Dominant Bacterial Taxa of Chernozems and Factors Affecting Their Abundance in the Bacterial Community

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Черноземы [3] занимают значительные площади на евразийском континенте [24] и активно используются для сельскохозяйственного производства [11, 13]. Этому способствуют такие их свойства, как высокое содержание органических веществ [25] и значения рН, близкие к нейтральным [36]. Обилие органического вещества в почве обеспечивает удержание влаги и питательных веществ [39, 41], что повышает ее естественное плодородие и эффективность использования удобрений. Эти свойства черноземов обусловливают их ценность и своеобразное место эталона пахотных почв. Большое количество работ посвящено их физико-химическим характеристикам [42], биологическому разнообразию и поддержанию плодородия [40].

Цель работы – выявление бактериальных таксонов на уровне семейства и рода, доминирующих в черноземах лесостепной зоны на примере Белгородской области, и оценка влияния на них различных агрохимических факторов. В современной почвенной микробиологии следует отметить тенденцию к широкому использованию статистических методов, позволяющих характеризовать и сопоставлять почвенные микробные сообщества в целом [8, 43, 28]. В то же время, как правило, не ставится целью подробное рассмотрение встречаемости отдельных семейств и родов микроорганизмов. В значительной мере это связано с методологическими проблемами, так как достоверность количественных данных по отдельным семействам и родам может ставиться под сомнение, по причине, в частности, преимущественного связывания ПЦР-праймеров с последовательностями, принадлежащими определенным таксонам [34, 21].

В настоящей работе исходили из предположения, что уклоны ПЦР (PCR biases) не будут искажать таксономическую структуру сообщества до неузнаваемости, если включить в нее достаточное количество семейств и родов, занимающих значительные доли в сообществе. Брали в расчет не только средние показатели встречаемости таксона, но и их разброс, демонстрирующий менее типичные, но также допустимые в природе ситуации.

Рассматривали 20 наиболее многочисленных семейств, занимающих в сообществе суммарную долю в среднем около 40%, и, вероятно, играющих значительные роли в его биохимической активности. Формирование такого перечня групп, доминирующих в бактериальной микробиоте черноземов, представляет фундаментальный интерес с точки зрения дальнейшего изучения распределения в ней ее основных биохимических функций, таких как химические превращения питательных веществ, используемых растениями, сохранение или расход почвенного органического вещества, влияние на значения pH. Также выявляли корреляционные зависимости, связывающие доли бактериальных семейств в сообществе с землепользованием и агрохимическими показателями.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Отбор образцов почвы. Исследование проводили на территории Белгородской области России, в южной части Среднерусской возвышенности, в бассейнах рек Оскол и Северский Донец, входящих в речную систему Дона (рис. 1). Белгородская область расположена в зоне лесостепи на приподнятой равнине с выраженными эрозионными явлениями, высота над уровнем моря составляет в среднем 200 м. Среднегодовая температура воздуха в различных точках региона варьирует в пределах 5.4–6.8°С. Январь является самым холодным месяцем, безморозный период продолжается в течение 155–160 дней, продолжительность солнечного сияния – 1800 ч/год. Зимой почва промерзает на 0.5–1.0 м. В различных районах области годовое количество осадков варьирует от 540–550 до 400 мм. Лесистость области составляет 9.8% [1]. Зональные почвы представлены различными подтипами черноземов, занимающими 77% территории, и серыми лесными почвами (15% территории) [2].

 

Рис. 1. Точки отбора проб на почвенной карте Белгородской области России

 

На исследуемой территории наиболее распространен в регионе типичный чернозем (Haplic Chernozem). Его обширные участки соседствуют с выщелоченными черноземами (Luvic Chernozem), которые также широко распространены. В юго-восточной части области преобладает обыкновенный чернозем (Haplic Chernozem), характерный для более аридных условий. Кроме того, в области присутствуют менее распространенные разновидности черноземов, привязанные к определенным формам рельефа. Это пойменно-луговые черноземы (Gleyic Chernozems), обычные в поймах рек. Эрозионные процессы выводят к поверхности залежи мела, при этом на склонах нередко формируются карбонатно-меловые черноземы (Calcaric Phaeozems). Также присутствуют солонцеватые черноземы (Gleyic Chernozems (Protosodic)).

Изучены типичный, выщелоченный и обыкновенный черноземы, отобрано 40 почвенных образцов (табл. 1). Для отбора выбирали места, в которых пахотные угодья соседствовали с непахотными (неокультуренные и окультуренные почвы). Пахотные участки всех изученных черноземов были засеяны озимой пшеницей, растительность непахотных участков включала разнотравье либо лиственные породы и травяной подлесок. Каждая проба состояла из 20 частей, собранных в гумусово-аккумулятивном горизонте (А₁) с глубины 5–15 см на расстоянии 3–4 м друг от друга. Места отбора образцов пахотной и непахотной почвы каждого типа чернозема находились на расстоянии 10–20 м. Вес каждой сборной пробы около 1 кг. Отбор проводили на тех же местах дважды в конце июня и в конце августа 2022 г.

 

Таблица 1. Количество образцов пахотного (п.) и непахотного (н.п.) чернозема разного подтипа (горизонт А₁, глубина 5–15 см)

Время	Чернозем						Сумма
	типичный		выщелоченный		обыкновенный
	п.	н.п.	п.	н.п.	п.	н.п.
Конец июня 2022 г.	4	4	3	3	3	3	20
Конец августа 2022 г.	4	4	3	3	3	3	20
Сумма	8	8	6	6	6	6	40

 

Микробиологическое профилирование. Экспериментальные процедуры проводили как описано в работе [9]. В день сбора каждый образец почвы тщательно измельчали до размера частиц менее 2 мм, перемешивали. Корни растений и другие выявленные органические остатки удаляли. После перемешивания образцы замораживали без предварительного высушивания и хранили при температуре –80°C. ДНК выделяли из навески массой 0.3 г с использованием FastDNA Spin Kit for Soil DNA Extraction (MP Biomedicals, США). Для получения апликонов фрагмента гена 16S рРНК, содержащего гипервариабельные участки V3 и V4 проводили двухстадийную ПЦР. После очистки на магнитных частицах Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) ампликоны использовали для подготовки библиотек и парноконцевого секвенирования на секвенаторе Illumina MiSeq (Illumina, США). Для каждого образца получено не менее 10 000 парных прочтений. Для первичной обработки данных использовали программный пакет QIIME 1.9.1 [10], в частности отсеивали последовательности с показателем качества менее Q30. Таксономическую идентификацию полученных последовательностей проводили с использованием базы данных Silva [27] версии 132. Применяли классификационный порог 97%. Расчеты встречаемости различных таксонов выполняли при помощи алгоритмов, созданных для этой цели на программном языке Python 3.

Агрохимический анализ. Значение рН почвы определяли в растворе 1 М KCl при соотношении почва : раствор 1 : 2.5 с использованием стеклянного электрода (ГОСТ 26483-85). Массовую долю органического вещества (C_орг, %) определяли по методу Тюрина, фотометрическим методом, основанным на окислении раствором K₂Cr₂O₇ в серной кислоте с последующим определением содержания трехвалентного хрома при длине поглощаемой волны 590 нм (ГОСТ 26213-2021). Подвижные формы Р и К (в пересчете соответственно на P₂O₅ и K₂O, мг/кг почвы) определяли по методу Чирикова, основанному на извлечении подвижных соединений фосфора и калия из почвы 0.5 М раствором уксусной кислоты при отношении почвы к раствору 1 : 25 с последующим определением фосфора в виде синего фосфорно-молибденового комплекса на фотоэлектроколориметре, и калия – на пламенном фотометре (ГОСТ 26204-91). Содержание нитратов (N – NO_3, мг/кг почвы) измеряли путем их извлечения из почвы 1 М раствором K₂SO₄ при соотношении массы пробы почвы и объема раствора 1 : 2.5 с последующим определением нитратов в вытяжке с помощью ионоселективного электрода (ГОСТ 26951-86). Определение содержания аммония (N – NH_4, мг/кг почвы) проводили путем его извлечения из почвы 1 М раствором KCl и получения окрашенного индофенольного соединения путем воздействия гипохлоритом и салицилатом натрия в щелочной среде с последующим фотометрированием окрашенного раствора (ГОСТ 26489-85).

Статистическая обработка данных. Для анализа влияния подтипа почвы, землепользования и химических свойств почвы на структуру сообщества микроорганизмов применяли перестановочный (пермутационный) многомерный дисперсионный анализ (Permutational Multivariate Analysis of Variance, Permanova) [7] с использованием матриц расстояний [29]. Взаимодействие независимых переменных между собой не учитывали, зависимой переменной выступала таксономическая структура сообщества на уровне семейств. Индексы несходства были рассчитывали методом Брэя–Кертиса, на их основе составили матрицу расстояний между сообществами, которую использовали для проведения многомерного дисперсионного анализа.

Тестировали различия долей микроорганизмов каждого из семейств в микробных сообществах черноземов, различающихся 1) типом землепользования, 2) подтипом чернозема, 3) временем отбора почвенных образцов, используя метод непараметрического дисперсионного анализа Крускала–Уоллиса [23]. Для анализа различий встречаемости семейств в разных подтипах чернозема использовали попарные множественные сравнения с использованием критерия ранговой суммы Уилкоксона [44] с коррекцией p-значений методом Бениамини–Хохберга.

Корреляционный анализ взаимосвязи между долей семейства в сообществе и значениями химических параметров почвы проводили с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Все статистические расчеты выполняли в среде R версии 4.1.2 с использованием пакета ‘vegan’ [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Бактериальные семейства, доминирующие в микробиоте чернозема. Анализ бактериальных сообществ на соседствующих пахотных и непахотных участках, в конце июня и в конце августа, показал близость средних долей доминирующих семейств (табл. 2). Все рассмотренные семейства способны многократно менять свои доли в зависимости от локации (табл. 3). Они могут быть охарактеризованы как постоянные и существенные участники функционирования микробиоты черноземов. При этом размах их варьирования может быть следствием определенной степени экологической взаимозаменяемости, при которой экологические ниши представителей различных семейств в значительной мере перекрываются [20, 16]. С этим толкованием согласуется относительное постоянство средних значений, сохраняющееся даже в отличающихся экологических условиях, таких как сельскохозяйственная деятельность или ее отсутствие, а также на разных фазах вегетационного периода. Этот наблюдаемый уровень постоянства открывает потенциальную возможность более детального изучения распределения базовых экологических функций в микробных сообществах черноземов.

 

Таблица 2. Доля наиболее многочисленных семейств в пахотных (п.) и непахотных (н.п.) черноземах в разные фазы вегетационного периода (июнь, август). Жирный шрифт указывает на статистически значимое преобладание в почвах, подчеркивание – то же для одного из месяцев, %, среднее ± стандартное отклонение

Семейство	Июнь		Август		Среднее (n = 40)
	п. (n = 10)	н.п. (n = 10)	п. (n = 10)	н.п. (n = 10)
Gemmatimonadaceae	7.59 ± 1.66	3.87 ± 1.99	6.85 ± 1.25	3.32 ± 1.87	5.41 ± 2.49
Chitinophagaceae	4.54 ± 0.50	4.53 ± 1.06	5.70 ± 0.79	4.70 ± 1.05	4.87 ± 0.98
Sphingomonadaceae	6.31 ± 2.25	6.38 ± 2.81	4.29 ± 1.66	1.33 ± 0.77	4.58 ± 2.84
Xanthobacteraceae	3.03 ± 0.60	4.56 ± 1.94	2.79 ± 0.65	4.86 ± 1.08	3.81 ± 1.47
Chthoniobacteraceae	2.10 ± 1.05	2.52 ± 1.97	2.50 ± 0.98	4.29 ± 2.61	2.85 ± 1.92
Rubrobacteriaceae	2.51 ± 0.87	3.01 ± 1.23	1.73 ± 0.60	2.30 ± 0.93	2.39 ± 1.01
Burkholderiaceae	2.30 ± 1.33	2.18 ± 0.76	1.65 ± 0.40	1.10 ± 0.39	1.81 ± 0.92
Microscillaceae	0.88 ± 0.75	2.12 ± 0.72	1.64 ± 0.95	2.00 ± 0.99	1.66 ± 0.96
Nocardioidaceae	1.36 ± 0.27	2.03 ± 0.48	1.37 ± 0.40	1.37 ± 0.15	1.53 ± 0.44
Micromonosporaceae	0.97 ± 0.31	1.40 ± 0.70	1.42 ± 0.53	1.80 ± 0.66	1.40 ± 0.62
Solirubrobacteraceae	1.18 ± 0.32	1.97 ± 0.59	0.92 ± 0.25	1.21 ± 0.17	1.32 ± 0.53
Pedosphaeraceae	1.07 ± 0.49	0.79 ± 0.47	1.59 ± 0.38	1.73 ± 0.46	1.29 ± 0.58
Pyrinomonadaceae	1.05 ± 0.37	0.53 ± 0.23	1.62 ± 0.69	1.93 ± 0.67	1.28 ± 0.74
SC-I-84 (Burkholderiales)	1.90 ± 1.02	0.97 ± 0.49	1.34 ± 0.77	0.73 ± 0.52	1.23 ± 0.83
Ilumatobacteraceae	0.86 ± 0.26	1.72 ± 0.91	1.07 ± 0.28	1.24 ± 0.47	1.22 ± 0.62
Nitrosomonadaceae	1.33 ± 0.45	0.91 ± 0.25	1.35 ± 0.38	1.20 ± 0.41	1.20 ± 0.41
Xanthomonadaceae	1.48 ± 1.13	1.15 ± 0.58	1.42 ± 0.64	0.52 ± 0.11	1.14 ± 0.78
Blastocatellaceae	1.06 ± 0.37	0.99 ± 0.31	1.46 ± 0.48	0.67 ± 0.27	1.04 ± 0.45
Haliangiaceae	1.03 ± 0.51	0.76 ± 0.33	1.15 ± 0.37	1.05 ± 0.40	1.00 ± 0.42
Caulobacteraceae	0.91 ± 0.48	1.40 ± 0.62	0.70 ± 0.27	0.54 ± 0.21	0.89 ± 0.52
Сумма	43.43	43.77	42.56	37.86	41.91

 

Таблица 3. Доминирующие роды 20 крупнейших семейств почвенных бактерий. Приведены диапазоны средних процентных долей в микробных сообществах черноземов для семейств и родов. Показаны роды, которые могут составлять более 1% от всего сообщества, если в семействе таких не обнаружено, приведен и выделен курсивом наиболее распространенный род. Столбец Среднее относится к родам, средние доли семейств приведены в табл. 2

Семейство	Доля, %	Род	Доля, %	Среднее, %
Gemmatimonadaceae	1.62–10.19	Gemmatimonas	0.2–5.8	2.15 ± 1.4
Chitinophagaceae	3.11–6.71	Ferruginibacter Flavisolibacter Terrimonas	0.17–1.67 0.02–1.72 0.1–1.64	0.55 ± 0.32 0.66 ± 0.39 0.54 ± 0.26
Sphingomonadaceae	0.42–11.35	Sphingomonas Novosphingobium Altererythrobacter	0.18– 8.84 0.0–1.13 0.0–1.01	3.58 ± 2.42 0.20 ± 0.20 0.29 ± 0.24
Xanthobacteraceae	1.5–8.85	Bradyrhizobium	0.6–3.51	1.53 ± 0.63
Chthoniobacteraceae	0.58–10.52	Cand. Udaeobacter Chthoniobacter	0.25–9.64 0.2– 1.32	2.21 ± 1.81 0.64 ± 0.28
Rubrobacteriaceae	0.75–4.96	Rubrobacter	0.75–4.96	2.39 ± 1.01
Burkholderiaceae	0.52–5.34	Massilia	0.0–2.05	0.30 ± 0.42
Microscillaceae	0.16–3.49	Chryseolinea	0.0–0.88	0.18 ± 0.22
Nocardioidaceae	0.9–3.18	Nocardioides Kribbella	0.37–1.84 0.19–1.12	0.86 ± 0.37 0.44 ± 0.17
Micromonosporaceae	0.48–2.95	Actinoplanes	0.0–1.53	0.29 ± 0.30
Solirubrobacteraceae	0.62–2.79	Solirubrobacter	0.31–2.15	0.86 ± 0.41
Pedosphaeraceae	0.18–2.48	ADurb.Bin063-1	0.0–0.37	0.09 ± 0.10
Pyrinomonadaceae	0.17–2.92	RB41	0.17–2.92	1.28 ± 0.74
SC-I-84 (Burkholderiales)	0.08–3.18	–	–	-
Ilumatobacteraceae	0.33–3.6	Ilumatobacter	0.0–1.48	0.30 ± 0.26
Nitrosomonadaceae	0.57–1.99	Ellin6067 MND1	0.14–1.18 0.06–1.06	0.60 ± 0.24 0.47 ± 0.28
Xanthomonadaceae	0.31–4.46	Stenotrophomonas Lysobacter Pseudoxanthomonas	0.0–1.95 0.04–1.66 0.0–1.07	0.11 ± 0.30 0.53 ± 0.33 0.14 ± 0.21
Blastocatellaceae	0.31–2.17	Aridibacter	0.0–0.28	0.01 ± 0.04
Haliangiaceae	0.31–2.16	Haliangium	0.31–2.16	1.00 ± 0.42
Caulobacteraceae	0.23–2.13	Phenylobacterium	0.02–1.2	0.36 ± 0.22

 

Микробиологическое профилирование показало наличие в собранных образцах бактерий, относимых не менее чем к 237 семействам. Первые шесть из них, представленные в таблицах, в среднем формируют около четверти общего состава бактериального сообщества, с учетом нераспознанных последовательностей. Первые двадцать формируют около 40%. Таким образом, рассмотренный в работе список семейств характеризует существенную часть микробиоты.

Большинство семейств включает определенные доминирующие роды. Их доли в сообществе варьируют в еще более широких пределах, чем доли семейств, что указывает на еще большую экологическую взаимозаменяемость на этом таксономическом уровне. Вероятно, следует рассматривать высокую среднюю долю некоторых бактериальных родов, как признак их участия в осуществлении наиболее важных биохимических функций, выполняемых бактериями в почве. Таким образом, детальное изучение биохимических возможностей их представителей способно помочь оценить выраженность определенных процессов и их значение для почвенной экосистемы.

К сожалению, работ, позволяющих сопоставить полученными результаты, мало. Как правило исследования, использующие микробиологическое профилирование, ставят целью целостную характеристику микробных сообществ с точки зрения биоразнообразия, постоянства их структуры и влияния определенных факторов, не углубляясь в перечисление доминирующих таксонов на уровне семейств и родов. Тем не менее, существует ряд работ, содержащих такие сведения.

В работе [18] показано, что в типичном черноземе (пахотные и непахотные участки, Курская область, примерно в 100 км северо-западнее района настоящего исследования) наиболее распространенными семействами были Bradyrhizobiaceae, Mycobacteriaceae, Streptomycetaceae, Pseudomonadaceae, Planctomycetaceae, Micromonosporaceae, Xanthomonadaceae, Sphingomonadaceae, Acidobacteraceae и Comamonadaceae. В настоящем исследовании семейства Micromonosporaceae, Xanthomonadaceae и Sphingomonadaceae также относятся к преобладающим. По сравнению с настоящими результатами, в работе [18] семейства Mycobacteriaceae, Streptomycetaceae и Pseudomonadaceae существенно более распространены. На уровне родов, как и в полученных в настоящем исследовании результатах, весьма многочисленен род Bradyrhizobium. Оба исследования показали обилие представителей родов Solirubrobacter, Sphingomonas и Chtoniobacter.

В Курской области проведена работа, освещающая различия встречаемости бактериальных таксонов в пахотном и непахотном типичном черноземе [4]. Показана высокая численность родов Pseudomonas (Pseudomonadaceae), Bacillus (Bacillaceae), Kaistobacter (Sphingomonadaceae) и Candidatus Solibacter (Solibacteraceae). Род Kaistobacter является гетеротипическим синонимом Sphingomonas [32], который продемонстрировал высокую встречаемость в проведенном нами исследовании.

В работе [33] образцы пахотного и непахотного типичного чернозема были собраны в Воронежской области. Частично приведенные данные по доминирующим семействам и родам продемонстрировали обилие представителей семейства Chitinophagaceae, что совпадает с настоящими результатами, а также большее количество представителей Gaiellaceae, Hyphomicrobiaceae и Syntrophobacteraceae. Показана высокая численность рода Chthoniobacter, более многочисленен род Rhodoplanes, составляющий в наших образцах в среднем лишь 0.34%.

Различия в списке доминирующих таксонов в черноземах одного и того же подтипа соседствующих Белгородской, Курской и Воронежской областей могут иметь различные причины, в том числе методологического характера. Статьи, опубликованные в разные годы, отличаются используемой таксономической номенклатурой, с чем приходится сталкиваться при сопоставлении литературных данных. Применяемые методы микробиологического профилирования могут иметь погрешности, занижающие или завышающие доли определенных таксонов. Основное влияние оказывает различная эффективность амплификации гипервариабельных участков генов 16S рРНК с различной нуклеотидной последовательностью при помощи тех или иных пар праймеров. В настоящей работе микробиологическое профилирование проводили с использованием гипервариабельных участков гена 16S рРНК V3 и V4 [9]. Участок V4 использовался в работах [4, 33], работа [18] основана на применении метагеномного секвенирования методом дробовика (shotgun sequencing). Наконец, экологическая взаимозаменяемость видов, принадлежащих к разным таксонам, основанная на значительном совпадении доступных им экологических ниш, может вести к значительным различиям в таксономической структуре сообществ даже при сходных почвенных условиях. Стоит учитывать, что в одном и том же регионе и на одном и том же типе почвы химические условия могут отличаться по случайным причинам или из-за использования различных методов ведения сельского хозяйства. Эти факторы, в частности, связанные с погрешностью результатов ПЦР, делают особенно полезным сравнение данных различных исследований и обобщение полученной информации. Они делают необходимым сохранение постоянства методики и постоянных зон отбора проб в экспериментальных исследованиях с использованием молекулярного профилирования микробных сообществ, если конечной целью является изучение экологических свойств видов или групп микроорганизмов.

Агрохимический анализ пахотных и непахотных черноземов. Основные химические показатели изученных пахотных и непахотных почв оказались близкими (рис. 2). Средние значения pH практически совпадают несмотря на то, что для пахотных почв характерна тенденция к закислению [37]. Это находит объяснение в эффективности мер по известкованию почвы, широко применяемых в регионе. Слабокислые и нейтральные значения pH типичны для черноземов [5], с тенденцией к большей кислотности в менее аридных частях их ареала. Диапазон разброса pH составил 5.8–7.3 для пахотных почв и 5.9–7.2 для непахотных.

 

Рис. 2. Химические характеристики пахотных (П.) и непахотных (Н.п.) черноземов с их стандартными отклонениями: рН KCl, массовая доля органических веществ (C_орг, %), массовые концентрации обменного калия в пересчете на K₂O, обменного фосфора в пересчете на P₂O_5, NO₃^– и NH₄⁺ в пересчете на азот

 

Доля органических соединений в пахотных почвах оказалась в среднем немного ниже, чем в непахотных. В целом этот показатель высок, что характерно для черноземов [19]. Разброс значений составил 3.9–6.6% для пахотных, и 5.6–8.6% для непахотных участков. Обилие органического вещества должно способствовать развитию микробного сообщества, обеспечивая его разнообразие [35]. В настоящем исследовании ни содержание органического вещества, ни рН, ни другие химические параметры не оказывали статистически значимого влияния на бактериальное сообщество в целом (табл. 4).

 

Таблица 4. Перестановочный (пермутационный) многомерный анализ влияния факторов на структуру почвенных бактериальных сообществ. Единственный фактор, оказывающий статистически значимое влияние, выделен жирным шрифтом, и подразумевает пахотное земледелие либо его отсутствие

Фактор	Df	Σ квадратов	R2	F	Pr (> F)
Подтип чернозема	2	0.04754	0.10129	1.5543	0.170
Землепользование	1	0.13671	0.29128	8.9397	0.001
Влажность	1	0.01809	0.03855	1.1832	0.302
pH	1	0.01974	0.04206	1.2908	0.258
Органическое вещество (C орг)	1	0.02346	0.04999	1.5341	0.177
Калий	1	0.01235	0.02632	0.8078	0.524
Фосфор	1	0.01170	0.02493	0.7651	0.566
Нитрат	1	0.02831	0.06032	1.8513	0.132
Аммоний	1	0.01470	0.03132	0.9612	0.410

 

Изученная выборка характеризуется широким разбросом концентраций подвижного калия. В пахотных почвах его содержание в среднем ниже и находится в диапазоне 122–516 мг/кг, в непахотных оно лежит в пределах 117–630 мг/кг. Широкий диапазон характерен и для концентраций подвижного фосфора, он составил 60–289 мг/кг при сельскохозяйственной обработке и 44–237 мг/кг без нее. При используемой агротехнике баланс фосфора поддерживается ближе к естественному уровню, чем баланс калия.

Пахотные почвы характеризуются повышенным средним содержанием нитратного азота, и это единственное статистически достоверное различие по химическим параметрам между пахотными и непахотными черноземами в полученной выборке. В то же время показатель варьирует в широких пределах, 8–46 мг/кг. В непахотных почвах разброс его разброс также значителен, 2–7 мг/кг. Среднее содержание аммонийного азота при этом остается близким для образцов пахотных и непахотных почв, оно составляет 10–20 мг/кг в первом случае, и 9–21 мг/кг во втором.

Несмотря на то, что химические особенности пахотных почв в конкретной местности обусловлены применяемой агротехникой, диапазоны, в которых лежат изученные параметры, имеют большое значение в настоящем исследовании, обеспечивая разнообразие выборки для анализа корреляционных взаимодействий между химическими параметрами и встречаемостью представителей тех или иных бактериальных семейств (табл. 5).

 

Таблица 5. Коэффициенты корреляции между долями доминирующих семейств в почвенном сообществе и химическими параметрами почвы. Отображены только значения с уровнем значимости ниже 0.05

Семейство	Влажность	pH	Cорг	P	NO3–
Gemmatimonadaceae	0.47		–0.57		0.82
Chitinophagaceae
Sphingomonadaceae					0.82
Xanthobacteraceae			0.46		–0.78
Chthoniobacteraceae				–0.47
Rubrobacteriaceae
Burkholderiaceae
Microscillaceae		0.58
Nocardioidaceae
Micromonosporaceae
Solirubrobacteraceae			0.67
Pedosphaeraceae
Pyrinomonadaceae
SC-I-84 (Burkholderiales)	0.47	–0.46			0.44
Ilumatobacteraceae					–0.47
Nitrosomonadaceae			–0.56
Xanthomonadaceae	0.47				0.76
Blastocatellaceae	0.46				0.72
Haliangiaceae
Caulobacteraceae					0.48

 

Экологические признаки отдельных семейств, доминирующих в микробиоте чернозема. Конец июня и конец августа представляют собой две различные фазы вегетационного периода, отличающиеся по состоянию растительного покрова как пахотных, так и непахотных почв. На непахотных участках к концу июня в рассматриваемом регионе заканчивается сезон сенокоса, воспроизводство биомассы травянистых растений замедляется. Замедление вегетации в период с конца июня до конца августа сопряжено со снижением физиологической активности корней. Таким образом, средовые условия в подповерхностном слое почвы существенно меняются, что может вести к изменениям в составе почвенной микрофлоры.

На посевных площадях, занятых под озимую пшеницу, в это время происходят еще более выраженные изменения. К концу июня колосья уже сформированы, и начинается усыхание побега. С этого времени вегетация на таких полях практически отсутствует, отмершие корни, а затем и запаханная солома начинают подвергаться разложению. Для бактерий исчезают экологические ниши, связанные с корневой экссудацией, и расширяются ниши, связанные с переработкой растительных остатков.

В исследовании [6], посвященном изменениям состава микробных сообществ в ходе вегетационного периода, типичный чернозем существенно различался по содержанию типов бактерий в мае, июле и сентябре. К сожалению, эти различия не были прослежены на других таксономических уровнях. При этом существование сезонных перестроек состава микробиоты показано в ней для данного типа почв.

Рассматривая различия в размере долей тех или иных доминирующих бактериальных семейств между пахотными и непахотными черноземами в июне и августе (табл. 2), можно отметить шесть семейств, достоверно меняющих доли в зависимости от стадии вегетационного цикла (данные отмечены подчеркиванием). В двух случаях, Solirubrobacteraceae и Pedosphaeraceae, изменения оказываются однонаправленными для пахотных и непахотных почв. Различия между пахотными и непахотными почвами в разные месяцы достоверно совпадают только для Gemmatimonadaceae и Solirubrobacteraceae. Таким образом, семейство Solirubrobacteraceae достоверно предпочитает июнь и нераспаханные почвы.

Перестановочный (пермутационный) многомерный дисперсионный анализ из всех рассмотренных факторов показал достоверное влияние на структуру бактериального сообщества чернозема только фактора землепользования. Сельскохозяйственное использование почв связано с конкретными факторами, способными влиять на их микрофлору, в первую очередь это разрушение естественной структуры почвы и ее переуплотнение, ведущее к снижению аэрации и нарушению дренирования с более продолжительным сохранением влаги в подповерхностном слое. Как показано выше, собранная выборка пахотных черноземов по сравнению с непахотными характеризовалась повышенным средним содержанием нитратов. Однако эти факторы по отдельности не продемонстрировали достоверного влияния на таксономическую структуру сообщества, что можно связать с различной восприимчивостью к их действию разных компонентов сообщества. Землепользование, в свою очередь, представляет собой комплекс факторов, суммарно оказывающих влияние на значительную часть сообщества и, таким образом, ведущих к его существенной перестройке. Нельзя исключать влияние причин, возникающих в ходе сельскохозяйственного использования почвы, которые не были рассмотрены.

Корреляционный анализ позволил выявить зависимость доли тех или иных семейств в сообществе от химических характеристик почвы. Фактором, в наибольшей мере влияющим на состав сообщества, является концентрация нитратов, для шести из доминирующих семейств это влияние оказалось положительным, а еще для двух – отрицательным. Может возникнуть вопрос, не является ли эта корреляция следствием того, что высокие концентрации нитратов сопровождают сельскохозяйственное использование? Однако, широкий разброс концентраций в рассмотренной выборке пахотных почв свидетельствует в пользу достоверности полученного результата.

Четыре семейства зависят от содержания органических веществ, два в положительную сторону, два в отрицательную. Возможно, отрицательные корреляции здесь связаны с благоприятствованием высокого содержания органических веществ численности определенных конкурентов или антагонистов, влияющих на значительную часть их представителей. Также четыре семейства зависят от влажности. В рассмотренном диапазоне между 17.5 и 33.4% влажности, все они предпочитают более высокие значения показателя. Значение pH оказывает влияние на три семейства, два из которых предпочитают более щелочные, а одно более кислые значения. Доля представителей семейства Chthoniobacteraceae характеризуется отрицательной зависимостью от концентрации подвижного фосфора. Обращает на себя внимание отсутствие корреляции концентраций калия и аммония с долями в сообществе каких-либо из распространенных семейств. Любопытно, что обилие представителей аммонийокисляющего семейства Nitrosomonadaceae не коррелирует с концентрациями ни аммония, ни нитрата. Это может быть связано с достаточно узким диапазоном варьирования концентраций аммония в выборке.

Пять семейств не продемонстрировали корреляционной зависимости ни от одного из рассмотренных химических параметров почвы. Более того, Rubrobacteriaceae и Haliangiaceae не показали зависимости ни от землепользования, ни от фазы вегетационного периода. Такое постоянство может характеризовать группы организмов, занимающих экологические ниши, связанные с наиболее медленными биохимическими процессами в почве, которые в наименьшей степени подвержены сезонным изменениям. В то же время диапазоны химических факторов в естественных и обрабатываемых почвах могут быть слишком узкими, чтобы можно было анализировать их влияние на организмы, обладающие широкой нормой реакции. Отдельным вопросом остается накопление в почвах мертвой ДНК различных бактериальных таксонов.

Если рассматривать каждое из наиболее распространенных семейств по отдельности, доля Gemmatimonadaceae положительно коррелирует с концентрацией нитрат-ионов, и отрицательно коррелирует с содержанием органических веществ. Как в июньских, так и августовских пробах средняя доля его представителей приблизительно вдвое выше в пахотных почвах, чем в непахотных, эта разница статистически достоверна. Доля Gemmatimonadaceae коррелирует с влажностью. Из представителей наиболее распространен род Gemmatimonas, также присутствует род Gemmatirosa. Представители Gemmatimonadaceae представляют собой подвижные палочковидные неспорообразующие облигатно аэробные бактерии, поддающиеся культивированию в среде, содержащей низкие концентрации глюкозы, пептона и других органических веществ [45].

С концентрацией нитрат-ионов коррелирует встречаемость семейства Sphingomonadaceae. В июне она практически одинакова в пахотных и непахотных почвах, в августе их доля в сообществе ниже. Семейство представлено в черноземах не менее чем 14 родами, среди которых доминируют Ferruginibacter, Flavisolibacter и Terrimonas. Их общими признаками являются аэробность и хемоорганотрофия. Род Sphingomonas способен вырабатывать экзополисахариды, называемые сфинганами, некоторые входящие в него виды способны к разложению полиароматических соединений [22]. Род Blastomonas, обладающий бактериохлорофиллом a [17], представлен в малых количествах.

Напротив, доля семейства Xanthobacteraceae характеризуется отрицательной корреляцией с содержанием нитратов. Статистически достоверные различия между пахотными и непахотными почвами формируются к августу. В пробах присутствуют 7 родов, среди которых преобладает Bradyrhizobium, также значительные доли в сообществе могут составлять Rhodoplanes (0.04–0.86%) и Pseudolabrys (0.04–0.82%). Для семейства характерен аэробный хемогетеротрофный тип питания, хотя встречается факультативная хемолитоавтотрофия с использованием водорода или восстановленной серы. Распространена способность к фиксации атмосферного азота [26], которой, в частности, обладает род Bradyrhizobium.

Расчеты показывают отрицательную связь встречаемости семейства Chthoniobacteraceae с концентрациями подвижного фосфата. В августе наблюдается статистически большая доля его представителей в непахотных почвах. В пробах обнаружены три рода: Chthoniobacter, Candidatus Udaeobacter и LD29. Последний, не вошедший в табл. 3, составляет всего до 0.03% сообщества. К семейству относятся неподвижные неспорообразующие аэробные бактерии, типовой вид способен использовать для роста углеводные компоненты растительной биомассы, а также пировиноградную кислоту. Часть видов выступает эндосимбионтами нематод и переходит к анаэробиозу [31].

Доля Chitinophagaceae в пахотных и непахотных почвах практически одинакова в июне, но к августу становится достоверно большей в пахотных условиях. К этому семейству относятся 17 бактериальных родов, представленных в пробах, наибольшие доли приходятся на роды Ferruginibacter, Flavisolibacter и Terrimonas. Представители семейства аэробы или факультативные анаэробы, виды рода Chitinophaga способны к гидролизу целлюлозы и хитина. Некоторые представители способны к передвижению скольжением, а также к формированию микроцист [30].

Rubrobacteraceae можно привести в качестве примера семейства, которое не проявляет зависимости ни от одного из факторов, рассмотренных в исследовании. Его единственный род Rubrobacter неподвижен и не образует спор, способен использовать большое количество моносахаридов без кислотообразования. R. radiotolerans в анаэробных условиях восстанавливает нитраты до нитритов [38]. Он способен выдерживать высыхание и воздействие ионизирующего излучения [15]. В частности, Rubrobacter обнаружен в образцах с поверхности известняковой кладки исторических сооружений [12]. Нельзя исключать, что сохранение покоящихся и инактивированных клеток может вести к накоплению неактивной ДНК этого семейства Rubrobacteraceae в почвах. Однако полученные данные демонстрируют уменьшение доли ДНК этого семейства в образцах более чем на 30% в течение двух месяцев. Таким образом, возможное присутствие мертвой ДНК в почвах в данном случае не препятствует детекции изменения доли семейства в сообществе на выбранном временном промежутке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Составление перечня основных компонентов бактериальной микробиоты черноземов на уровне семейств и родов позволило выделить характерные группы бактерий, высокие доли которых свидетельствуют об их вовлеченности в выполнение существенных экологических функций, обеспечиваемых микроорганизмами в почвах. Основные выводы, сделанные на основе полученных результатов:

1) Таксономическая структура бактериального сообщества черноземов лесостепной зоны достаточно стабильна, несмотря на различия в зависимости от землепользования и стадии вегетационного периода.

2) Выраженное доминирование отдельных родов в рассмотренных семействах делает целесообразным рассмотрение таксономической структуры сообщества в дальнейших исследованиях на уровне родов, что облегчит сопоставление данных микробного профилирования с данными классической микробиологии.

3) Из химических факторов на доли многих доминирующих семейств влияет концентрация нитратов, в то время как концентрации калия и аммония в наблюдаемых диапазонах выраженно не влияют на них. Важным представляется вывод, что в реальных диапазонах химических факторов может не прослеживаться влияние на таксоны, на которые они теоретически должны были бы заметно воздействовать, как в случае концентраций аммония и доли семейства Nitrosomonadaceae. Этот результат подчеркивает сложность перехода от культуральных характеристик к экологическим, и актуальность сбора данных по экологии микроорганизмов в естественных условиях, или в экспериментальных условиях, приближенных к естественным.

Важен поиск экспериментальных подходов для экологического тестирования сложных микробных сообществ с изучением влияния выбранных факторов на их структуру. Такой метод должен позволить конкретным видам или группам в составе сообщества проявлять именно те адаптационные способности, которые актуальны в естественных условиях, его ценность должна быть основана на экологической релевантности. Полученные результаты создают необходимый задел, очерчивая границы изменчивости сообщества в естественных условиях и перечень важнейших таксонов, благополучие которых может стать критерием адекватности экспериментальных моделей.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы благодарят за поддержку ООО “Русагро Инвест” и ФГБУ “Государственный заповедник “Белогорье”, Белгородская область, Россия.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда, № 22‐14‐20024, и правительства Белгородской области, Россия.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

K. S. Boyarshin

Belgorod State University

Author for correspondence.
Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

V. V. Adamova

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

W. Zheng

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

E. V. Nikitinskaya

Cherepovets State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Cherepovets

O. Yu. Obukhova

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

M. V. Kolkova

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

V. A. Nesterenko

Dokuchaev Soil Science Institute

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Moscow

O. S. Bespalova

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

V. V. Klyueva

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

K. A. Degtyareva

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

L. V. Nesteruk

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

Yu. N. Kurkina

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

O. A. Makanina

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

E. S. Ivanova

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

Zh. Li

Dezhou University

Email: kboyarshin@mail.ru
China, Dezhou

I. V. Batlutskaya

Belgorod State University

Email: kboyarshin@mail.ru
Russian Federation, Belgorod

References

Supplementary files