Изучение метаболизма секретагога гормона роста ибутаморена (MK-677) в моче человека методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения

Полный текст

Гормон роста приводит к увеличению мышечной массы тела, уменьшению жировой массы, укреплению мышц, а также выполняет ряд других важных функций в организме человека [1]. Для увеличения выработки гормона роста применяют так называемые “секретагоги гормона роста”, одним из которых является ибутаморен (MK-677, схема 1), разработанный компанией Merck (Германия). Данное соединение имеет низкую молекулярную массу и характеризуется пероральной биодоступностью с увеличенным временем полувыведения [2–4].

 

Схема 1. Структурная формула ибутаморена.

 

При проведении исследований на собаках показано, что данное соединение увеличивает уровень гормона роста с высокой специфичностью [2]. Употребление ибутаморена здоровыми мужчинами, имеющими избыточный вес, в течение двух месяцев привело к устойчивому повышению сывороточных уровней гормона роста, инсулиноподобного фактора роста 1 и белка-3, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1 [5]; у пожилых людей MK-677 стимулирует обновление костной ткани [6]. В другом исследовании употребление ибутаморена привело к увеличению уровней гормона роста и инсулиноподобного фактора роста 1, увеличению как мышечной, так и жировой массы тела с небольшим влиянием на минеральную плотность костей. Наиболее частыми побочными эффектами были повышение аппетита, которое уменьшалось в течение нескольких месяцев, а также временные легкие отеки нижних конечностей и мышечные боли [1, 7].

Ибутаморен проходит клинические испытания в виде мезилатной соли – MK-0677 [2]. В рандомизированном исследовании по изучению безопасности и эффективности применения мезилата ибутаморена у пациентов с переломом шейки бедра получены данные о том, что этот препарат увеличивает риск сердечной недостаточности [3, 8]. Несмотря на то, что ибутаморен не прошел клинические испытания, возможно его приобретение на “черном рынке”.

Благодаря заявленным эффектам возможно употребление ибутаморена профессиональными спортсменами, поэтому он внесен в перечень запрещенных к употреблению препаратов Всемирного антидопингового агентства (категория S2, пептидные гормоны и их рилизинг-факторы) [9, 10]. В связи с этим представляет интерес разработка методик определения ибутаморена в биологических жидкостях. Для решения этой задачи использовали несколько подходов. В плазме данное соединение определяли с применением жидкостно-жидкостной экстракции метил-трет-бутиловым эфиром [11]. В моче ибутаморен определяли разбавлением образца [12] и твердофазной экстракцией, применяя патроны Oasis HLB после однократного перорального употребления препарата [13], а также используя патроны Oasis WCX [14]. Описано [15] определение ибутаморена путем гидролиза ферментом β-глюкуронидазой E. coli и жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) диэтиловым эфиром с последующим детектированием методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (УВЭЖХ–МС/МС). В перечисленных ранее исследованиях определяли только соединение в неизменной форме. Поиск метаболитов MK-677 проводили в образцах мочи и плазмы лошади [16], однако, поскольку пути метаболизма у животных и людей могут отличаться [17], важным является поиск метаболитов в биологических жидкостях человека для целей допинг-контроля.

Преимуществами мочи в качестве анализируемой матрицы являются неинвазивность, отсутствие болевых ощущений и простота получения образца. Кроме того, моча является предпочтительной матрицей при проведении скрининговых исследований, поскольку обеспечивает более широкое окно для обнаружения соединений, а концентрации соединений и их метаболитов обычно выше в моче по сравнению с плазмой и слюной [18].

Цель данного исследования – изучение метаболизма и кинетики выведения ибутаморена для его определения в моче человека методом УВЭЖХ–МС.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и реагенты. Стандартный образец MK-677 приобретали у Soyoung Biotech. Inc. (Китай). Использовали β-глюкуронидазу Escherichia coli (E. coli) (Roche Diagnostics, Германия) и арил-сульфатазу Helix pomatia (H. pomatia) (Sigma-Aldrich, США). В ходе эксперимента использовали также ацетонитрил (Biosolve, Израиль), метанол (J.T. Baker, Великбритания) квалификации “для ВЭЖХ”, муравьиную кислоту (98%) (Вектон, Россия). Для приготовления фосфатного буферного раствора с pH 6.5 использовали Na₂HPO₄·12H₂O, KH₂PO₄ и азид натрия. Для приготовления карбонатного буферного раствора с pH 10 применяли карбонат и гидрокарбонат калия. Ацетатный буферный раствор готовили с использованием ацетата натрия и уксусной кислоты (98%). Все реагенты для приготовления буферных растворов приобретали в Вектон (Россия).

Стандартный раствор ибутаморена с концентрацией 1 мг/мл готовили в ацетонитриле. Для получения растворов с меньшими концентрациями также использовали ацетонитрил.

Оборудование. Для детектирования ибутаморена и его метаболитов использовали ультравысокоэффективный жидкостный хроматограф Bruker Elute, оснащенный аналитической колонкой Phenomenex Kinetex C18 (100×2.1 мм, 1.7 мкм) с соответствующей предохранительной колонкой, соединенный с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометром Bruker MaXis Impact с источником электрораспылительной ионизации. Для обработки результатов использовали программное обеспечение Bruker Data Analysis 4.4. Условия масс-спектрометрического детектирования: температура источника ионизации – 250 ^оC; напряжение на капилляре – 4 кВ; напряжение на экстрагирующей линзе – 500 В; давление газа-распылителя (азот) – 100 кПа; скорость потока газа-осушителя – 5 л/мин; скорость сканирования – 3 Гц; диапазон сканирования масс – 100–1 500 m/z; давление газа-мишени (азот) – 1.5 мТорр.

Градиентное элюирование осуществляли по программе, представленной в табл. 1, при скорости потока подвижной фазы 0.4 мл/мин, температуре термостата колонки 40 ^оC и объеме анализируемого образца – 10 мкл. Температура термостатирования образцов была 5 ^оC.

 

Таблица 1. Условия градиентного элюирования

Время, мин	0.1%-ная муравьиная кислота в метаноле, %	0.1%-ная муравьиная кислота в воде, %
0.00	5	95
1.00	5	95
2.70	60	40
4.00	60	40
5.00	90	10
7.50	90	10
7.51	5	95
9.00	5	95

 

Употребление препарата. Доброволец употребил 10 мг соединения, поскольку это количество является безопасным [19]. Сбор образцов проводили в течение двух недель после однократного употребления препарата. Также получили контрольный образец до употребления препарата.

Подготовка проб мочи к анализу. Для изучения метаболизма ибутаморена использовали несколько способов пробоподготовки. Прежде всего проводили пятикратное разбавление образца смесью ацетонитрил–вода (70:30, по объему) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 10 000 об /мин. Надосадочный слой переносили в виалу и анализировали.

Для пробоподготовки, включающей ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой E. coli, использовали следующие условия: в аликвоту мочи объемом 3 мл вносили 1 мл фосфатного буферного раствора, содержащего фермент β-глюкуронидазу E. coli. Затем инкубировали смесь в течение 30 мин при 50 ^оC для деконъюгации глюкуронидов. После охлаждения до комнатной температуры переносили 100 мкл образца в виалу для анализа. В оставшийся образец (2.9 мл) вносили 1 мл карбонатного буферного раствора (pH 9) и 0.5 г сульфата натрия в качестве высаливателя. Затем добавляли 3 мл диэтилового эфира и перемешивали образец на орбитальном перемешивателе с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 4 000 об/мин. Водную фазу вымораживали при –35 ^оC, затем перенесли органическую фазу в твердотельный нагреватель для упаривания. После этого сухой остаток вновь растворяли в 300 мкл смеси метанол–вода (1:1, по объему) для анализа.

Проводили также ферменативный гидролиз арил-сульфатазой H. Pomatia, для чего 1 мл образца мочи инкубировали с данным ферментом в ацетатном буферном растворе (pH 5) в течение 2 ч при 50 ^оC с последующим анализом образца.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Использование комплексного подхода позволило установить, что ибутаморен подвержен метаболизму по двум фазам.

Анализ разбавленного образца мочи показал, что нативное соединение можно определить спустя практически двое суток (43 ч) в моче с момента его однократного употребления с применением данного подхода, при этом глюкуронид или сульфат ибутаморена не образуются.

В образцах разбавленной мочи присутствовали соединения с m/z 439.2010, что предположительно соответствует отщеплению бензильного фрагмента (29 ч), m/z 455.1959 (отщепление бензильного фрагмента и гидроксилирование, 5 ч), m/z 544.2356 (гидроксилирование, 29 ч), m/z 561.2377 (дигидроксилирование, 10 ч) (рис. 1). Для двух метаболитов ибутаморена, предположительно моно- и дигидроксилированного, происходило частичное образование глюкуронидов (рис. 2). В то же время образование сульфатированных конъюгатов не наблюдали на хроматограмме.

 

Рис. 1. Хроматограмма по выделенным ионам образца мочи после употребления ибутаморена. m/z: (а) 529.2479, (б) 439.2010, (в) 455.1959, (г) 545.2428, (д) 561.2377, (е) 577.2323.

 

Рис. 2. Хроматограмма по выделенным ионам разбавленного образца мочи после употребления ибутаморена. m/z: 1 – 721.2749, 2 – 737.2698.

 

Методика с ферментативным гидролизом и жидкостно-жидкостной экстракцией диэтиловым эфиром позволила детектировать приведенные ранее метаболиты первой фазы, а также предположительно тригидроксилированный метаболит с m/z 577.2323. Поскольку одним из этапов пробоподготовки является жидкостно-жидкостная экстракция с целью концентрирования аналитов, возможность обнаружения соединений увеличивается по сравнению с анализом разбавленного образца (см. табл. 2).

 

Таблица 2. Предполагаемые пути метаболизма ибутаморена в моче человека

Соединение	Предполагаемый путь метаболизма	Молекулярная формула	Моноизотопная масса, Да	[M+H]+, m/z	tR, мин	Временной диапазон обнаружения, ч
						разбавление	гидролиз и ЖЖЭ
MK-677	Нативное соединение	C27H36N4O5S	528.2406	529.2479	3.8	43	70
M1	Отщепление бензильного фрагмента	C20H30N4O5S	438.1937	439.2010	3.1	29	23
M2	Отщепление бензильного фрагмента и гидроксилирование	C20H30N4O6S	454.1886	455.1959	2.9, 3.2	5	5
M3	Гидроксилирование	C27H36N4O6S	544.2356	545.2428	3.6, 4.0	29	94
M4	Дигидроксилирование	C27H36N4O7S	560.2305	561.2377	3.8	10	35
M5	Тригидроксилирование	C27H36N4O8S	576.2254	577.2323	3.5	–	5
M6	Гидроксилирование и глюкуронидация	C33H44N4O12S	720.2676	721.2749	3.3	23	–
M7	Дигидроксилирование и глюкуронидация	C33H44N4O13S	736.2626	737.2698	3.4	5	–

 

В анализируемых образцах мочи, полученных после ферментативного гидролиза и жидкостно-жидкостной экстракции, наиболее высокую концентрацию нативного соединения наблюдали в первом образце, полученном спустя 1.7 ч после употребления вещества, затем она уменьшалась вплоть до 70 ч по экспоненциальной зависимости. Что касается предположительно гидроксилированного метаболита, имеющего время удерживания 3.6 мин, его максимальное содержание наблюдали во втором образце, полученном спустя 5.5 ч после употребления препарата, после чего его содержание в образцах уменьшалось в течение 88.5 ч.

Полученные результаты согласуются с данными Соболевского и соавт. [20], однако в настоящем исследовании не удалось детектировать метаболиты, соответствующие отщеплению 2-метил-2-аминопропильного фрагмента, в то время как обнаружено соединение, предположительно соответствующее процессу тригидроксилирования.

* * *

Таким образом, установлено, что для выявления присутствия ибутаморена в организме человека наиболее перспективно детектирование гидроксилированного метаболита в моче. Следует отметить, что проведение количественного анализа ограничено отсутствием стандартных образцов метаболитов. В этом случае возможно определение соединения в нативной форме, особенно при проведении скрининговых исследований.

Исследования проводили в рамках выполнения Госзадания Минобрнауки РФ № FZEN-2023-0006 с использованием научного оборудования ЦКП “Эколого-аналитический центр” Кубанского государственного университета.

Об авторах

Е. В. Дмитриева

Кубанский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: catherine_dmitrieva@outlook.com
Россия, 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149

А. З. Темердашев

Кубанский государственный университет

Email: catherine_dmitrieva@outlook.com
Россия, 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149

Э. М. Гашимова

Кубанский государственный университет

Email: catherine_dmitrieva@outlook.com
Россия, 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149

А. А. Азарян

Кубанский государственный университет

Email: catherine_dmitrieva@outlook.com
Россия, 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149

Список литературы

Дополнительные файлы