновременного и индивидуального встраивания флуоресцентно-меченных трифосфатов с учетом выхода продукта в реакции RCA показало, что наибольшая субстратная эффективность, необходимая для повышения чувствительности анализа, достигается при введении в реакцию дезоксиуридинов с длинным линкером между азотистым основанием нуклеотида и флуорофором. Одновременное введение dU и dC выглядит перспективным для обеспечения универсальности диагностических систем при одновременном анализе нескольких ДНК-матриц различного GC-состава.

Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 22-14-00257.

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.