Preparation of tritium labeled dexamethasone phosphate and its application to assess the affinity of ligands to glucocorticoid receptors

Texto integral

Меченные тритием биологически активные соединения широко используются в изучении биохимических процессов [1]. В последние годы разработано большое число методов введения трития в органические молекулы, включая как химический синтез, так и реакции изотопного обмена [2, 3]. Особое место среди этих методов занимает метод термической активации трития, который позволяет в одну стадию ввести радиоактивную метку в самые сложные соединения [4]. Так как вещество во время реакции специально охлаждается до низкой температуры, метод удобен для введения трития в макромолекулы, которые могут подвергаться структурным изменениям и деградировать при нагревании. Однако метод применим и для низкомолекулярных соединений, особенно если не требуется получения веществ с предельно высокой удельной активностью. Вместе с тем достижение высокой удельной активности с сохранением приемлемого выхода меченого соединения для веществ с невысокой молекулярной массой является важной задачей в расширении возможностей метода, например, для применения меченых соединений в радиолигандном анализе.

К таким веществам относятся глюкокортикоиды (ГК) – стероидные гормоны, более 50 лет назад введенные в клиническую практику для терапии воспалительных, аутоиммунных, онкологических заболеваний. За это время было синтезировано, охарактеризовано и успешно применяется в терапии более 30 аналогов природных ГК стероидной структуры. Однако также ГК характеризует большое количество побочных эффектов, развивающееся у пациентов при длительном применении [5, 6]. Альтернативой ГК являются селективные глюкокортикоид-рецепторные агонисты (СГРА), зачастую нестероидной структуры. Общим в механизме действия СГРА и классических ГК является связывание с мишенью – глюкокортикоидным рецептором (ГР), хорошо известным транскрипционным фактором, реализующим эффекты ГК и их аналогов. Связывание лиганда c ГР приводит к активации рецептора в цитоплазме и запуску двух параллельных механизмов: 1) связыванию мономерного комплекса лиганд–рецептор с другими факторами транскрипции, приводящее к подавлению их активности (процесс трансрепрессии, играющий важную роль в реализации терапевтического действия ГК); 2) формированию гомодимера и связыванию димера с палиндромными последовательностями в промоторах и энхансерах провоспалительных, антиапоптотических и пропролиферативных генов (процесс трансактивации, опосредующий большую часть побочных эффектов ГК) [7]. Отличие СГРА от классических ГК заключается в отсутствии формирования димера ГР при связывании с СГРА и, как следствие, отсутствие запуска трансактивации [8, 9].

Ниша лекарственных препаратов на основе СГРА достаточно широка, исследования ведут уже более 10 лет в области как соединений природного происхождения, так и их синтетических аналогов [10, 11]. В частности, хлорид 2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-N-метилэтиламмония (Compound A или CpdA) – стабильный аналог гидроксифенилазиридина, выделенный из намибийского кустарника семейства померанцевых [7], используется в исследовательских целях для изучения роли трансрепрессии в реализации биологических эффектов ГК. Для данного соединения была описана аффинность к ГР, селективность в запуске трансрепрессии, а также широкий спектр терапевтически значимых биологических свойств [7]. Современные методические подходы к дизайну структур in silico и химическому синтезу позволяют получать большое количество новых молекул одновременно. Однако для доказательства механизма действия соединений необходим быстрый и дешевый метод оценки аффинности к ГР, позволяющий протестировать большое количество соединений, используя стандартизованные условия.

Активность лигандов ГР может быть оценена целым спектром косвенных методов: репортерный анализ с использованием генетически модифицированных клеточных линий [12–14], ПЦР-анализ ГР-зависимых генов [12, 14], конфокальная микроскопия [15, 16], оценка связывания по изменению поляризации флуоресценции в присутствии конкурентного лиганда [17–19]. Стоит отметить, что метод оценки по изменению поляризации как по литературным [20], так и по нашим собственным данным оказался нечувствителен к определению аффинности малых молекул. Прямые методы оценки аффинности включают в себя: поверхностный плазмонный резонанс (однако его использование не описано при оценке аффинности лигандов к ГР [21]), кристаллографию и аналитическое ультрацентрифугирование [22, 23], радиолигандный метод [24]. Данные подходы отличаются более высокой точностью, однако кристаллография, поверхностный плазмонный резонанс являются дорогостоящими и требуют наличия сложной приборной базы, в то время как радиолигандный метод является классическим методом оценки аффинности лигандов к мишеням. Более того, необходимо отметить, что данный метод является стандартным методом, использующимся в доклинических исследованиях как специфической фармакологической активности in vitro, так и для оценки нецелевых (off-target) эффектов при изучении вторичной фармакодинамики [24].

Целью настоящего исследования являлось получение меченных тритием глюкокортикоидов дексаметазона и дексаметазона фосфата и сравнительный анализ аффинности немеченых лигандов глюкокортикоидного рецептора дексаметазона фосфата и Cpda с помощью полученных препаратов. На результат сравнительной оценки аффинности могут влиять: тип модели (клеточная или бесклеточная), концентрация ГР, концентрация радиоактивного лиганда, время инкубации, условия измерения. В задачи работы входило введение трития в ГК, а также подбор условий применения полученных соединений (времени инкубации и концентрации лиганда) для экспериментальной оценки аффинности лигандов к ГР в клеточной системе. Выбор рабочих концентраций лигандов соответствовал области малотоксичных значений и основывался на предварительном определении цитотоксичности соединений для модельной клеточной линии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали селективные агонисты глюкокортикоидного рецептора: дексаметазон (Macklin, Китай), дексаметазон фосфат динатриевая соль (Macklin, Китай), CpdA (Calbiochem, США). Структурные формулы соединений приведены на схеме 1.

 

Схема 1. Лиганды глюкокортикоидного рецептора, использованные в работе: а – дексаметазон, б – дексаметазон фосфат, в – Compound A (CpdA).

 

На всех этапах работы радиоактивность меченых соединений измеряли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1215 (LKB, Финляндия), внося аликвоты растворов в сцинтилляционную жидкость Ultima Gold (PerkinElmer). При проведении радиолигандного анализа использовали также сцинтилляционную жидкость Hionic Fluor (PerkinElmer).

Для определения концентрации меченых соединений измеряли спектры поглощения на спектрофотометре Hitachi U-5100. Предварительно получали калибровочные зависимости оптического поглощения при 240 нм от концентрации дексаметазона в метаноле и дексаметазона фосфата в воде, которые были линейными в диапазоне от 2 до 20 мг/л.

Получение меченных тритием препаратов

Для введения трития в дексаметазон и дексаметазон фосфат применили метод термической активации [4].

Для подготовки вещества к реакции с атомарным тритием получали тонкую пленку на стенках реакционного сосуда двумя способами:

1. равномерно распределяли раствор вещества (дексаметазон и дексаметазон фосфат) в метаноле на стенках реакционного сосуда с шероховатыми стенками и удаляли растворитель, используя слабый поток газа;
2. равномерно распределяли раствор вещества (только дексаметазон фосфат) в воде по стенкам реакционного сосуда с гладкими стенками, быстро замораживали сосуд жидким азотом и удаляли растворитель лиофилизацией.

Реакционный сосуд с нанесенной мишенью вещества присоединяли к установке для работы с газообразным тритием и удаляли воздух до остаточного давления 0.01 Па. Затем сосуд охлаждали жидким азотом до 77 К, заполняли газообразным тритием до давления 0.5 Па и активировали реакцию изотопного обмена нагреванием вольфрамовой проволоки электрическим током в течение 10 с. Температуру вольфрамовой проволоки варьировали от 1750 до 1980 К. После проведения реакции удаляли остаточный газ, сосуд размораживали под вакуумом и отсоединяли его от вакуумной установки. Меченое вещество смывали этанолом (дексаметазон) или водой (дексаметазон фосфат).

Раствор после выдержки (1 сут) упаривали досуха на роторном испарителе и снова растворяли в этаноле (дексаметазон) или воде (дексаметазон фосфат). Операцию повторяли 2 раза, что гарантировало удаление трития из лабильных положений меченых молекул.

Для анализа и чистки меченых препаратов от радиоактивных примесей использовали тонкослойную хроматографию и ВЭЖХ.

Для тонкослойной хроматографии использовали пластинки TLC Plates, Silica Gel on Aluminium, 20 X (Aldrich). Проводили анализ в следующих системах (соотношение компонентов по объему): А – бутанол–уксусная кислота–вода (3 : 1 : 1), R_f 0.73 (дексаметазон фосфат); Б – этанол–толуол–этилацетат (1:7:10), R_f 0.52 (дексаметазон), R_f 0.0 (дексаметазон фосфат); В – этанол–25%-ный водный аммиак (3:1), R_f 0.38 (дексаметазон фосфат), R_f 0.78 (дексаметазон).

Положение веществ на пластинке определяли с помощью УФ лампы (254 нм).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили с помощью оборудования Waters (Breeze): хроматографическая колонка Waters Nova-Pak C18 (150 × 3.9 мм), подвижная фаза 0.1% трифторуксусная кислота (А)–ацетонитрил (Б). Скорость потока 0.5 мл/мин, детектирование при 242 и 254 нм. Использовали следующие режимы проведения анализа: дексаметазон – линейный градиент от 30 до 80 % фазы Б за 25 мин, время выхода дексаметазона 14.8 мин, дексаметазона фосфата 8.5 мин; дексаметазон фосфат: изократический режим, соотношение фаз 74% (А)–26% (Б), время выхода дексаметазона фосфата 12.5 мин, дексаметазона 36.2 мин.

Только одна стадия очистки (ТСХ или ВЭЖХ) позволяла получать меченые препараты с радиохимической чистотой 92–95%. Для проведения экспериментов с клетками проводили очистку меченых препаратов в два этапа: сначала с помощью препаративной тонкослойной хроматографии, а затем с помощью ВЭЖХ. При двойной очистке радиохимическая чистота препаратов была более 99%.

Клеточные культуры

Клеточная линия хронического миелолейкоза К562 была получена из Биоресурсной коллекции клеточных линий НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Клетки культивировали в стандартной среде RPMI-1640 с добавлением 2 mM L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия) и 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) при 37°С в атмосфере 5%-ного СО₂.

Определение оптимальных условий регистрации

Клетки переносили в культуральную среду без сыворотки (2.5 млн клеток в 1 мл) для предотвращения неспецифической сорбции лигандов на белках сыворотки крови.

Для определения оптимального времени инкубации с исследуемыми препаратами клеткам вносили избыток [³H]дексаметазона (40 мкмоль/л) за 10, 30, 60, 90 и 120 мин до окончания эксперимента. Клетки инкубировали при 37°С. Затем клетки дважды отмывали центрифугированием в охлажденной культуральной среде без сыворотки (1500 об/мин, 5 мин). Клетки лизировали буфером RIPA (50 ммоль/л Трис (pH 8.0), 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л этилендиаминтетрауксусная кислота, 0.1% додецилсульфат натрия, 0.5% дезоксихолат натрия, 1% тритон-Х100, 10% глицерин, ингибитор протеиназ) 20 мин. Затем клеточный лизат переносили в сцинтилляционную жидкость и измеряли радиоактивность на ЖС-спектрометре RackBeta 1215 в течение 4 мин.

Для оценки оптимального количество тритиевой метки, при которой детектируется наиболее эффективное вытеснение метки исследуемыми лигандами, клетки инкубировали 90 мин при 37°С с [³H]дексаметазоном в различной концентрации (0.5, 1 и 2 мкмоль/л) с добавлением немеченого дексаметазона фосфата в концентрациях 10 и 50 мкмоль/л. В качестве контроля для каждого эксперимента использовали клетки, инкубированные только с [³H]дексаметазоном в концентрации 0.5, 1 и 2 мкмоль/л. Отмывку, лизис клеток и детекцию уровня радиоактивности проводили аналогично описанной выше методике.

Вытеснение меченого дексаметазона фосфата лигандами ГР

Клетки переносили в культуральную среду без сыворотки (2.5 млн клеток в мл) для предотвращения неспецифической сорбции лигандов на белках сыворотки крови. В культуральную среду вносили 200 мкл раствора [³H]дексаметазона (до концентрации 0.5 мкмоль/л) и 500 мкл немеченого дексаметазона фосфата или CpdA (концентрации 0.1–10 мкмоль/л в пробе). Клетки инкубировали 90 мин при 37°С. Отмывку, лизис клеток и детекцию уровня радиоактивности проводили аналогично описанной выше методике.

Результаты экспериментов представляли в виде процентов связывания меченого препарата с рецептором, принимая максимальный уровень сигнала (в точках без добавления конкурентного лиганда) за 100% (более низкий процент отражает наиболее сильное вытеснение метки исследуемым лигандом).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для проведения исследований радиолигандным методом требуются меченые соединения с высокой удельной активностью. При использовании метода термической активации трития для получения меченых соединений необходимо учитывать, что реакция протекает в тонком поверхностном слое вещества, нанесенного на твердую подложку. В мягких условиях проведения реакции (сниженная температура атомизатора, малые временные экспозиции нагревания атомизатора) не происходит существенной деградации исходного и меченого вещества, что облегчает дальнейшую очистку и использование, однако степень замещения водорода на тритий будет при этом не предельно высокая. Важным фактором, влияющим на удельную активность меченого препарата, является доступная поверхность мишени. Для ее увеличения используют реакционные сосуды с шероховатыми внутренними стенками. Эти обстоятельства учитывали при разработке методики введения трития в дексаметазон и дексаметазона фосфат.

На первом этапе рассмотрели возможность получения [³H]дексаметазона, который мало растворим в воде, и для получения мишени удобнее использовать раствор в метаноле, который наносили на шероховатые стенки реакционного сосуда. Изучение влияния температуры атомизатора на радиоактивность меченого соединения при массе мишени 0.22 мг показало, что с ростом температуры от 1820 до 1980 К происходило увеличение общей радиоактивности мишени от 5.8 до 8.4 мКи. Однако за счет возрастания вклада побочных реакций снижался выход [³H]дексаметазона, а его удельная радиоактивность уменьшалась от 1.5 до 0.7 Ки/ммоль.

Далее изучили, как влияет на удельную радиоактивность [³H]дексаметазона масса вещества, взятого для приготовления мишени. Как и ожидалось, уменьшение массы препарата, наносимого на стенки реакционного сосуда, увеличивало удельную радиоактивность меченого соединения (рис. 1). Однако рост удельной радиоактивности с уменьшением массы мишени был меньше, чем можно было ожидать для случая равномерного покрытия стенок сосуда веществом. Вероятно, это связано с тем, что при испарении метанольного раствора дексаметазон не образует равномерную пленку на стенках. Молекулы дексаметазона предпочтительно образуют агрегаты, которые заполняют «ложбины» стенок шероховатого стекла, и в результате снижается доступность дексаметазона атомам трития. Аналогичный эффект наблюдали ранее при получении меченого тритием ванкомицина [25]. К тому же в экспериментах in vitro было показано, что у [³H]дексаметазона наблюдалась повышенная склонность к неспецифическому связыванию с клетками, а также наблюдалась адсорбция на стенках пробирок. Поэтому на следующем этапе работы использовали дексаметазон фосфат, хотя ранее на примере пантотеновой и фосфопантотеновой кислот было показано, что введение в состав молекулы фосфатной группы затрудняет изотопный обмен по связям C–H [26].

 

Рис. 1. Зависимость удельной радиоактивности [³H]дексаметазона от массы препарата, наносимого на стенки реакционного сосуда из метанольного раствора.

 

Дексаметазон фосфат хорошо растворим в воде, и мишень для введения трития готовили лиофилизацией водного раствора, нанесенного на гладкие стенки реакционного сосуда. Хотя в этом случае уже визуально наблюдалось неравномерное покрытие стенок веществом, однако доступность молекул дексаметазона фосфата атомам трития была выше, а вещество лучше смывалось со стенок после проведения реакции. Для мишени массой 40 мкг зависимость удельной радиоактивности [³H]дексаметазона фосфата от температуры атомизатора показана на рис. 2. При изменении температуры от 1900 до 1750 К удельная радиоактивность очищенного препарата увеличивалась от 7.7 до 11.6 Ки/ммоль. Такая удельная радиоактивность оказалась приемлемой для проведения экспериментов с клетками.

 

Рис. 2. Зависимость удельной радиоактивности [³H]дексаметазона фосфата от температуры атомизатора при нанесении вещества на гладкие стенки лиофилизацией водного раствора (1) и испарением метанольного раствора, нанесенного на шероховатые стенки реакционного сосуда (2).

 

Проведение предварительной валидации методики для выбора оптимальных условий проведения экспериментов является необходимым условием апробации метода. С учетом литературных данных о применении радиолигандного метода для определения аффинности соединений различной химической природы к ГР [27, 28] метод был оптимизирован в нескольких сериях экспериментов.

При проведении экспериментов по возможности использования полученного меченого препарата дексаметазона фосфата на первом этапе определили оптимальное время инкубации, обеспечивающее значимое увеличение уровня сигнала, а также концентрацию меченого соединения, позволяющую надежно выявить влияние немеченых лигандов на конкурентное связывание с рецептором.

С увеличением времени инкубации связывание возрастало, в интервале 60–90 мин наблюдался максимальный уровень, а затем происходило снижение примерно на 20% (рис. 3). На основании полученных данных выбрали 90 мин в качестве оптимального времени инкубации.

 

Рис. 3. Зависимость уровня сигнала (в % от максимального) от времени инкубации с [³H]дексаметазоном.

 

Для определения оптимальной концентрации меченого препарата провели инкубацию клеток с [³H]дексаметазоном в диапазоне концентраций 0.5–2.0 мкмоль/л без добавок и в присутствии 10 и 50 мкмоль/л немеченого дексаметазона фосфата. Было показано, что дексаметазон фосфат проявляет конкуренцию по отношению к меченому лиганду при всех исследуемых концентрациях (рис. 4). Также показано, что эффект вытеснения метки лигандом повышается с увеличением концентрации лиганда и снижением количества с [³H]дексаметазона. При этом наиболее сильный эффект ингибирования наблюдался при добавлении 0.5 мкмоль/л меченого дексаметазона (уровень сигнала падает до 3% при концентрации немеченого дексаметазона 10 и 50 мкмоль/л). При замене [³H]дексаметазона на [³H]дексаметазон фосфат наблюдалась аналогичная зависимость. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали [³H]дексаметазон фосфат при концентрации 0.5 мкмоль/л.

 

Рис. 4. Изменение доли связанного с ГР [3H]дексаметазона при его концентрации 0.5, 1 и 2 мкмоль/л и различном количестве немеченого дексаметазона фосфата. Время инкубации 90 мин.

 

Таким образом, было показано, что при концентрации 0.5 мкМ [³H]дексаметазона в пробе полное ингибирование наблюдается на менее токсичных для выбранной клеточной модели концентрациях. Дальнейшую оценку динамики конкурентного ингибирования связывания [³H]дексаметазона с рецептором исследовали в диапазоне концентраций от 0 до 10 мкМ.

Для сравнительного анализа вытеснения [³H]дексаметазона фосфата двумя лигандами ГР – немеченым дексаметазоном фосфатом и нестероидным СГРА CpdA – клетки инкубировали с [³H]дексаметазоном фосфатом в присутствии широкого диапазона концентраций дексаметазона фосфата или CpdA. Результаты анализа конкурентного ингибирования связывания [³H]дексаметазона с ГР исследуемыми лигандами представлены на рис. 5. Оба лиганда (дексаметазон и CpdA) в концентрациях 1, 3 и 10 мкмоль/л ингибируют связывание [³H]дексаметазона с ГР в клеточной системе. Конкуренция обоих лигандов за сайты связывания в ГР носит дозозависимый характер. Сравнение конкурентных свойств дексаметазона фосфата и CpdA показало, что при всех исследованных концентрациях (1, 3 и 10 мкмоль/л) дексаметазон ингибирует связывание [³H]дексаметазона сильнее, чем CpdA.

 

Рис. 5. Зависимость доли ГР-связанного [³H]дексаметазона фосфата (0.5 мкмоль/л) с ГР в присутствии немеченых дексаметазона фосфата или CpdA. Время инкубации 90 мин. Данные представлены в % от уровня сигнала в пробах с [³H]дексаметазоном.

 

Лигандные свойства CpdA в отношении ГР ранее были показаны в работах [27] и [28]. Мы также подтвердили факт связывания CpdA с ГР в клетках лейкозов. Полученные в нашей работе данные согласуются с тем, что CpdA обладает более низкой аффинностью к ГР, так как CpdA в активном центре рецептора образует 3 водородных связи в отличие от дексаметазона, имеющего сродство к 5 аминокислотным остаткам [28].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В методе термической активации трития для получения максимальной радиоактивности меченого соединения критическим параметром при использовании небольших навесок вещества является равномерное покрытие стенок реакционного сосуда. В данной работе показано, что для дексаметазона, мишень которого получают испарением летучего растворителя, межмолекулярные взаимодействия предпочтительны по сравнению с взаимодействиями с материалом стенок сосуда, и при маленьких массах препарата покрытие становилось неравномерным. Увеличение площади стенок с помощью механической обработки абразивами не улучшало результат, так как агрегаты молекул дексаметазона заполняли углубления, что снижало их доступность атомам трития. В результате удельная активность [³H]дексаметазона не превысила 3.5 Ки/ммоль. Использование водорастворимого дексаметазона фосфата с подготовкой мишени лиофилизацией водного раствора в реакционном сосуде с гладкими стенками позволило получить [³H]дексаметазон фосфат с удельной активностью 11.6 Ки/ммоль, несмотря на снижение эффективности изотопного обмена по связям С–Н за счет введения фосфатной группы.

Разработан метод определения относительной аффинности потенциальных лигандов к ГР по ингибированию связывания [³H]дексаметазона фосфата, который близок по точности и воспроизводимости к аналогичным методам, описанным в литературе [27, 28]. Кроме того, эксперименты, проведенные в клеточной системе, подтверждают, что полученный препарат [³H]дексаметазона фосфата пригоден для применения в радиолигандном методе определения аффинности к ГР не только стероидных аналогов природных ГК, но и малых молекул нестероидной структуры. Тритиевая метка в молекуле дексаметазона не изменяет его биологические свойства. Препарат проникает в клетки и связывается с рецептором, а также дозозависимо вытесняется конкурентноспособными лигандами стероидной и нестероидной природы. Необходимо отметить, что полученные данные о разнице в силе конкурентного ингибирования связывания меченого дексаметазона фосфата в присутствии немеченого дексаметазона фосфата и CpdA демонстрируют меньшее сродство CpdA к рецептору, что согласуется с литературными данными и свидетельствуют о том, что разработанная нами клеточная система дает адекватные результаты.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГК – глюкокортикоид

ГР – рецептор глюкокортикоидов

СГРА – селективные глюкокортикоид-рецепторные агонисты

CpdA – Compound A (хлорид (4-ацетоксифенил)-2-хлор-N-метилэтиламмония)

Dex – дексаметазон

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-15-00321).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы утверждают об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

G. Badun

Moscow State University

Autor responsável pela correspondência
Email: badunga@my.msu.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, Moscow, 119991

E. Zhidkova

Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia

Email: badunga@my.msu.ru
Rússia, Moscow, 115478

M. Chernysheva

Moscow State University

Email: badunga@my.msu.ru

Faculty of Chemistry

Rússia, Moscow, 119991

A. Enikeev

Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia

Email: badunga@my.msu.ru
Rússia, Moscow, 115478

M. Yakubovskaya

Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; Friendship University of Russia

Email: badunga@my.msu.ru
Rússia, Moscow, 115478; Moscow, 117198

E. Lesovaya

Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; Friendship University of Russia; Pavlov Ryazan State Medical University, Ministry of Health of Russia

Email: badunga@my.msu.ru
Rússia, Moscow, 115478; Moscow, 117198; Ryazan, 390026

Bibliografia

Arquivos suplementares