Биологически активные вещества и антиоксидантная активность Spiraea humilis (Rosaceae) в условиях in vitro

Полный текст

Во всех типах живых организмов постоянно протекают реакции одноэлектронного восстановления, что приводит к образованию промежуточных продуктов восстановления молекулы кислорода. Все они носят название — активные формы кислорода (АФК). Известно, что окислительный стресс может служить причиной развития хронических заболеваний (диабет, ожирение и дисфункция адипоцитов, сердечно-сосудистые заболевания), нейродегенеративных заболеваний и различных видов рака [1]. Поэтому актуальным является создание лекарственных препаратов, направленных на защиту организма от хронических заболеваний, связанных с активными формами кислорода. Стоит обратить особое внимание на биологически активные вещества, содержащиеся в природных источниках, таких как дикорастущие растения. Они обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью, бактериостатическим, бактерицидным эффектами, способностью повышать устойчивость организма к генотоксикантам [2, 3].

Создание препаратов на основе лекарственных растений невозможно без исследований компонентного состава и фармакологических свойств биологически активных веществ растений. Так, несколькими независимыми группами исследователей продолжаются поиски биологически активных компонентов с выраженным антиоксидантным действием у видов рода спирея (Spiraea L., Rosaceae) и осуществляется изучение их химического компонентного состава. Спирею иволистную (Spiraea salicifolia L.) применяют в российской, монгольской и тибетской народной медицине [4–7]. Кроме того, благодаря достаточным сырьевым ресурсам и широкой распространенности, S. salicifolia привлекла к себе внимание научного сообщества. Так В. М. Мирович с коллегами [8] разработан способ получения сухого экстракта побегов S. salicifolia, проявляющего выраженную противовоспалительную, диуретическую и антиоксидантную активность. Экстракт сухой спиреи иволистной в дозе 100 мг/кг оказывал противовоспалительное действие, о чем свидетельствовали уменьшение степени альтерации тканей и повышение интенсивности процессов регенерации в очаге воспаления. Площадь повреждения тканей на 9 и 29 день уменьшалась на 15 и 20%, соответственно. Экстракт сухой спиреи иволистной оказывал антиэкссудативное действие, снижая отек лап животных на 36.5% по сравнению с его уровнем в контрольной группе [8]. Родственный S. salicifolia вид спирея низкая (S. humilis Pojark.) малоизучена. В большинстве статей с ключевым словом Spiraea данный вид упоминается, но данные о содержании биологически активных веществ (БАВ) в органах растений этого вида приводятся редко.

S. humilis — кустарник высотой от 0.2 м до 0.5 м. Молодые побеги, оси соцветия и гипантий густо опушены ржавовойлочными волосками. Листья эллиптические, реже яйцевидные (длина в 1.5–2 раза больше ширины), сверху нередко белесые от сильно развитого воскового налета, зубчатые только в верхней половине пластинки. Соцветие — компактная яйцевидная или пирамидально-яйцевидная метелка, 2.5–10 см длиной (рис. 1). Встречается в лиственничных и березовых лесах, на лесных опушках, по берегам рек и ручьев: предпочитает избыточно увлажненные местообитания. S. humilis произрастает в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке России [9–12].

 

Рис. 1. Spiraea humilis (Хабаровский край, Комсомольский р-н, окр. пос. Селихино, фото Веклич Т. Н.)

Fig. 1. Spiraea humilis (Khabarovsk kray, Komsomolsky district, environment of Selikhino village, photo by Veklich T. N.)

 

Цель работы — исследование содержания биологически активных веществ и антиоксидантной активности экстрактов надземных вегетативных (листья и стебли) и генеративных (соцветия) органов Spiraea humilis в двух ценопопуляциях на территории Хабаровского края.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом для исследования биологически активных веществ послужили вегетативные и генеративные органы Spiraea humilis. Материал был собран в 2022 г. в Хабаровском крае в двух природных ценопопуляциях (табл. 1) во время цветения. В каждой ценопопуляции с 10–15 типичных экземпляров собирали по одной ветви из средней или верхней части куста. Образцы делили на органы (листья, стебли и соцветия) и сушили в тени в хорошо проветриваемом помещении.

 

Таблица 1. Места сбора образцов Spiraea humilis

Table 1. Locations of Spiraea humilis sample collection

№	Место и дата сбора, растительное сообщество, коллектор Location of the collection point, collection date, plant community, collector
1	Хабаровский край, Комсомольский район, 32 км от г. Комсомольск-на-Амуре в сторону г. Хабаровск по федеральной трассе, в 150 м от обочины дороги, в разреженном лиственнично-березовом лесу. N50°22'56.2'', E 137°14'46.4'', 52 м над ур. м., 21.07.2022 г., Веклич Т.Н. Khabarovsk Territory, Komsomolsky district, 32 km from Komsomolsk-on-Amur towards Khabarovsk along the federal highway, 150 m from the roadside, in a sparse larch-birch forest. N 50°22'56.2'', E 137°14'46.4'', 52 m a.s.l., 21.07.2022, Veklich T. N.
2	Хабаровский край, Комсомольский район, окр. с. Селихино, на опушке березового леса. N 50°22'39.5'', E 137°30'20.1'', 60 м над ур. м., 21.07.2022 г., Вектлич Т. Н. Khabarovsk Territory, Komsomolsky district, environs of Selikhino village, on the edge of a birch forest. N 50°22'39.5'', E 137°30'20.1'', 60 m a.s.l., 21.07.2022, Veklich T. N.

Примечание: в таблице приведены средние значения из двух показателей ± стандартное отклонение; АОА – антиоксидантная активность; IC₅₀, мкг/мл – концентрация экстракта/антиоксиданта, при которой наблюдали 50%-ное ингибирование радикала DPPH.

Note: the table shows the average of two data ± standard deviation; AOA – antioxidant activity; IC₅₀, µg/ml – concentration of extract/antioxidant at which 50% inhibition of the DPPH radical is observed.

 

Приготовление экстракта. Около 0.5 г (точная навеска) сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 2–3 мм, помещали в круглодонную колбу с притертой крышкой, объемом 100 мл. Сырье заливали 30 мл 70%-ного этилового спирта, колбу присоединяли к обратному холодильнику и помещали на водяную баню при 70°C на 30 минут. Колбу время от времени взбалтывали, чтобы смыть частицы сырья со стенок. После этого колбу с извлечением охлаждали и первую порцию экстракта фильтровали в коническую колбу с притертой крышкой объемом на 100 мл через бумажный фильтр. Далее сырье на фильтре помещали в круглодонную колбу и опять заливали 30 мл 70%-го спирта и экстрагировали в течении 30 минут. Вторую порцию экстракта охлаждали и фильтровали к первой порции экстракта в колбу на 100 мл. Процедуру повторяли дважды. Три порции экстракта перемешивали и замеряли объем полученного объединенного экстракта.

Определение общего содержания фенольных соединений с использованием реактива Фолина–Чокальтеу. В мерную колбу на 5 мл помещали 4 мл дистиллированной воды, 0.5 мл экстракта, затем добавляли 2.5 мл реагента Фолина–Чокальтеу и через 1 мин –2.0 мл 20%-ного водного раствора карбоната натрия. Смесь инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Поглощение измеряли при длине волны 760 нм на спектрофотометре СФ-56. В качестве контроля использовали смесь: 0.5 мл дистиллированной воды, 2.5 мл реагента Фолина–Чокальтеу и 2.0 мл 20%-ного водного раствора карбоната натрия. Общее содержание фенольных соединений рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием галловой кислоты (концентрация 0.001–0.006 мг/мл) в качестве стандарта [13].

Определение содержания флавонолов с использованием хлорида алюминия. Количественное определение флавонолов проводили спектрофотометрическим методом, в котором использована реакция комплексообразования флавонолов с хлоридом алюминия. По 0.1 мл экстракта помещали в 2 пробирки емкостью 5 мл, прибавляли в одну пробирку 0.2 мл 2%-ного спиртового раствора хлорида алюминия, в другую — 1–2 капли 30%-й уксусной кислоты и доводили объем раствора 96%-ным этиловым спиртом до метки. Растворы перемешивали и через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора с хлоридом алюминия на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя раствор с уксусной кислотой для сравнения. Количественное содержание флавонолов в пробе определяли по калибровочной кривой, построенной по рутину (≥ 99%, «Chemapol») [14].

Определение содержания катехинов. В две пробирки отбирали аликвоту по 0.8 мл экстракта. В одну из них приливали 4 мл 1%-ного раствора ванилина в концентрированной соляной кислоте и доводили объемы до 5 мл в обеих пробирках концентрированной соляной кислотой. Пробирку без ванилина использовали как контроль. Через 5 мин измеряли интенсивность окрашенных растворов на СФ-56 при длине волны 504 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Количественное содержание катехинов в пробе определяли по калибровочной кривой, построенной по (±) — катехину фирмы «Sigma» [15].

Определение общего содержания фенолкарбоновых кислот с использованием реактива Арнова. К 1 мл экстракта добавляли 5 мл дистиллированной воды, 1 мл соляной килоты (0.1 М), 1 мл реактива Арнова (10 г молибдата натрия, 10 г нитрита натрия в 100 мл воды), 1 мл гидроксида натрия (1М), доводили до 10 мл дистиллированной водой и замеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм на спектрофотометре СФ-56 (вещество сравнения — кофейная кислота) [16].

Исследование состава и содержания индивидуальных компонентов фенольного комплекса в экстрактах из растений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). 1 мл водно-этанольного экстракта разбавляли бидистиллированной водой до 5 мл и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 (ЗАО «БиоХимМак»). Вещества смывали с патрона небольшим количеством (3 мл) 40%-ного этанола, а затем 2 мл 96%-ного этанола. Объединенный элюат пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

Анализ фенольных соединений, содержащихся в элюате, проводили на аналитической ВЭЖХ-системе, состоящей из жидкостного хроматографа «Agilent 1200» (США) с диодно-матричным детектором, автосамплером и системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation, модифицировав методику Т. А. van Beek [17]. Колонка Zorbax SB-C18, 4.6 × 150 мм, 5 мкм. Разделение проводили в следующих условиях: градиент от 31 до 33%-ного метанола, подкисленного в ортофосфорной кислоте (0.1%) в течение 27 мин., далее в подвижной фазе содержание метанола в водном растворе отрофосфорной кислоты (0.1%) изменяли от 33 до 46% за 11 мин., затем от 46 до 56% за следующие 12 мин. и от 56 до 100% за 4 мин. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура колонки 26°C. Объем вводимой пробы 10 мкл. Детектирование осуществляли при длинах волн 254, 270, 290, 340, 360 и 370 нм. Количественное определение индивидуальных компонентов в образцах растений проводили по методу внешнего стандарта при длине волны 360 нм. Стандартные растворы готовили в концентрации 10 мкг/мл.

Содержание индивидуальных компонентов (С_x) вычисляли по формуле (мг/г от массы воздушно-сухого сырья):

$C_x=\frac{(C_{CT}\times S_1\times V_1\times V_2)}{(S_2\times M\times V_3)}\times 1000$

где С_ст – концентрация стандартного вещества, мкг/мл; S₁ – площадь пика компонента в анализируемой пробе, е.о.п., S₂ – площадь пика стандартного вещества, е.о.п., V₁ – объем элюата после вымывания фенольных соединений с концентрирующего патрона, мл; V₂ – общий объем экстракта, мл; V₃ – объем экстракта, взятого на анализ, мл; М – масса навески, г; 1000 – пересчетный коэффициент.

Относительное стандартное отклонение повторяемости при определении фенольных компонентов составляет σr,отн = 0.011, относительное стандартное отклонение по времени удерживания у метода ВЭЖХ = 0.0018.

Анализ антиоксидантной активности с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH). Способность образцов к улавливанию свободных радикалов определяли с помощью 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH). Для этого аликвоту экстракта объемом 2 мл (растворенного в 70%-ном этаноле до концентраций в диапазоне 10–200 мкг/мл) смешивали с 3 мл раствора DPPH (62 мкг/мл в этаноле). После 30 мин инкубации в темноте при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность (D) при 517 нм против холостого образца. Активность по улавливанию свободных радикалов рассчитывали, как процент ингибирования по следующей формуле:

$X(\%)=\frac{D_{контроль}-D_{образец}}{D_{контроль}}\times 100$

где D_{контроль} – оптическая плотность контрольного раствора, содержащего все реагенты, кроме тестируемого экстракта, D_{образец} – оптическая плотность образца.

Результаты выражали в IC₅₀, DPPH, определяемом как концентрация антиоксиданта, которая вызывает 50% потерю DPPH в анализе активности по улавливанию радикалов DPPH. В качестве положительного контроля использовали растворы 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (тролокс) и аскорбиновой кислоты (концентрация 2.5–50 мкг/мл) [18].

Статистическая обработка полученных данных. Все эксперименты были проведены в двух повторностях. Данные анализировали в программах Microsoft Excel 2010, Statistica 8 и GraphPad Prism v. 5.0. Коэффициенты корреляции Пирсона были рассчитаны для анализа корреляций между концентрациями биологически активных соединений и антирадикальной активностью. Уровень значимости составлял p ≤ 0.05. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

В результате анализа биологически активных соединений в экстракте надземных органов Spiraea humilis из двух природных ценопопуляций Хабаровского края, Комсомольского р-на (окр. г. Комсомольск-на-Амуре и окр. с. Селихино) обнаружены фенольные соединения — флавонолы, катехины и фенолкарбоновые кислоты (табл. 2). Выявлены различия в содержании основных групп биологически активных веществ в листьях, соцветиях и стеблях. Листья и соцветия содержали больше исследуемых соединений, в стеблях их концентрации были значительно ниже.

 

Таблица 2. Содержание биологически активных веществ в 70%-ных этанольных экстрактах Spiraea humilis

Table 2. Content of biologically active substances in 70% ethanol extracts of Spiraea humilis

Орган растения Plant organ	Содержание, %				АОА, IC50, µg/ml
	Фенольные соединения Phenolic compounds	Катехины Catechins	Флавонолы Flavonols	Фенолкарбоновые кислоты Phenolcarboxylic acids
Ценопопуляция 1 (окр. г. Комсомольск-на-Амуре) Cenopopulation 1 (environs of Komsomolsk-on-Amur)
Соцветия Inflorescences	4.6 ± 0.1	5.3 ± 0.1	2.1 ± 0.1	7.5 ± 0.3	93
Листья Leaves	4.6 ± 0.0	2.7 ± 0.1	1.6 ± 0.1	8.7 ± 0.3	288
Стебли Stems	2.0 ± 0.1	0.9 ± 0.0	0.1 ± 0.0	2.2 ± 0.1	587
Ценопопуляция 2 (окр. с. Селихино) Cenopopulation 2 (environs of Selikhino village)
Соцветия Inflorescences	5.8 ± 0.1	5.5 ± 0.1	1.9 ± 0.1	6.6 ± 0.2	119
Листья Leaves	4.3 ± 0.0	2.6 ± 0.0	1.9 ± 0.0	7.3 ± 0.2	234
Стебли Stems	2.2 ± 0.0	1.1 ± 0.0	0.2 ± 0.01	2.5 ± 0.1	656
Тролокс Trolox Аскорбиновая кислота Ascorbic acid					8 9

 

Общее содержание фенольных соединений (в пересчете на кофейную кислоту) и катехинов (в пересчете на (±)-катехин) в соцветиях было выше, чем в листьях и стеблях (табл. 2). Различия в концентрациях фенольных соединений в соцветиях и листьях оказались близки: 4.6 и 4.6% в первой ценопопуляции, 5.8 и 4.3% — во второй ценопопуляции, соответственно. В изученных образцах растений из обеих ценопопуляций, отмечено следующее: в соцветиях содержание катехинов в 2 раза выше, чем в листьях и в 4 раза выше, чем в стеблях.

Содержание фенолкарбоновых кислот в изученных образцах у S. humilis напротив, было несколько выше в листьях, чем в соцветиях (8.7 и 7.3% в первой ценопопуляции; 7.5 и 6.6% — во второй). В надземных органах S. humilis из всех рассматриваемых классов соединений максимальная концентрация отмечена для фенолкарбоновых кислот: даже в стеблях она превышала 2%.

Обращает на себя внимание содержание флавонолов в исследуемых экстрактах. При анализе полученных данных по флавонолам в изученных образцах у растений первой ценопопуляции обнаружено большее их содержание в соцветиях (2.1%), в листьях концентрация флавонолов была в 1.3 раза меньше (1.6%). В образцах из второй ценопопуляции обнаружено более высокое содержание флавонолов обнаружено в листьях (1.9%), в соцветиях их концентрация несколько меньше. Самое низкое содержание флавонолов обнаружено в водно-этанольных экстрактах стеблей растений в обеих ценопопуляциях (0.1–0.2%).

Состав индивидуальных соединений фенольной природы в водно-этанольных экстрактах листьев, соцветий и стеблей S. humilis исследован методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Из них на основании УФ-спектров и сопоставления времен удерживания пиков веществ на хроматограммах анализируемых образцов с временами удерживания пиков стандартных образцов идентифицировано 15 соединений (табл. 3). Вещества представлены следующими группами: коричная кислота и ее производные: хлорогеновая и n-кумаровая, производное бензойной кислоты – гентизиновая кислота, флавон (цинарозид), дигидрофлавонол (дигидрокверцетин) и наиболее разнообразно представлена группа флавонолов: кверцетин, кемпферол, гиперозид, рутин, спиреозид, авикулярин, кверцитрин, астрагалин и никотифлорин. Идентифицированные флавонолы представлены гликозидами кверцетина и кемпферола, в качестве сахарной группы выступают как моносахара (глюкоза, рамноза, галактоза, арабиноза), так и дисахара (рутиноза). В идентифицированных гликозидах углеводные остатки связаны через атом кислорода в С-3 положении, кроме спиреозида, у которого остаток глюкозы присоединен в 4'-положении.

 

Таблица 3. Характеристика и содержание фенольных соединений, обнаруженных в экстрактах Spiraea humilis

Table 3. Characteristics and content of phenolic compounds in Spiraea humilis extracts

№	Соединение Compound	Время удержи­вания (tR), мин Retention time (tR), min	Спектральная характеристика λmax, нм Spectral characteristic λmax, nm	Содержание, мг/г
				Ценопопуляция 1 Cenopopulation 1			Ценопопуляция 2 Cenopopulation 2
				Соцветия Inflorescences	Листья Leaves	Стебли Stems	Соцветия Inflorescences	Листья Leaves	Стебли Stems
1	Хлорогеновая кислота Сhlorogenic acid	3.2	244, 300 пл. (sh.), 330	0.15 ± 0.01	0.36 ± 0.01	0	0.25 ± 0.01	0.30 ± 0.01	0.30 ± 0.01
2	Гентизиновая кислота Gentisic acid	4.9	235, 330	0.20 ± 0.01	0	0	0.08 ± 0.00	0.18 ± 0.01	0.18 ± 0.01
3	n-кумаровая кислота n-coumaric acid	7.9	226, 293 пл. (sh.), 320	0	0.05 ± 0.00	0	0.31 ± 0.01	1.05 ± 0.04	1.05 ± 0.04
4	Дигидро­кверцетин Dihydro­quercetin	8.5	290	0.29 ± 0.01	0.05 ± 0.00	0	0.22 ± 0.01	0.51 ± 0.02	0.51 ± 0.02
5	Цинарозид Cinaroside	16.3	250, 265 пл. (sh.), 290 пл. (sh.), 350	0.21 ± 0.01	0.72 ± 0.03	0	0.08 ± 0.00	0.44 ± 0.02	0.44 ± 0.02
6	Гиперозид Hyperoside	18.3	255, 268 пл. (sh.), 355	0.25 ± 0.01	0.36 ± 0.01	0	0.39 ± 0.01	0.53 ± 0.02	0.53 ± 0.02
7	Рутин Rutin	19.2	255, 265 пл. (sh.), 355	3.02 ± 0.11	1.81 ± 0.07	0.41 ± 0.02	2.55 ± 0.09	1.72 ± 0.06	1.72 ± 0.06
8	Спиреозид Spireoside	26.6	255, 265 пл. (sh.), 366	0.14 ± 0.01	0.35 ± 0.01	0	0	0.86 ± 0.03	0.86 ± 0.03
9	Авикулярин Avicularin	28.0	260, 270 пл. (sh.), 360	0.43 ± 0.02	0.33 ± 0.01	0	0.31 ± 0.01	0.82 ± 0.03	0.82 ± 0.03
10	Кверцитрин Quercitrin	31.0	260, 272 пл. (sh.), 298 пл. (sh.), 355	0.46 ± 0.02	0.27 ± 0.01	0	0.55 ± 0.02	0.28 ± 0.01	0.28 ± 0.01
11	Астрагалин Astragalin	32.3	265, 300 пл. (sh.), 350	2.38 ± 0.09	0.63 ± 0.02	0	1.69 ± 0.06	0.52 ± 0.02	0.52 ± 0.02
12	Никотифлорин Nicotiflorin	33.5	260, 290 пл. (sh.), 350	0.56 ± 0.02	0.44 ± 0.02	0	0.29 ± 0.01	0.24 ± 0.01	0.24 ± 0.01
13	Коричная кислота Сinnamic acid	35.9	216, 275	0	0	0	0.25 ± 0.01	0.07 ± 0.00	0.07 ± 0.00
14	Кверцетин Quercetin	40.6	255, 372	1.62 ± 0.06	0.75 ± 0.03	0.22 ± 0.01	1.63 ± 0.06	0.75 ± 0.03	0.75 ± 0.03
15	Кемпферол Kaempferol	47.9	225, 266, 370	0.45 ± 0.02	0	0	0.58 ± 0.02	0	0

 

Выявлено, что состав фенольных соединений в листьях, соцветиях и стеблях неоднороден. В надземных органах S. humilis из окр. г. Комсомольск-на-Амуре не обнаружено коричной кислоты. Гентизиновая кислота и кемпферол идентифицированы только в соцветиях, n-кумаровая кислота – только в листьях. В стеблях спиреи из этой ценопопуляции выявлены только два флавонола – рутин и кверцетин.

В целом, для водно-этанольных экстрактов из надземных частей спиреи низкой из окр. д. Селихино (вторая ценопопуляция) характерно большее разнообразие фенольных соединений, чем в экстрактах растений, собранных в окр. г. Комсомольск-на-Амуре (первая ценопопуляция). Например, если в экстрактах стеблей из первой ценопопуляции обнаружены только рутин и кверцетин, то во второй идентифицировано 8 фенольных соединений. Однако в соцветиях растений из второй ценопопуляции не выявлен спиреозид, в листьях – кемпферол.

Основными веществами в экстрактах из соцветий S. humilis из первой ценопопуляции являются рутин (t_R = 19.2 мин), астрагалин (t_R = 32.3 мин) и кверцетин (t_R = 40.6 мин). В листьях кроме вышеперечисленных соединений значительная доля приходится на цинарозид (t_R = 16.3 мин). При этом содержание соответствующих флавонолов в листьях сильно отличалось от их содержания в соцветиях. Так, отличие наблюдали в содержании рутина, (в соцветиях в 1.7 раз больше, чем в листьях и более чем в 7 раз — в стеблях), а самое значительное — в содержании астрагалина (в соцветиях в 3.8 раз больше, чем в листьях и полное отсутствие в стеблях).

Для экстрактов из соцветий и стеблей второй ценопопуляции основными фенольными соединениями также являются рутин, астрагалин и кверцетин. Стоит отметить, что содержание астрагалина и рутина отличалось от содержания в первой ценопопуляции. Состав основных фенольных соединений в экстрактах листьев из двух ценопопуляций различен. Содержание рутина и кверцетина у растений второй ценопопуляции также высокое, но вместо астрагалина и цинарозида в состав основных соединений входят n-кумаровая кислота (t_R = 7.9 мин) и авикулярин (t_R = 28 мин). При этом содержание рутина в листьях двух ценопопуляций различалось незначительно, а показатели кверцетина совпадали. Концентрация авикулярина (0.82%) в экстрактах листьев растений второй ценопопуляции была в 2.5 раза выше, чем в экстрактах листьев растений из первой популяции (0.33%). Кроме того, содержание n-кумаровой кислоты в экстрактах из листьев растений, собранных в окр. пос. Селихино на 1 мг/г выше, по сравнению с листьями растений из ценопопуляции в окр. г. Комсомольск-на-Амуре. Концентрации мажорных соединений в разных органах растений из второй ценопопуляции также различались. Содержание рутина было в 1.5 раза, кверцетина — в 2.2 раза, а астрагалина — в 3.3 раза выше в соцветиях, чем в листьях.

Кроме анализа биологически активных веществ, проведено исследование антиоксидантной активности 70%-ных этанольных экстрактов надземных органов S. humilis методом влияния экстракта на радикал 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH). На основании сравнения значений IC₅₀, которые показывают степень нейтрализующего эффекта экстракта на радикал DPPH, экстракты соцветий S. humilis оказались наиболее эффективными (93 и 119 мкг/мл) (табл. 2). Разница между показателями антиоксидантной активности между экстрактами из соцветий двух ценопопуляций была несущественной. Относительно высокую активность проявили также экстракты из листьев спиреи (288 и 234 мкг/мл), однако она была ниже, чем активность экстрактов из соцветий практически в 2 раза. Различий между значениями IC₅₀ экстрактов из листьев разных ценопопуляций не выявлено. Наименее эффективными оказались экстракты стеблей (587 и 656 мкг/мл). Следует отметить, что значения IC₅₀ для разных экстрактов спиреи значительно отличаются от показателей контрольных веществ с высокой антиоксидантной активностью (тролокс и аскорбиновая кислота) (табл. 2).

Проведен анализ корреляционной зависимости между содержанием биологически активных веществ в экстрактах S. humilis и антиоксидантной активностью. Коэффициент корреляции (R) оказался отрицательным. Значения антиоксидантной активности (табл. 2), полученные в работе, отражают концентрацию экстракта, при которой наблюдается 50%-ное ингибирование радикала DPPH. Чем меньше концентрация экстракта, затраченная на нейтрализацию свободного радикала, тем выше антиоксидантная активность. Поэтому полученные значения для корреляционного анализа должны рассматриваться с обратным знаком.

Регрессионный анализ выявил линейную связь степени нейтрализации свободных радикалов водно-этанольными экстрактами S. humulis c содержанием исследуемых биологически активных веществ. Наиболее высокое значение коэффициента корреляции обнаружено для флавонолов (R = 0.97, p ≤ 0.05) (рис. 2), фенольных соединений (R = 0.94, p ≤ 0.05) и катехинов (R = = 0.92, p ≤ 0.05), что свидетельствует о наибольшем вкладе этих БАВ в нейтрализацию свободных радикалов. Напротив, фенолкарбоновые кислоты (R = 0.86, p ≤ 0.05) принимают, по-видимому, меньшее участие в нейтрализации свободных радикалов. Из идентифицированных фенольных соединений, обнаруженных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, наибольший вклад в антиоксидантную активность вносят флавонолы кверцитрин (R = 0.97, p ≤ 0.05) (рис. 3), рутин (R = 0.96, p ≤ 0.05) и кверцетин (R = 0.93, p ≤ 0.05). Весомый вклад в антирадикальную активность экстрактов спиреи низкой также вносят флавонолы никотифлорин (R = 0.87, p ≤ 0.05) и астрагалин (R = 0.86, p ≤ 0.05). Остальные обнаруженные соединения не имеют выраженной связи с антиоксидантным эффектом экстрактов спиреи низкой (R ≤ 0.71).

 

Рис. 2. Зависимость между содержанием флавонолов (%) в экстрактах Spiraea humilis и антиоксидантной активностью (IC₅₀, мкг/г).

Fig. 2. Relationship between the content of flavonols (%) in Spiraea humilis extracts and antioxidant activity (IC₅₀, µg/g).

 

Рис. 3. Зависимость между содержанием кверцитрина (мг/г) в экстрактах Spiraea humilis и антиоксидантной активностью (IC₅₀, мкг/г).

Fig. 3. Relationship between the content of quercitrin (mg/g) in Spiraea humilis extracts and antioxidant activity (IC₅₀, μg/g).

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование состава и содержания биологически активных веществ с помощью метаболомных методов спектрометрии и ВЭЖХ в образцах листьев Spiraea humilis (Rosaceae), собранных в двух природных ценопопуляциях Хабаровского края, позволило выявить высокие уровни фенольных соединений. Показано, что 70%-ные этанольные экстракты соцветий S. humilis проявляли наибольший антиоксидантный потенциал в отношении радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила, по сравнению с листьями и стеблями. Выявлены вторичные метаболиты, отвечающие за антирадикальную активность S. humilis.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 23-24-00310, https://rscf.ru/project/23-24-00310/.

Об авторах

В. А. Костикова

Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН

Email: NPetrova@binran.ru
Россия, Новосибирск

А. А. Петрук

Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН

Email: NPetrova@binran.ru
Россия, Новосибирск

Т. Н. Веклич

Амурский филиал Ботанического сада-института Дальневосточного отделения РАН

Email: NPetrova@binran.ru
Россия, Благовещенск

Н. В. Петрова

Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: NPetrova@binran.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы