Определение оптимальных параметров воздействия при микродиссекции блестящей оболочки эмбриона с помощью инфракрасных фемтосекундных лазерных импульсов

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Для борьбы с бесплодием, значительно распространенной проблемой в современном мире, применяется весь арсенал вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ): от культивирования эмбрионов in vitro до процедуры экстракорпорального оплодотворения, включая введение сперматозоида в цитоплазму ооцита (метод ИКСИ, от англ. ICSI – intra cytoplasmic sperm injection) сквозь защитную оболочку. Данная оболочка, называемая блестящей оболочкой эмбриона (zona pellucida, ZP), представляет собой гликопротеиновую структуру, окружающую ооцит на ранних стадиях развития, и выполняет роль барьера для защиты эмбриона от микроорганизмов, вирусов и иммунных клеток, которые могут присутствовать в яйцеводе [1, 2]. Важнейшим этапом развития, необходимым для имплантации эмбриона в эндометрий матки, является его хетчинг, или вылупление, т.е. высвобождение эмбриона из блестящей оболочки. Существует ряд факторов, при наличии которых эмбрион может испытывать затруднение с самостоятельным вылуплением. В клиниках репродуктивной медицины для минимизации рисков невылупления эмбриона была разработана технология вспомогательного хетчинга, когда целостность оболочки эмбриона нарушается искусственным образом (химически, механически либо с помощью лазерного излучения). В последнее десятилетие широкое распространение получил метод микрохирургии ZP с использованием инфракрасных лазерных диссекторов миллисекундной длительности – вспомогательный лазерный хетчинг (ВЛХ). Обзор всей совокупности методов, применяемых во вспомогательных репродуктивных технологиях, можно найти в работе [3]. В результате поглощения лазерного импульса происходит локальное разрушение белков блестящей оболочки вследствие нагрева области воздействия до температур в несколько сотен градусов [4]. Одним из вариантов исполнения данной процедуры является локальное истончение блестящей оболочки (рис. 1а); также возможно формирование сквозного отверстия в ней (рис. 1б).

 

Рис. 1. Примеры истончения (а) и формирования (б) сквозного отверстия в блестящей оболочке [5]: система Fertilase™ (MTM, Germany), 1.48 мкм, мощность – 100 мВт, длительность импульса – 5 мс, размер одиночной перфорации – 5 мкм.

 

Размер области диссекции в результате воздействия одиночным миллисекундным лазерным импульсом составляет от 5 до 20 мкм, что существенно превышает размер сфокусированного лазерного луча (~3 мкм). Это обусловлено теплопроводностью водной среды, в которую помещен эмбрион, и большой длительностью лазерного импульса. Технология ВЛХ несет риск термического повреждения клеток эмбриона, прилегающих к его оболочке, и предполагает возможность диссекции на ранних стадиях развития эмбриона, когда перивителлиновое пространство (расстояние между прозрачной оболочкой и клетками эмбриона) достаточно велико (~20 мкм) [6].

Для решения данной проблемы в настоящей работе предлагается использовать фемтосекундный лазерный источник излучения. Такие лазеры применяются в различных областях науки: от создания источников ТГц-излучения и проведения исследований с их использованием [7–10] до изучения прочностных свойств материалов [11–15] и процессов сверхбыстрого переноса энергии в веществе в сильно неравновесном состоянии [16, 17], а также от инъекций на клеточном уровне [18–20] до офтальмологии [21, 22]. Фемтосекундные лазеры нашли также широкое применение в биологии развития в целом и вспомогательных репродуктивных технологиях в частности (см. обзоры [23–26]). Они представляют перспективную альтернативу миллисекундным диссекторам, позволяющую устранить указанные выше недостатки благодаря фундаментальным особенностям взаимодействия с веществом. Нелинейные механизмы поглощения фемтосекундного лазерного излучения (например, многофотонное поглощение) в водной среде [27, 28] позволяют локализовать область воздействия. В результате размер формируемого надреза на блестящей оболочке может быть меньше геометрического размера области фокусировки лазерного луча, что значительно повышает точность микрохирургических процедур. Кроме того, предельно короткая длительность в совокупности с высокой мощностью импульса обеспечивают минимальный нагрев среды в области воздействия [29]. Это, в свою очередь, позволяет повысить безопасность лазерной микрохирургии эмбриона и расширить область применения фемтосекундных лазеров в ВРТ. Так, технологии управляемого ВЛХ [30] и бесконтактной лазерной маркировки преимплантационного эмбриона с целью исключения риска перепутывания [31] являются примерами их успешного применения.

Возможность применения фемтосекундных лазерных импульсов как видимого, так и инфракрасного диапазонов спектра была продемонстрирована ранее [32, 33]. Однако вопрос влияния параметров лазерного излучения на формируемый надрез блестящей оболочки был рассмотрен только для импульсов видимого диапазона (λ = 514 нм) [34]. Было показано, что надрез заданной ширины может быть получен при различном сочетании таких параметров, как энергия фемтосекундных импульсов Е и скорость перемещения лазерного луча υ. Целью настоящей работы является изучение влияния данных параметров на ширину формируемого надреза при использовании фемтосекундных импульсов инфракрасного диапазона, а также выбор оптимальных значений для выполнения микрохирургических процедур на блестящей оболочке эмбриона в рамках вспомогательных репродуктивных технологий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА

Микрохирургия эмбрионов выполнялась на установке “Фемтосекундный лазерный скальпель–оптический пинцет”, представленной на рис. 2 [35, 36]. В качестве лазерного скальпеля использовалось излучение фемтосекундного лазерного источника ТЕТА (ООО “Авеста Проект”), генерирующего лазерные импульсы со следующими параметрами: длительность τ = 280 фс, энергия E = 330 мкДж, длина волны излучения λ = 1028 нм, частота следования импульсов f ≤ 2.5 кГц. Отличие от установки, использованной в предыдущих исследованиях [35–37], состоит в том, что из схемы был изъят кристалл, преобразующий излучение во вторую гармонику (514 нм). На выходе из лазера был собран узел поляризационного ослабителя, состоящий из полуволновой пластинки и призменного поляризатора. Полуволновая пластина была закреплена на моторизованном поворотном столике 8MR151 (Standa), подключенном к персональному компьютеру, обеспечившему возможность удаленной регулировки энергии лазерных импульсов. Для контроля значений энергии лазерных импульсов использовался фотодиод DET36A2 (Thorlabs Inc.), часть лазерного пучка на который ответвлялась тонкой стеклянной пластинкой (отражение Френеля). Сигнал с фотодиода оцифровывался с помощью осциллографа Tektronix TDS 5054. Лазерное излучение заводилось в правый боковой порт инвертированного микроскопа Olympus IX‒71 и фокусировалось микрообъективом 20×UPlanFL (Olympus) с числовой апертурой NA = 0.5. Узел телескопа, установленный на пути лазерного излучения до заведения в микроскоп, служил для согласования диаметра лазерного пучка с апертурой микрообъектива. Задняя линза телескопа была закреплена на линейном моторизованном столике 8MT173-25 (Standa). Вторая функция телескопа заключалась в регулировке расходимости лазерного излучения за счет изменения расстояния между линзами. Для калибровки амплитуды сигнала фотодиода на предметный столик микроскопа SCAN IM 120 × 80 (Märzhäuser Wetzlar) устанавливался измеритель мощности, регистрирующий лазерное излучение на выходе микрообъектива микроскопа. Измеритель состоял из фотодиодного детектора S120VC и консоли PM100D (Thorlabs Inc.).

 

Рис. 2. Схема экспериментальной установки: 1 – фемтосекундный лазер; 2 – узел ослабления лазерного излучения; 3 – стеклянная пластина; 4 – фотодиод; 5 – узел телескопа; 6 – механический прерыватель лазерного излучения; 7, 8 – зеркала на длину волны лазерного излучения; 9 – микрообъектив; 10 – моторизованный предметный столик; 11 – чашка Петри с эмбрионами; 12 – конденсор микроскопа; 13 – осветитель; 14 – видеокамера; 15 – инвертированный микроскоп.

 

Микрохирургия эмбрионов выполнялась в специальных чашках Петри со стеклянным дном (кат. № 200350, SPL Lifesciences). Эмбрионы помещались в каплю питательной среды и покрывались слоем минерального масла, препятствовавшего испарению. Чашка устанавливалась на моторизованном предметном столике микроскопа. Диссекция ZP эмбриона осуществлялась перемещением последнего относительно неподвижного лазерного луча. Излучение фокусировалось с помощью микрообъектива в плоскости максимального сечения эмбриона – в “экваториальной” плоскости. Изображение эмбриона регистрировалось КМОП-камерой (КМОП – комплементарная структура на транзисторах металл–оксид–полупроводник; англ. CMOS) DFK 72AUC02 (the Imaging Source). Масштаб переноса изображения был предварительно оценен с помощью оптической меры ГОСТ 7513-56, установленной на предметный столик микроскопа, и составил K = 0.1082 мкм/пиксель.

Для автоматизации процедуры микрохирургии использовалось программное обеспечение, написанное в среде LabView (National Instruments). Оно позволяло оператору управлять такими параметрами, как энергия, частота следования импульсов и расходимость лазерного излучения, а также задавать траекторию движения лазерного луча поверх изображения эмбриона, регистрируемого КМОП-камерой. С помощью программного обеспечения осуществлялось управление включением/выключением лазерного излучения, синхронизованного с движением моторизованного предметного столика.

ОЦЕНКА РАЗМЕРА ЛАЗЕРНОГО ПУЧКА

Для оценки плотности энергии и интенсивности сфокусированного лазерного излучения необходимо знать радиус перетяжки лазерного пучка r₀. Пространственное распределение плотности энергии на поверхности мишени определяется функцией Гаусса

$F\left(r\right)=\frac{E}{\pi r_0^2}{e}^{-{\left(r/r_0\right)}^2},$

где E – энергия лазерного импульса, r – радиальная координата. Когда плотность энергии F превышает пороговое значение абляции материала F_abl, происходит унос материала мишени с последующим формированием кратера радиусом r_abl:

$F\left(r_{abl}\right)=\frac{E}{\pi r_0^2}{e}^{-{\left(\frac{r_{abl}}{r_0}\right)}^2}=F_{abl},$

откуда зависимость квадрата радиуса кратера абляции $r_{\text{abl}}^2$ представляет собой линейную регрессию по переменной ln(E) [38]:

$r_{abl}^2\left(E\right)=r_0^2\ln E-\ln \left(\pi r_0^2{F}_{abl}\right).$ (1)

Измерив размеры кратеров r_abl для серии лазерных импульсов с различной энергией E и вычислив коэффициенты регрессии ${\alpha }_1=r_0^2$ и ${\alpha }_2=\ln \left(\mathrm{\pi }{r}_0^2{F}_{\mathrm{abl}}\right),$ можно определить радиус перетяжки лазерного пучка r₀ и пороговое значение плотности энергии абляции материала мишени F_abl. Мишень полированного монокристаллического арсенида галлия является удобным образцом для исследования, поскольку кратеры на его поверхности при превышении порогового значения F_abl > 0.2 Дж/см² хорошо различимы.

Среда для культивации эмбриона представляет собой водную среду с небольшим добавлением солей и компонентов, поддерживающих требуемую кислотность и осмолярность. Поскольку значение показателя преломления среды не отличается существенно от значения для воды (1.336 против 1.333; рефрактометр ИРФ 454Б2М), определение параметра лазерного пучка r₀ было выполнено в воде. Мишень GaAs была установлена на дне чашки Петри на проставки-спейсеры толщиной ~100 мкм и покрыта дистилированной водой (рис. 3а). Далее выполнялась фокусировка микрообъектива для достижения резкого изображения поверхности мишени на экране персонального компьютера с последующей настройкой лазерного телескопа для получения на поверхности мишени кратера круглой формы. Полученная зависимость размера кратера абляции от энергии лазерных импульсов $r_{\text{abl}}^2=f\left(\text{ln}\left(E\right)\right)$ вида представлена на рис. 3б. Сфокусированный пучок лазерного излучения имел слегка эллиптическую форму, а его размеры, вычисленные на основе коэффициентов регрессии, вдоль большой и малой осей составили $r_{0\mathrm{x}}$= 1.6 и $r_{0y}$= 1.5 мкм соответственно.

 

Рис. 3. Измерение размера лазерного пятна: (а) мишенный узел: 1 – микрообъектив, 2 – чашка Петри со стеклянным дном, 3 – проставки, 4 – вода, 5 – мишень; (б) – зависимость квадрата размера кратера ${\mathit{r}}_{\mathbf{\text{abl}}}^{\mathbf{2}}$ от логарифма энергии ln(E): 1, 2 – размеры вдоль большой и малой осей кратера.

 

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ШИРИНЫ НАДРЕЗА

Лазерной микрохирургии блестящей оболочки подвергались эмбрионы мыши, находящиеся на двух- или четырехклеточной стадии развития (процесс подготовки эмбрионов стандартен и изложен подробно в [39]). Морфология эмбрионов обеспечивала достаточно большое расстояние (около 10–15 мкм) между клетками эмбриона и его оболочкой, облегчая проведение микрохирургических процедур. Диссекция блестящей оболочки осуществлялась последовательностью лазерных импульсов при линейном перемещении эмбриона относительно лазерного луча с заданной скоростью υ. В собранной экспериментальной схеме лазерный луч оставался неподвижен, а перемещение эмбриона с заданной скоростью осуществлялось с помощью моторизованного двухкоординатного предметного стола микроскопа. Для простоты восприятия здесь и ниже по тексту под скоростью луча υ понимается скорость движения эмбриона относительно неподвижного луча.

На рис. 4а представлена микрофотография фрагмента оболочки эмбриона после выполнения серии надрезов при различной энергии лазерных импульсов E. Оператор задавал набор траекторий в виде линий, направленных к центру эмбриона и перпендикулярных к поверхности блестящей оболочки.

 

Рис. 4. Микрофотография (а) фрагмента блестящей оболочки эмбриона после выполнения микрохирургии при различных энергиях лазерных импульсов (υ = 0.01 мм/с, f = 2.5 кГц); E_min = 134 нДж, E_max = 190 нДж; прямоугольник ограничивает область для построения профилей сечения; (б) осредненный профиль сечения: D₁, D₂ — ширины надреза, измеренные по среднему уровню яркости блестящей оболочки и от максимума светлого “бортика” на профиле соответственно.

 

Перемещение лазерного луча относительно эмбриона осуществлялось в радиальном направлении: от внешней границы блестящей оболочки эмбриона к внутренней. Скорость луча при движении вдоль траектории υ = 0.01 мм/с и частота импульсов f = 2.5 кГц в данной серии экспериментов оставались неизменными. При перемещении эмбриона от одной траектории к другой (холостое перемещение при выключенном излучении) скорость составляла 0.05 мм/с во избежание больших ускорений при начале и окончании движения. Расстояние между надрезами выбиралось не менее 10 мкм.

Для определения ширины надреза строился профиль сечения его изображения, расположенный перпендикулярно надрезу. Профиль сечения представляет собой зависимость яркости от пространственной координаты (рис. 4б). Область надреза выглядит на профиле сечения как “канавка” с уровнем яркости, опускающимся до значений ~120, и “бортиком”, достигающим значений 210. Минимальное и максимальное значения яркости (0 и 255) соответствуют черному и белому цвету на микрофотографии. При этом средний уровень яркости блестящей оболочки вне области лазерного воздействия соответствует диапазону значений 150–160. Формирование светлого “бортика” предположительно связано с процессами преломления и полного внутреннего отражения. При распространении света от осветителя микроскопа сквозь блестящую оболочку эмбриона свет отражается от стенки надреза и попадает в регистрирующую изображение КМОП-камеру. Противоположная стенка надреза остается при этом в тени, а ее положение характеризуется темной областью на изображении. При уменьшении ширины надреза количество отраженного стенкой света уменьшается и яркость светлого бортика снижается. Результатом измерения ширины надреза служила величина D_av, равная полусумме значений D₂ и D₁ (рис. 4б), а их полуразность определяла точность измерения ∆D (показана отрезками на рис. 5 и 6 в виде погрешности). Осреднение осуществлялось по 50 сечениям, обозначенным прямоугольником на рис. 4а.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В проведенных ранее исследованиях [31, 39]значение скорости υ = 0.01 мм/с было выбрано с точки зрения времени, затрачиваемого на выполнение микрохирургии блестящей оболочки. Такое значение скорости позволяло избежать больших ускорений эмбриона, лежащего свободно на дне перемещаемой чашки Петри. При этом время на выполнение надреза в рамках процедуры вспомогательного хетчинга эмбриона было достаточно мало и не превышало 2–3 с, что позволяло минимизировать пребывание группы экспериментальных эмбрионов вне инкубатора. Зависимость ширины надреза от энергии лазерных импульсов была получена ранее для скорости υ = 0.01 мм/с (см. [34], λ = 514 нм). В настоящей работе исследование воздействия инфракрасных импульсов (λ = 1028 нм) дополнено измерениями как при меньших (υ = 0.0025 мм/с), так и бόльших (υ = 0.05 мм/с) значениях скорости луча (рис. 5).

 

Рис. 5. Зависимости квадрата ширины надреза ${\mathit{D}}_{\mathbf{a}\mathbf{v}}^{\mathbf{2}}$ от логарифма энергии лазерных импульсов ln(E) при f = 2.5 кГц и различных скоростях перемещения: 1 – υ = 0.0025 мм/с, 3 – 0.01, 5 – 0.05; 2, 4, 6 – линейные аппроксимации.

 

Надрезы на блестящей оболочке становятся видимыми при достижении энергией лазерных импульсов определенного значения E_min, которое тем больше, чем выше скорость перемещения луча. Максимально допустимые значения E_max определяются интенсивностью лазерных импульсов, вызывающих оптический пробой водной среды. Последний приводил к формированию кавитационного пузыря, который мог отбросить эмбрион в сторону. Снижение скорости относительно номинальной υ = 0.01 мм/с позволило сформировать видимые надрезы при меньшей энергии лазерных импульсов.

Особенностью воздействия фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 1028 нм является достаточно узкий диапазон значений E_max/E_min. Если для видимого излучения (λ = 514 нм) данное соотношение составляло ~3 [30], то для λ = 1028 нм при υ = 0.01 мм/с Emax /Emin ≈ 1.5. Минимальное значение энергии ИК-импульсов, необходимое для формирования надреза, превышает значение для излучения видимого диапазона (λ = 514 нм, υ = 0.01 мм/с) примерно в семь раз. Данное обстоятельство обусловлено совокупностью двух факторов: бόльшим размером перетяжки лазерного пучка r₀ для ИК-излучения и бόльшим значением интенсивности лазерного импульса, необходимого для инициации процесса многофотонного поглощения при представлении водной среды в виде аморфного диэлектрика [28, 29]. При значениях E_max > 200 нДж проявлялись признаки оптического пробоя в виде кавитационных пузырей.

Диссекция ZP эмбриона заключается в ее локальном разрушении в результате поглощения лазерного излучения. Взаимодействие фемтосекундного лазерного импульса со средой приводит к образованию “свободных” электронов в зоне проводимости в результате действия процессов многофотонной ионизации и туннельного эффекта Зенера [28, 40]. Вследствие нелинейности процесса поглощения электроны оказываются существенно локализованными в области фокусировки лазерного излучения. Одним из возможных механизмов разрушения белков, составляющих основу блестящей оболочки, является фотохимический эффект, приводящий либо к диссоциации молекул воды и созданию активных форм кислорода, разрушающих белки, либо к непосредственному нарушению связей (механизмы фемтосекундной нанохирургии клеток более подробно изложены в работах [28, 41]).

Ширина надреза определяется совокупностью параметров, включающих скорость υ перемещения лазерного пучка, радиус его перетяжки r₀, а также частоту следования импульсов f, определяющих их пространственное перекрытие при перемещении лазерного пучка по траектории: D ~Er₀f/υ. Для определения оптимальных параметров лазерного воздействия при λ = 1028 нм проведена серия экспериментов для различных скоростей перемещения эмбриона υ при фиксированной частоте импульсов f. Ширина надреза блестящей оболочки D_av оценивалась по изложенной выше методике. Исследования проведены для трех значений энергии лазерных импульсов: E₁ = 136 нДж – энергия, близкая к минимальной, при которой на блестящей оболочке эмбриона заметен эффект лазерного воздействия при υ = 0.01 мм/с, Е₂ = 154 нДж и Е₃ = 174 нДж. Частота следования импульсов составляла f = 2.5 кГц. Зависимости D_av(υ) при заданной энергии E и фиксированной частоте следования лазерных импульсов f показаны на рис. 6 в виде маркеров; значения D_av(υ) и D_av(E) демонстрируют неплохое согласие с точностью ~0.2 мкм. Линии – аппроксимации экспериментальных значений уравнением линейной регрессии по переменной lg(υ):

D_av(υ) = β1 – β2lg(υ). (2)

Значения коэффициентов β представлены в таблице.

 

Коэффициенты линейной регрессии

Энергия Е, нДж	136	154	174
β1	–2.48 ± 0.14	–0.78 ± 0.09	0.10 ± 0.08
β2	1.66 ± 0.05	1.20 ± 0.04	1.09 ± 0.02

 

Увеличение энергии лазерных импульсов на 13% и 28% относительно E₁ позволило повысить скорость луча относительно номинального значения υ = 0.01 мм/с. Максимальная скорость υ, при которой формируется видимый надрез, увеличилась в пять раз для E₂; максимальное значение υ для E₃ в эксперименте достигнуто не было и предположительно составляет υ ~ 0.2 мм/с для D_av ≈ 0.8 мкм. Значение ширины D_av ≈ 0.8 ± 0.2 мкм является минимальным наблюдаемым в эксперименте при любых сочетаниях E и υ. Снижение энергии импульсов или увеличение скорости в попытке получить надрез меньшей ширины приводили к результату, неразличимому оптической системой микроскопа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение фемтосекундных лазерных импульсов для микрохирургии блестящей оболочки эмбриона позволяют получить надрез, ширина которого меньше размера перетяжки лазерного пучка. Если рассматривать предельные значения сверху, то независимо от скорости υ максимально допустимая энергия для ИК-импульсов не превышала E_max ≤ 200 нДж. При бόльших значениях проявлялись признаки оптического пробоя в виде кавитационных пузырей (область 7 на рис. 6).

 

Рис. 6. Зависимости ширины надреза блестящей оболочки от скорости лазерного пучка D_av(υ) при f = 2.5 кГц и различных значениях энергии лазерного импульса: 1 – E = 136 нДж; 2 – 152; 3 – 174; 4* – 134, 141, 151, 159, 167, 173, 190; 5** – 115, 135, 151, 167, 185; 6*** – 152, 159, 167, 174, 189; 7 – область оптического пробоя; данные для E*, E**, E*** взяты с рис. 5.

 

Анализ полученных зависимостей показал, что заданное значение ширины надреза блестящей оболочки эмбриона можно получить при различных сочетаниях энергии лазерного импульса и скорости луча. Например, ширина D ≈ 1.5 мкм может быть достигнута при следующем сочетании параметров: E = 136 нДж и υ = 0.004 мм/с; E = 152 нДж и υ = 0.013 мм/с; E = 174 нДж и υ = 0.05 мм/с (данные представлены для f = 2.5 кГц и r₀ = 1.56 мкм). Указанные значения могут быть отмасштабированы для другой частоты f пропорциональным изменением скорости υ, например, для частоты f = 5 кГц значения υ нужно разделить на 2.

С практической точки зрения интерес представляет нахождение функции ширины надреза D от двух переменных: энергии E и скорости υ. Зависимость D от энергии лазерных импульсов E описывается уравнением (1), а от скорости луча υ – уравнением (2). При этом линии, апроксимирующие экспериментальные данные на рис. 6, имеют разный наклон, что свидетельствует о присутствии в зависимости D(υ) слагаемого, определяющего вклад энергии E лазерного импульса. Поэтому форма поверхности D(lg(υ), ln(E)) не является плоскостью, и для придания поверхности большей пластичности добавлены корректирующие слагаемые третьей степени:

 

$\begin{array}{c}D\left(E,\upsilon \right)=\left(a+b\text{lg}\left(\upsilon \right)+c{E}^3\right)\times \\ \times \left(d\sqrt{\ln \left(E\right)} + e+h{\upsilon }^3\right).\end{array}$ (3)

Найденные значения коэффициентов с использованием функции fittype в среде Matlab R2021b составили: a = 1.553, b = 0.5229, c = –3.468 × 10–7, d = 16.79, e = –39.95, h = 357. Ошибка аппроксимации экспериментальных данных заданной поверхностью не превысила 0.2 мкм (определяется точностью стыковки данных в сериях D_av(υ) и D_av(E)), что соответствует погрешности не более 10%. Коэффициент детерминации составил R² = 0.9868. Границы применимости функционала (3) задаются неравенствами 0.25 ≤ υ ≤ 100 мкм/с и 115 ≤ E ≤ 190 нДж для всех D(E, υ) > 0.7 мкм.

Проведенные ранее исследования показали, что для реализации процедуры вспомогательного лазерного хетчинга [39] с использованием фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны λ = 514 нм достаточно выполнить надрез шириной около 1 мкм. Надрезы для индивидуальной маркировки эмбрионов [31] являлись отчетливо различимыми при D ~ 1–1.5 мкм. Таких же размеров надрезов следует придерживаться и при реализации микрохирургических процедур с помощью ИК-импульсов. Таким образом, можно утверждать, что фемтосекундные импульсы инфракрасного диапазона спектра оказались применимы для микрохирургии блестящей оболочки и позволяют формировать надрезы той же минимальной ширины, что и излучение с длиной волны λ = 514 нм [34].

В общем случае, при выборе оптимальной комбинации параметров лазерного воздействия можно руководствоваться следующими соображениями. В конфигурации с неподвижным лазерным лучом и перемещающимся предметным столиком с эмбрионом в чашке Петри скорости υ > 0.03 мм/с следует избегать в силу большого ускорения, испытываемого эмбрионом в начале движения и большого риска его смещения из начального положения (эмбрион лежит на дне чашки и не закреплен). С другой стороны, скорости υ < 0.001 мм/с существенно увеличивают время диссекции и общее время нахождения эмбриона (или группы эмбрионов) вне инкубатора. Таким образом, выбор параметров следует начинать с задания желаемой ширины надреза блестящей оболочки. Для минимизации термического воздействия нужно выбирать наименьшие значения энергии E для желаемой ширины надреза D, принимая во внимание ограничения допустимой скорости в диапазоне υ = 0.001–0.03 мм/с в соответствии с полученной зависимостью D(E, υ). Оптимальная область параметров отмечена пунктиром на рис. 7 с учетом перечисленных соображений. В случае применения конфигурации экспериментальной схемы с неподвижным предметным столиком и управляемым положением луча ограничение скорости сверху не имеет смысла.

 

Рис. 7. Зависимость ширины надреза блестящей оболочки D от энергии лазерных импульсов Е и скорости υ: синие маркеры – экспериментальные данные, представленные на рис. 6; поверхность – аппроксимация уравнением (3).

 

Резюмируя различия в реализации технологии микрохирургии блестящей оболочки с использованием излучения с длинами волн 514 и 1028 нм, можно сделать следующие выводы. Энергия лазерных импульсов для ИК-излучения более чем в два раза выше по сравнению с излучением видимого диапазона. Это объясняется как большим диаметром сфокусированного лазерного пучка (в силу дифракции), так и меньшей энергией ИК-кванта. Последнее обстоятельство имеет большое значение в силу многофотонного характера поглощения, лежащего в основе взаимодействия фемтосекундного излучения с водной средой, представляемой в виде аморфного диэлектрика [28, 29]. В результате при переходе от видимого излучения к ИК минимальная энергия импульса, необходимого для диссекции блестящей оболочки, увеличивается, а диапазон допустимых энергий сужается, будучи ограниченным сверху явлением оптического пробоя водной среды. Увеличивается и средняя мощность ИК-излучения. Поэтому область оптимальных значений параметров лазерного воздействия с длиной волны 1028 нм у́же, чем на 514 нм. С этой точки зрения импульсы видимого диапазона выглядят предпочтительнее.

Вместе с тем оба рассмотренных значения длины волны излучения оказались пригодны для задачи формирования надреза на блестящей оболочке эмбриона. Однако для окончательного заключения о преимуществах использования излучения видимого или инфракрасного диапазонов спектра, а также о безопасности их применения требуется проведение дополнительных исследований биологических эффектов, индуцируемых лазерным воздействием в прилегающих клетках эмбриона. Последние являются предметом дальнейшего изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые проведены экспериментальные исследования влияния параметров лазерного воздействия на ширину надреза, формируемого в блестящей оболочке при выполнении микрохирургии ZP эмбриона мыши инфракрасными лазерными импульсами. Исследованы зависимости ширины надреза как от энергии лазерных импульсов E при заданной скорости перемещения лазерного луча υ, так и от скорости υ при различных энергиях E лазерных импульсов. Показано, что заданного значения ширины надреза можно достичь при различном сочетании параметров лазерного воздействия. Проведен анализ диапазона их допустимых значений, а полученная зависимость ширины надреза аппроксимирована функционалом переменных энергии и скорости. Допустимые значения составили υ = 0.001–0.03 мм/с и E = 115–190 нДж. Показано, что фемтосекундные импульсы инфракрасного диапазона спектра могут быть применены для микрохирургии блестящей оболочки эмбриона. Полученные результаты имеют практическое значение для реализации процедур вспомогательного лазерного хетчинга и маркировки эмбрионов, поскольку ширина формируемого надреза влияет на читаемость наносимого цифро-буквенного обозначения.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (№ 23-19-00424, https://rscf.ru/project/23-19-00424/) на оборудовании УНУ “Лазерный тераваттный фемтосекундный комплекс”, входящим в состав ЦКП “Лазерный фемтосекундный комплекс” ОИВТ РАН.

Соблюдение этических стандартов. Исследование одобрено этическим комитетом ИБГ РАН (протокол № от 5 декабря 2021 г.) и проведено в строгом соответствии с положениями Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

About the authors

Д. С. Ситников

ФГБУН Объединенный институт высоких температур РАН

Author for correspondence.
Email: Sitnik.ds@gmail.com
Russian Federation, Москва

Д. Е. Мухдина

ФГБУН Объединенный институт высоких температур РАН

Email: Sitnik.ds@gmail.com
Russian Federation, Москва

М. А. Филатов

ФГБУН Объединенный институт высоких температур РАН; ФГБУН Институт биологии гена РАН

Email: Sitnik.ds@gmail.com
Russian Federation, Москва; Москва

Ю. Ю. Силаева

ФГБУН Объединенный институт высоких температур РАН; ФГБУН Институт биологии гена РАН

Email: Sitnik.ds@gmail.com
Russian Federation, Москва; Москва

References

Supplementary files