Artificial modified nucleotides for the electrochemical detection of nucleic acid amplification products

Full Text

Нуклеиновые кислоты, неся в себе генетическую информацию, являются неотъемлемой частью всех известных живых организмов и вирусов. В аналитической химии и биохимии нуклеиновые кислоты служат надежными маркерами микробного и вирусного заражения. Анализ образцов на нуклеиновые кислоты патогенных микроорганизмов используют в различных областях: в экологии, медицине, ветеринарии, научных исследованиях, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Классическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) и бурно развивающиеся методы изотермической амплификации способны обеспечить определение нуклеиновых кислот на сверхнизких уровнях содержания, вплоть до нескольких копий в образце [1–3]. Если ПЦР-анализ требует термоциклирования (циклического чередование температур для проведения синтеза, включая нагрев до 90 °С), то изотермические способы амплификации работают при постоянной температуре (около 30–60 °С), что значительно упрощает техническую сторону их проведения [1–3]. Теоретически некоторые изотермические реакции могут протекать и при комнатной температуре, но чуть медленнее, что делает возможным проведение амплификации in situ, держа пробирку в руке. Однако для применения в медицинских учреждениях “у постели больного” или в условиях “по месту требования” ПЦР и другие реакции амплификации нуклеиновых кислот нуждаются в подходящем инструментальном методе регистрации образующихся продуктов – ампликонов. Чаще всего продукты амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) – это двунитевые молекулы размером от одной до нескольких сотен пар оснований (п. о.), однако в некоторых видах изотермических реакций ампликоны имеют однонитевую или смешанную, достаточно экзотическую структуру. В поисках надежных, портативных и чувствительных систем обнаружения нуклеиновых кислот объединение принципов электрохимического анализа с биохимическими способами амплификации ДНК или рибонуклеиновой кислоты (РНК) представляет большой интерес [4–7]. Электрохимическое определение структуры и концентрации нуклеиновых кислот является особенно привлекательной альтернативой оптическим методам, благодаря своей высокой чувствительности, сравнительно простому инструментарию и относительно низкой стоимости. Среди известных стратегий обнаружения нуклеиновых кислот прямая вольтамперометрическая регистрация ДНК или РНК может обеспечить быстрый и экономичный анализ биологических образцов in situ. Под “прямой” вольтамперометрической регистрацией понимают считывание аналитического сигнала, используя электроактивные свойства самих молекул нуклеиновых кислот, без применения каких-либо внешних редокс-индикаторов или медиаторов. Один из возможных путей решения данной задачи – получение продуктов амплификации нуклеиновых кислот посредством полимеразного встраивания нуклеотидов, модифицированных электроактивными группами [8, 9]. Обоснование, общие принципы, достоинства и ограничения применения искусственных модифицированных нуклеотидов в качестве электроактивных меток для вольтамперометрического обнаружения ДНК и в меньшей степени РНК рассмотрены в настоящем обзоре.

Электрохимическая активность нуклеиновых кислот на твердых электродах

Нуклеиновые кислоты – биополимеры, способные электрохимически восстанавливаться и окисляться на поверхности электродов из различных материалов [10, 11]. В настоящее время электрохимия нуклеиновых кислот основана на их необратимом окислении на твердых (углеродных, золотых) электродах [12–17]. Известно, что нуклеиновые кислоты способны окисляться за счет остатков азотистых оснований: гуанина (Г), аденина (А), тимина (Т), цитозина (Ц) и урацила (У) [15–22]. Для свободных нуклеотидов на электродах из углеродных материалов электроактивность азотистых оснований проявляется анодными пиками при потенциалах 0.9–1.0 В (гуанозинмонофосфат, ГМФ), 1.2–1.3 В (аденозинмонофосфат, АМФ), 1.4–1.5 В (тимидинмонофосфат, ТМФ) и 1.5–1.6 В (цитидинмонофосфат, ЦМФ) (отн. Ag/AgCl, рН 7.4) [19, 23]. Интересно, что добавление остатков сахара и фосфата к азотистому основанию (с образованием нуклеозида и затем нуклеотида) сдвигает потенциал пика окисления к более высоким положительным значениям [24–29]. Соответственно показано, что гидролиз олигонуклеотидов ДНК до азотистых оснований сдвигает потенциалы окисления пиков обратно к меньшим положительным значениям [30]. Механизмы реакций окисления Г, А, Т, Ц и У на электродах из углеродных материалов детально исследованы и обсуждены в литературе [18, 19, 24–33]. Однако отчетливые сигналы окисления всех азотистых оснований получены только для нуклеотидов, некоторых коротких олигонуклеотидов и гомополинуклеотидов [19, 22, 23, 30–38]. Сигналы окисления ДНК- и РНК-олигонуклеотидов в основном генерируют остатки Г и А [23, 30, 37, 38]. На примере синтетических 15- и 19-членных ДНК-олигонуклеотидов показано [23], что только остатки Г и в некоторой степени А всегда дают отчетливые отклики на поверхности электрода даже при самом низком содержании данных азотистых оснований в олигонуклеотидной цепи. Анодный пик Г можно наблюдать на вольтамперограммах, даже если в олигонуклеотидной цепи присутствует только один остаток Г. Среди азотистых оснований только сигнал окисления Г чувствителен как к концентрации олигонуклеотидов, так и к их составу [23]. Известно, что на вольтамперометрический отклик молекулы олигонуклеотида сильно влияют состав и последовательность нуклеотидов в цепи, а также ее длина [23, 37, 38]. В молекуле олигонуклеотида остатки разных азотистых оснований “мешают” друг другу проявиться в виде четких пиков окисления на вольтамперограммах. Только последовательно убирая из цепи остатки нуклеотидов определенного вида, можно достоверно зарегистрировать сигналы окисления остальных нуклеотидов [38]. Другая важная взаимосвязь – зависимость вольтамперометрических сигналов от пространственной структуры молекулы олигонуклеотида – показана в ряде работ на примере G-квадруплексов [36, 38–40]. G-квадруплекс – это структура молекул ДНК или РНК с последовательностями, обогащенными остатками Г (англ. G), в которых Г спарены за счет неканонических водородных связей Хугстина с образованием плоской матрицы, которая дополнительно стабилизируется взаимодействиями между положительно заряженными ионами и неподеленными электронными парами Г [41]. G-квадруплексы могут быть образованы одной, двумя, тремя или четырьмя полинуклеотидными цепями. Формирование как внутри-, так и межмолекулярных G-квадруплексов зависит от нуклеотидной последовательности и состава раствора. Последние данные свидетельствуют об участии G-квадруплексов в ключевых функциях генома, таких как транскрипция, репликация, стабильность генома и эпигенетическая регуляция, а также об их роли в биологии онкологических заболеваний [41]. Таким образом, можно заключить, что потенциалы и высоты пиков окисления азотистых оснований в однонитевых ДНК (онДНК) и РНК слишком сильно зависят от концентрации, последовательности и пространственной структуры олигонуклеотидов, что затрудняет их использование для решения сложных аналитических задач. С увеличением длины олигонуклеотида величины сигналов окисления остатков азотистых оснований падают [38]. Интересно, что сверхдлинная однонитевая ДНК (онДНК) в несколько десятков тысяч нуклеотидов – продукт реакции репликации по типу катящегося кольца (англ. Rolling Circle Amplification, RCA) [42, 43] – не может напрямую быть зарегистрирована вольтамперометрически из-за высоких фоновых токов [38]. Только ферментативная “нарезка” сверхдлинной онДНК на фрагменты длиной ~70 нуклеотидов привела к появлению на вольтамперограммах кривых, характерных для олигонуклеотидов [38].

В отличие от синтетических олигонуклеотидов с искусственным несбалансированным содержанием нуклеиновых оснований и/или неслучайными последовательностями, в нативной ДНК все четыре вида азотистых оснований в среднем представлены в равной степени, а их общая последовательность случайна. Для гетерогенных препаратов ДНК из природных источников выявлены пики окисления только при 0.7–0.9 и 0.9–1.2 В (отн. Ag/AgCl) [44–50]. Эти пики отнесены к электрохимическому окислению остатков Г и А соответственно [24–29, 47]. Следует отметить, что токи пиков окисления для нативной двунитевой ДНК (днДНК) заметно ниже по сравнению с сигналами от денатурированной ДНК [44, 45, 47, 51, 52]. Кроме того, обнаружено, что токи окисления ДНК (как для нативных, так и для денатурированных биополимеров) уменьшаются с увеличением молекулярной массы ДНК [46]. Более того, продемонстрировано, что низкомолекулярные компоненты (окисляемые на электродах из углеродных материалов) даже при относительно низкой (микромолярной) концентрации могут существенно влиять на результаты электроокисления ДНК [46]. Интересно, что для регистрации сигналов окисления нативной днДНК, денатурированной ДНК и даже коротких олигонуклеотидов на стеклоуглеродных и золотых электродах требовалась предварительная поляризация электрода при высоких положительных потенциалах (от 0.5 до 1.3 В; в течение 15 мин), вероятно, из-за более эффективной адсорбции отрицательно заряженных биомолекул на положительно заряженных электродах [48, 52]. С увеличением молекулярной массы нативной ДНК можно ожидать уменьшения электрохимических сигналов остатков Г и А [46, 53]. Более того, когда активные центры нуклеиновых оснований связаны водородными связями и таким образом скрыты внутри двойной спирали Уотсона–Крика, они, очевидно, становятся недоступными для электродных реакций [8, 14, 21, 53, 54]. Таким образом, низкомолекулярные фрагменты онДНК, по-видимому, вносят основной вклад в суммарные токи электроокисления, генерируемые остатками Г или А в гетерогенных препаратах ДНК природного происхождения, без заметного вклада высокомолекулярной днДНК [53]. Электрохимическое поведение как коротких, так и длинных молекул онДНК еще до конца не изучено, и многие детали взаимосвязи между электрохимической активностью нуклеиновых кислот и их последовательностью и молекулярной структурой требуют систематического и более глубокого исследования. Очевидно, что вольтамперометрия нуклеиновых кислот проигрывает в чувствительности и селективности из-за высоких потенциалов окисления и низких значений регистрируемых токов. Это ставит под сомнение пригодность прямого электрохимического анализа (без предварительного гидролиза) для обнаружения относительно крупных молекул днДНК, таких как фрагменты, получаемые с помощью ПЦР.

Стратегия мечения нуклеиновых кислот с помощью электроактивных синтетических нуклеотидов

Для решения проблемы низкой электрохимической активности нуклеиновых кислот чешские ученые Хочек и Фойта использовали мечение полинуклеотидных последовательностей электроактивными группами путем ферментативного включения в цепи ДНК или РНК нуклеотидов с химически модифицированными основаниями [8, 9, 55] (рис. 1). Функциональные нуклеиновые кислоты, такие как аптамеры, сомамеры и ДНКзимы, достаточно давно известны и активно используются в биохимии и биоаналитической химии [55]. Модифицированные нуклеотиды появились с целью придания нуклеиновым кислотам особых свойств. Введение различных функциональных групп, особенно модификация остатков нуклеиновых оснований, позволило расширить области применения синтетических нуклеиновых кислот. Изначально производные нуклеотидов, содержащие электроактивные группы, такие как фенотиазин, порфирин, комплексы Ru₃^II(bpy)и Os₃^II(bpy) (где bpy – бипиридил), 1,10-фенантролин, красители TAMRA, флуоресцеин, родамин, Cy3 и Cy5 [55–66], присоединяемые к остатку азотистого основания, были успешно синтезированы, но использовались лишь в качестве флуоресцентных меток, а их электрохимические свойства не изучались. Другим активно развивающимся направлением модификации нуклеотидов, в том числе электроактивными группами, служит придание полинуклеотидным последовательностям сродства к определенным лигандам (пептидам, белкам, низкомолекулярным соединениям) [67–72].

 

Рис. 1. Модификация нуклеотидов электроактивными группами. На примере ДНК-нуклеотида.

 

За последние два десятилетия для целей электрохимии создана и протестирована целая палитра нуклеозидов и нуклеотидов с присоединенными фрагментами металлоорганических соединений (ферроцен) [73–78], хелатов переходных металлов [79], полиоксометаллатов [80, 81] или органических функциональных групп, способных восстанавливаться или окисляться на поверхности электрода [73, 82–95]. Как показано на рис. 1, при синтезе модификация нуклеотидов идет по азотистому основанию путем прямого или косвенного (через спейсер) присоединения электроактивного фрагмента к пуриновому (А, Г) или пиримидиновому (Т, У, Ц) основанию. Присоединение новой группы идет в положение С5 пиримидинового основания или в положение С7 пуринового основания. Синтетические нуклеотиды могут быть введены в последовательность нуклеиновых кислот путем различных ферментативных реакций при частичной или полной замене природных нуклеотидов в реакционной смеси. Образующаяся в результате молекула ДНК или РНК несет в себе новые электроактивные группы. Исходя из принципа метода, очевидны два основных требования, которым должен удовлетворять искусственный нуклеотид. Во-первых, модифицированный нуклеотид должен обладать высокой электрохимической активностью, в отличие от природного нуклеотида, обеспечивая селективное и чувствительное определение содержания модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты в образце при относительно низких потенциалах окисления или восстановления. Во-вторых, немаловажна совместимость синтетического нуклеотида с электроактивной меткой с ферментами, используемыми в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Дизайн, синтез и проверка производных нуклеотидов на электрохимическую активность и субстратную совместимость с ДНК-полимеразами – новое современное направление на стыке органической химии, биохимии и аналитической химии (в частности, электрохимии). Данный подход позволил значительно повысить чувствительность и селективность электрохимического определения концентрации нуклеиновых кислот. К сожалению, большинство опубликованных Хочеком и Фойтой работ [96–102] посвящено исследованию электрохимической активности модифицированных нуклеотидов на ртутном или содержащем ртуть электродах, что не имеет каких-либо перспектив практического применения в современном “зеленом” мире. Стоит отметить, что существующее разнообразие конъюгатов нуклеотидов с различными электроактивными группами обеспечивает основу для мультипотенциального кодирования ДНК с перспективой электрохимического определения последовательности нуклеиновых кислот при их секвенировании (рис. 2) [8, 9, 55, 73–103]. Термин “мультипотенциальное кодирование ДНК” означает расшифровку последовательности ДНК на основе введения в нее электроактивных меченых нуклеотидов взамен природных нуклеотидов (вплоть до всех четырех). Каждая электроактивная метка, характеризующаяся потенциалом и интенсивностью пика и соответствующая определенному нуклеиновому основанию, должна обладать ортогональностью и рациометричностью, т.е. давать вольтамперометрический сигнал, не перекрывающийся с сигналами других меток и зависящий от количества нуклеотидов данного вида в цепи. Например, модифицированные нуклеотиды, связанные с различными электроактивными фрагментами, недавно были успешно применены для мультипотенциального кодирования всех четырех оснований ДНК [78, 103]. Кроме того, искусственные электроактивные нуклеотиды используют для регистрации гибридизации ДНК, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, обнаружения повреждения ДНК и определения содержания белков (рис. 3) [8, 9, 55, 73–103]. Другим многообещающим практическим применением модифицированных нуклеотидов является сочетание изотермической амплификации ДНК с электроактивными мечеными нуклеотидами для электрохимической регистрации нарабатываемых ампликонов и обнаружения инфекционных агентов in situ (рис. 3) [89]. Однако, чтобы стать широко применимой для обнаружения нуклеиновых кислот “по месту требования”, данная стратегия должна включать: (1) простую процедуру регистрации сигнала, исключающую использование токсичной ртути или стадию шлифовки поверхности электродов; (2) набор модифицированных нуклеотидов, содержащий основания ДНК или РНК, коньюгированные с электроактивными фрагментами, которые подходят в качестве субстратов полимераз, осуществляющих амплификацию нуклеиновых кислот. В этой связи прямое электрохимическое обнаружение модифицированных молекул нуклеиновых кислот с помощью одноразовых печатных графитовых или золотых электродов может обеспечить технически простой, быстрый и экономичный подход к оценке результатов изотермической амплификации ДНК [88].

 

Рис. 2. Разнообразие электроактивных групп и линкеров в синтетических модифицированных нуклеотидах: ферроцен [74–77, 103–105], антрахинон [83, 91], 4-гидрокси-3-метоксифенил и 2,3-дигидробензофуран-5-ил [84], фенотиазин [85], остатки тирозина и триптофана [88, 89], 3-аминофенил и 3-нитрофенил [87, 106], бензофуразан [98]. Л – линкер, Р – электроактивная функциональная группа.

 

Рис. 3. Основные сферы применения искусственных электроактивных нуклеотидов.

 

Разнообразие нуклеотидов с электроактивными метками

Модифицированные по азотистым основаниям нуклеотиды получают либо классическим трифосфорилированием модифицированных нуклеозидов, либо с помощью простых одностадийных реакций перекрестного связывания галогенированных дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в воде [55, 83]. Напомним, что синтез производных нуклеотидов требует присоединения новой группы к остатку азотистого основания либо непосредственно, либо через линкер в положении С5 цитозина и урацила, либо в положении С7 7-дезазааденина и 7-дезагуанина (рис. 1) [73, 74, 76–78, 83–85, 87, 92, 98, 104]. Это делает производные дАТФ и дГТФ более отдаленными аналогами природных нуклеотидов, чем конъюгаты дЦТФ и дУТФ (дТТФ) [92]. C5-замещенные пиримидиновые и C7-замещенные 7-деазапуриновые дНТФ обычно являются хорошими субстратами ДНК-полимераз, тогда как C8-замещенные пуриновые дНТФ – плохими [55, 83]. Также известно, что ацетиленовый спейсер между объемным ароматическим заместителем и азотистым основанием улучшает субстратные свойства модифицированных дНТФ [83].

Палитра модифицированных нуклеотидов с электроактивными метками насчитывает несколько десятков соединений – производных всех видов природных нуклеотидов: дГТФ, дАТФ, дТТФ (дУТФ) и дЦТФ. Электроактивными группами в таких искусственных нуклеотидах выступают: цианиновые красители Cy3 и Cy5 [63–66], метиленовый синий [73], TEMPO [94], нильский синий [95], ферроцен [73–78, 103–109], антрахинон [73, 83, 91, 94, 106, 107], остатки тирозина и триптофана [88, 89], 5-(4-азидофенил) [97], бензофуразан [98], аминофенил и нитрофенил [82, 87, 110], фенотиазин [73, 85], 4-гидрокси-3-метоксифенил и 2,3-дигидробензофуран-5-ил [84], карборан или металлакарборан [78], флуоресцеин и родамин [90]. Примеры структур электроактивных остатков модифицированных нуклеотидов в сочетании с линкерами приведены на рис. 2. Электрохимическое поведение искусственных меченых нуклеотидов изучают различными методами, как правило, включающими циклическую вольтамперометрию в комбинации с квадратно-волновой или дифференциальной импульсной вольтамперометрией. Необходимо отметить, что многие красители обладают электрохимической активностью и могут выступать как в роли флуоресцентных, так и электроактивных меток [90, 111]. В пионерских работах электроактивные нуклеотиды ДНК и РНК названы “электротидами” (от англ. electrotide) [106, 107]. Остаток гуанина или 7-дезазагуанина может выступать в качестве самостоятельной электроактивной метки в онДНК из-за природной электроактивности гуанина [78, 83, 96, 103, 104]. Если нуклеотиды, меченные флуоресцентными метками, такими как флуоресцеин, родамин, Cy3, Cy5, коммерчески доступны, то большинство нуклеотидов с электроактивными метками синтезированы только в рамках конкретных научных проектов. В большинстве работ в качестве меток нуклеотидов выступают функциональные группы с заведомо известными электрохимическими свойствами [112]. Так, электрохимическое окисление фенольных и индольных соединений достаточно подробно изучено [113–115]. Тем не менее на электрохимическое поведение меток в составе коньюгатов с нуклеотидами влияют природа нуклеотида и условия проведения измерений (состав фонового электролита, рН среды, материал электрода). Нуклеотиды дАМФ, дЦМФ, дАТФ и дЦТФ, меченные 4-гидрокси-3-метоксифенилом, демонстрируют первый пик окисления при 0.3–0.5 В [84]. Коньюгаты дАМФ и дЦМФ с фенотиазином окисляются при потенциале около 0.6 В [85]. Сигналы окисления дАМФ, дЦМФ, модифицированных 2,3-дигидробензофураном, находятся в диапазоне 0.8–1.1 В (электрод из пиролитического графита, ацетатный буферный раствор, рН 5.0) [84]. Производные дУТФ, модифицированные остатками тирозина или триптофана, дают четкие пики окисления при 0.5–0.7 В (печатный графитовый электрод, фосфатный или Трис-буферный раствор, нейтральная среда) [88, 89]. Нуклеотиды дАТФ и дЦТФ, модифицированные по азотистым основаниям окислительно-восстановительными группами, такими как ферроцен и его производные (с обратимым сигналом в диапазоне 0.05–0.5 В) [75] или антрахинон (с парой обратимых пиков при потенциале около –0.4 В) [83] продемонстрировали электроактивность при более низких значениях потенциала. Ферментативное кодирование нуклеиновых кислот требует набора нуклеотидов, конъюгированных с электроактивными группами, имеющими различные окислительно-восстановительные потенциалы, так что каждая из них может быть считана в присутствии других, давая отчетливый сигнал [85].

Среди электроактивных фрагментов, способных восстанавливаться на поверхности электродов при относительно низких отрицательных потенциалах, наибольше распространение получила ароматическая нитрогруппа [82, 87, 110]. Ароматическая нитрогруппа рассматривается как перспективная метка в стратегии мультипотенциального вольтамперометрического кодирования ДНК [82, 83, 87, 91]. Классическая схема восстановления ароматической нитрогруппы на ртутном электроде в кислой среде дана в обзоре 1978 г. [116]. Позднее механизм электровосстановления нитрогруппы был предметом детального исследования в работах Зумана и Лавирона [117, 118]. Интересно, что ароматическое нитросоединение нитробензол было первой органической молекулой, изученной методом полярографии еще в 1925 г. [119]. Восстановление ароматической нитрогруппы дает на вольтамперограмме необратимый пик при потенциалах примерно от –0.35 до –0.65 В и пару пиков –NHOH/–NO при потенциале около 0 В, появляющуюся в результате окисления –NHOH и дальнейшего восстановления –NO [82, 83, 87, 92, 98, 102]. Следует отметить, что для наблюдения окислительно-восстановительной пары –NHOH/–NO на циклических вольтамперограммах требуются два последовательных скана [86, 91]. Обычно токи пиков окислительно-восстановительной пары –NHOH/–NO значительно ниже значения тока пика восстановления самой ароматической нитрогруппы. На ртутном электроде для олигонуклеотида, меченного 3-нитрофенильной группой, получен симметричный пик восстановления при –0.5 В, в то время как его отклик на электроде из пиролитического графита довольно слабый [87], что, скорее всего, вызвано разной степенью адсорбции анализируемого олигонуклеотида на ртути и углероде. К сожалению, в настоящее время отсутствуют публикации, в которых был бы досконально изучен механизм восстановления нитрофенильной группы на электродах из углеродных материалов. Синтезирован полный набор нуклеотидов, модифицированных нитрофенильной группой; нитропроизводные дГТФ, дАТФ, дЦТФ или дУТФ успешно включены в цепи ДНК посредством различных ферментативных реакций как по отдельности, так и в смеси с другими модифицированными нуклеотидами [82, 83, 86, 87, 91, 110]. В дополнение к нуклеотидам, меченным одной электроактивной группой, ароматическая нитрогруппа использовалась в составе полифункциональных фрагментов, в частности в нуклеотидах, меченных 2,4-динитрофенилгидразоном, нитробензофуразаном [92] или N-метил-4-гидразино-7-нитробензофуразаном [102].

Следует отметить, что наблюдаемые различия в значениях потенциалов пиков модифицированных нуклеотидов обусловлены не только природой электроактивного фрагмента, но и различием в длине и структуре спейсера, с помощью которого электроактивная группа конъюгирована с азотистым основанием нуклеотида. В частности, данный эффект наблюдали для дУТФ, модифицированных ароматическими группами тирозина, триптофана [88, 89], или ферроцена [106, 108]. Значения токов и потенциалов пиков окисления или восстановления модифицированных нуклеотидов сильно зависят от параметров регистрации вольтамперограмм, например скорости развертки потенциала, а также от общих условий эксперимента – материала электрода, состава фонового электролита, рН среды. В зависимости от условий эксперимента различные дезоксинуклеозидтрифосфаты, меченные нитрофенильной группой (в основном производные дАТФ и дЦТФ), генерировали пики восстановления ароматической нитрогруппы при потенциалах: от –0.5 до –0.65 В (ацетатный буферный раствор, рН 5.0 и Трис-буферный раствор, рН 7.3) на электроде из пиролитического графита [82, 87]; около –0.35 или –0.5 В (ацетатный буферный раствор, рН 5.0) [87, 92] и около –0.45 В (формиат аммония + фосфат натрия, рН 6.9) [91] на ртутном электроде; около –0.6 В (ацетатный буферный раствор, рН 5.0) на алмазном электроде, допированном бором [86]. Кроме того, показано, что значения токов и потенциалов регистрируемых пиков (восстановления или окисления) меченых дНТФ сильно зависят от типа модифицированного азотистого основания [75, 82, 86, 87, 91, 92]. Например, значения потенциалов пиков восстановления дНТФ, меченных 3-нитрофенилом, увеличиваются в ряду дГТФ < дЦТФ < дАТФ < дУТФ (дТТФ), что указывает на наиболее трудное восстановление ароматической нитрогруппы в дУТФ (при –0.665 В, электрод из пиролитического графита, Трис-буферный раствор, рН 7.3) [82, 87].

Основной задачей многих экспериментальных работ стало получение новых модифицированных нуклеотидов и изучение их электрохимических свойств с целью выбора метки, способной окисляться или восстанавливаться при наиболее низких положительных или отрицательных потенциалах с высокой аналитической чувствительностью для последующего определения концентрации ДНК или регистрации нуклеотидных замен и мутаций [74, 76, 77, 78, 103]. При этом сигнал введенной метки может накладываться на сигналы остатков Г и/или А в ДНК-олигонуклеотидах, чего лучше избегать. Кроме того, желательно, чтобы встроенная метка давала только один четкий пик окисления или восстановления без каскада электрохимических превращений. При выборе метки немаловажное значение имеет, обладает ли новая группа интеркалирующим эффектом в ДНК. Например, остатки тирозина и триптофана не включены в список интеркаляторов ДНК, в отличие от метиленового синего [73] или комплексов катионов металлов с полициклическими ароматическими лигандами [79]. На практике выбор четырех элетроактивных групп, дающих при совместном присутствии раздельные сигналы на вольтамперограмме, является непростой задачей. Одновременно проводят биохимические исследования с целью выяснить, насколько хорошим субстратом ДНК- или РНК-полимераз является искусственный нуклеотид по сравнению с природным, включая его в различные реакции амплификации.

На сегодняшний день широкое распространение получили нуклеотиды, меченные ферроценом и его производными (рис. 3) [74–78, 103–109, 120]. Заместители в молекуле ферроцена сильно влияют на потенциалы окисления модифицированных нуклеотидов [121]. Коньюгаты с ферроценом получены для всех дНТФ, а ферроценовые производные дАТФ и дЦТФ стали коммерчески доступными через Jena Bioscience (https://www.jenabioscience.com) [76]. Это достижение стало результатом многолетних совместных исследований ученых из разных стран. Например, сконструированы и синтезированы три 7-дезазаадениновых и цитозиновых нуклеозидтрифосфата, содержащих незамещенный ферроцен, октаметилферроцен или ферроценкарбоксамид, связанные алкиновым линкером в положении С7 или С5 соответственно (рис. 4) [75]. Электрохимическое поведение модифицированных ферроценом нуклеотидов изучали с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии на электроде из пиролитического графита (ацетатный буферный раствор, рН 5.0). Производные дНТФ, коньюгированных с разными производными ферроцена, продемонстрировали вольтамперометрические пики, соответствующие обратимому одноэлектронному окислению фрагмента ферроцена [75]. В случае коньюгатов ферроцена с 7-дезазааденином наблюдали дополнительный пик необратимого окисления пирролопиримидиновой группы при 1.03–1.10 В (отн. Ag/AgCl). Обогащенный электронами октаметилферроцен окисляется при потенциале, примерно на 300 мВ более низком, чем потенциал окисления незамещенного ферроцена. Данная модификация молекулы ферроцена облегчает его окисление, однако ведет к нестабильности меток на воздухе. С другой стороны, обедненные электронами связанные амидной связью производные ферроцена дают сигнал окисления, смещенный примерно на 100 мВ к более высоким значениям. Нуклеотиды, содержащие октаметилферроцен, демонстрируют дополнительный необратимый пик при 1.20 В [75]. Поскольку меченные октаметилферроценом нуклеотиды и олигонуклеотиды склонны к окислению на воздухе, дальнейшие исследования проводили только на стабильных производных, содержащих незамещенный ферроцен и карбоксамидоферроцен [75]. Коньюгация нуклеотида с электроактивными функциональными группами может приводить как к смещению потенциала окисления или восстановления метки по сравнению с ее свободной формой, так и не менять его. Так, свободный ферроцен дает хорошо выраженный пик, благодаря обратимому одноэлектронному окислительно-восстановительному процессу Fe(II)/Fe(III) при 0.245 В (электрод из пиролитического графита, Трис-буферный раствор, рН 7.3) [104]. Аналогичные обратимые электрохимические сигналы наблюдали для несущих ферроценовые метки на ацетиленовых линкерах дУТФ и дАТФ: потенциалы их окисления заметно смещены (на 105 мВ и 155 мВ соответственно) по сравнению со свободным ферроценом. Электроноакцепторные эффекты электронного сопряжения ароматических нуклеиновых оснований и меток затрудняют окисление комплексов металлов по сравнению с несвязанными комплексами (в данном случае ферроцена), что приводит к положительным сдвигам окислительно-восстановительных потенциалов. Влияние 7-дезазааденина на окислительно-восстановительный потенциал фероценовой метки более значимо, чем влияние урацилового остатка. Результирующая разница в потенциалах пиков окисления модифицированных ферроценом нуклеотидов (около 50 мВ) достаточна для обеспечения дифференциации между конъюгатами дУТФ и дАТФ [104]. На примере нуклеотидов дУТФ, меченных ферроценом, также прослеживается зависимость окислительно-восстановительных потенциалов пары пиков Fe(II)/Fe(III) от длины линкера, связывающего метку и нуклеотид [106, 108]. Так, два меченных ферроценом аналога дТТФ, 5-(3-ферроценкарбоксамидопропенил-1) дУТФ (дУТФ-Fc1) и 5-(3-ферроценацетамидопропенил-1) дУТФ (дУТФ-Fc2) (рис. 4), на циклических вольтамперограммах показали обратимое окислительно-восстановительное поведение ферроценильных фрагментов в Трис-ацетатном буферном растворе со значениями E_1/2, равными 398 и 260 мВ соответственно (отн. Ag/AgCl, рН 7.4) [108]. На циклической вольтамперограмме интервал между потенциалами пиков окисления и восстановления дУТФ-Fc1 составил 60 мВ, что соответствует обратимой окислительно-восстановительной реакции ферроценильного фрагмента в данной буферной системе. Окислительно-восстановительный потенциал дУТФ-Fc1 на 90 мВ превышает потенциал ферроценкарбоксилата (310 мВ, отн. Ag/AgCl), измеренный в том же буферном растворе, что отражает замену заместителя пентадиенильного кольца на более электроноакцепторный (–COO^– на –CONHR) [108].

 

Рис. 4. Ферроцен и его производные в качестве электроактивных меток нуклеотидов: ферроценкарбоксамид (1), незамещенный ферроцен (2), октаметилферроцен (3), ферроценвинил (4), 5-(3-ферроценкарбоксамидопропенил-1) (5) и 5-(3-ферроценацетамидопропенил-1) (6), связанные линкером с атомом углерода С7 или С5 пуринового или пиримидинового азотистого основания нуклеотида (ДНК или РНК) соответственно [74–78, 103–109, 120]. Для модифицированных дУТФ от (1) к (3) [75], от (4) к (5) [106] и от (6) к (5) [108] значения потенциалов пиков окисления возрастают.

 

Первоначально метод ферментативного введения электроактивных меток в нуклеиновые кислоты был сосредоточен на мультипотенциальном кодировании ДНК путем объединения нескольких ортогональных (дискретных) функциональных групп для разработки методов электрохимического определения оснований при секвенировании нуклеиновых кислот [8, 78, 82, 83, 85, 87, 91, 98, 103]. Идея использования электроактивных меток для мультипотенциального кодирования требовала мечения всех четырех нуклеотидных оснований в качестве альтернативы многоцветному флуоресцентному методу. В этом ключе большие надежды возлагались на ароматическую нитрогруппу, дающую четкий пик восстановления, в сочетании с другими метками, способными окисляться на поверхности электрода [82, 91]. Другой подход – гибридизация иммобилизованного ДНК-праймера с исследуемой последовательностью, а затем ферментативное удлинение с помощью реакции удлинения праймера (англ. primer extension reaction, PEX) [78, 103]. Однако из-за довольно узких рабочих окон потенциалов (отличающихся на разных электродах), применимых для анализа ДНК, и трудностей в разработке и синтезе ортогональных и рациометрических электроактивных меток этот подход долгое время оставался нереализованным. Только недавно разработана и опубликована комбинация из четырех окисляемых меток (дикарбанидоундекаборат ([C₂B₉H₁₁]^–); [3,3-железо-бис(1,2-дикарболлид)]– ([Fe(C₂B₉H₁₁)₂]^2–); 7-ферроценилэтинил и 7-деазагуанин), которые могут быть присоединены к четырем нуклеотидам, ферментативно включаемым ДНК-полимеразой в олигонуклеотидные цепи, содержащие до 16 модифицированных нуклеотидов подряд [78]. Благодаря уникальным окислительно-восстановительным потенциалам, данные метки можно одновременно и рациометрически обнаруживать с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии на стеклоуглеродных электродах [78]. Это первая демонстрация концепции мультипотенциального кодирования оснований ДНК, которая позволила определить относительное содержание (соотношение) всех четырех нуклеотидных оснований в неизвестной последовательности ДНК, но количественная оценка общего количества нуклеотидов каждого вида оставалась нерешенной задачей. В работе [103] этот вопрос был рассмотрен путем сравнения двух вариантов количественной оценки числа нуклеотидов: (1) использования внутреннего стандарта в праймере (7-дезаза-2›-дезоксигуанозина в ДНК-праймере) и (2) использования пятой электроактивной метки (модифицированного виологеном праймера), которое облегчает получение реперного аналитического сигнала, позволяющего определить точное количество каждой метки и, следовательно, каждого нуклеотидного основания, присутствующего в определенной последовательности ДНК. Эта пятая ортогональная электроактивная метка выступала в качестве точки отсчета для нормализации сигнала, что позволило провести точный электрохимический анализ последовательности за одно считывание. Оба способа были протестированы с применением различных последовательностей ДНК, и полученные вольтамперометрические сигналы нормализованы с использованием либо внутреннего стандарта (7-дезаза-2'-дезоксигуанозина), либо пятой метки (виологена). Было продемонстрировано полное соответствие фактическому составу нуклеотидов, что открывает перспективы для целенаправленного анализа последовательности ДНК [103].

Амплификация нуклеиновых кислот с участием электроактивных меченых нуклеотидов

Амплификация нуклеиновых кислот с участием искусственных модифицированных нуклеотидов была впервые использована для синтеза функциональных нуклеиновых кислот, аптамеров и сомамеров, обладающих сродством к различным лигандам, а также флуоресцентных меченых олигонуклеотидов как альтернатива классическим методам синтеза [55]. Классическими способами получения модифицированных нуклеиновых кислот являются твердофазный синтез олигонуклеотидов с использованием фосфоамидитов функционализированных нуклеозидов и постсинтетическая модификация олигонуклеотидов [55]. Твердофазный химический синтез модифицированных олигонуклеотидов с использованием фосфоамидитов нуклеозидов, коньюгированных с дополнительными функциональными группами, часто проблематичен из-за их несовместимости с условиями определенных стадий синтеза (кислотного детритилирования, конденсации, кэпирования, окисления и удаления ацильных защитных групп с отщеплением синтезированных олигонуклеотидов от твердофазного носителя обработкой аммиаком на финальной постсинтетической стадии), необходимости использования дополнительных защитных групп и иногда низкого выхода на стадии конденсации. С другой стороны, постсинтетическая модификация олигонуклеотидов требует селективных и мягких реакций и в большинстве случаев используется только для дальнейших преобразований функциональных групп уже модифицированных олигонуклеотидов. Помимо химического синтеза, модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть получены ферментативным путем посредством включения модифицированных нуклеозидтрифосфатов ДНК- или РНК-полимеразами [55]. Детальный экскурс в историю ферментативного синтеза функциональных нуклеиновых кислот дан в обзорах Хочека и Фойты [8, 55]. Первая работа по полимеразному включению функционализированного по азотистому основанию нуклеотида в цепь ДНК была опубликована в 1981 г. [122]: был получен дУТФ, биотинилированный в положении С5, и обнаружено, что он является субстратом для нескольких ДНК-полимераз. Позже нуклеотид дУТФ, меченный красителем FluoroRed, и нуклеотид дЦТФ, меченный родамином 110, применили для флуоресцентного мечения ДНК путем удлинения праймера с использованием экзополимеразы Klenow [123]. Далее получили дУТФ, меченные красителем TAMRA, где флуоресцентная метка прикреплена к нуклеотиду с помощью ацетиленового линкера к положению С5 урацила [124]. Затем данные модифицированные нуклеотиды были включены полимеразой TaqFS путем удлинения праймера с получением флуоресцентных конъюгатов ДНК. Саваи и др. [125] синтезировали модифицированные дУТФ, содержащие аминокислотные остатки в положении С5, и исследовали их субстратные свойства относительно ДНК-полимеразы KOD Dash в ходе ПЦР. ПЦР с внесением C5-модифицированного дУТФ, имеющего аминоацильную группу (аргинил, гистидил, лизил, фенилаланил, триптофанил, лейцил, пролил, глутаминил, серил, О-бензилсерил или треонил), дала соответствующие полноразмерные продукты ПЦР с хорошим выходом. Хотя было обнаружено, что аналоги дУТФ, содержащие аспартил, глутамил или цистеинил, являются плохими субстратами для ДНК-полимеразы KOD Dash, оптимизация условий ПЦР привела к получению значимого количества полноразмерных продуктов. В случае реакции с использованием аналога дУТФ, имеющего цистеинильную группу, добавление восстановителя улучшало выход реакции [125]. Позже были получены несколько типов нуклеотидов, модифицированных ферроценом, привлекательных для электрохимического обнаружения, которые были включены в последовательность ДНК и использованы для решения различных биоаналитических задач [74–78, 103–106, 108, 109]. Возникает закономерный вопрос о совместимости модифицированных нуклеотидов с существующими классами различных ДНК-полимераз. К сожалению, из опубликованных исследований нельзя сделать однозначный вывод об универсальной ДНК-полимеразе. Саваи и др. [126, 127], исследуя эффективность различных ДНК-полимераз относительно включения С5-замещенных пиримидиновых дНТФ, подтвердили, что полимеразы семейства В (KOD Dash, Pwo и Vent), как правило, более эффективны, чем полимеразы семейства А. Однако для каждого нового модифицированного нуклеотида необходим скрининг нескольких полимераз, чтобы найти наиболее эффективную для конкретного нуклеотида. Совместимость искусственных электроактивных нуклеотидов с рядом ДНК-полимераз проанализирована в обзоре [55]. Из-за широкого структурного разнообразия и целого спектра биологических функций конструирование модифицированных молекул РНК даже более привлекательно, чем модификация ДНК. Нуклеозидтрифосфаты (НТФ), функционализированные по основанию, также были получены и успешно включены в цепь РНК с помощью соответствующих полимераз [55]. Биотинилированный УТФ был первым примером модифицированного НТФ, инкорпорированного РНК-полимеразой T7 [122]. Коньюгаты УТФ с ферроценом или антрахиноном были успешно встроены в цепь РНК с помощью T7 и SP6 РНК-полимераз [107].

В целом модифицированные нуклеотиды с электроактивными метками хорошо работают в формате PEX [82, 83, 87, 92, 98, 102, 106, 108] или присоединяются к 3’-концу ДНК-олигонуклеотида терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (англ. terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) [85, 87]. В то же время искусственные модифицированные нуклеотиды во многих случаях препятствуют амплификации днДНК (вплоть до полной остановки реакции) за некоторыми исключениями [74, 76, 84, 85, 88, 89, 97, 108, 109, 110, 125]. Предположительно, это связано с тем, что в ходе амплификации полимераза должна “считывать” модифицированную цепь ДНК, служащую матрицей. В целом скорость реакции амплификации снижается в присутствии искусственных модифицированных нуклеотидов [64, 74, 76, 83, 85, 97, 108]. Например, увеличение концентрации флуоресцентных меченых дУТФ-Cy5 в реакционной смеси выше уровня 8% (вместо природного дТТФ) значительно снижало выход продукта ПЦР как для Taq, так и для Vent (exo-) ДНК-полимераз; оптимальный процент замещения составил 3–5% в зависимости от типа модифицированного нуклеотида и полимеразы [64]. Помимо этого, как показал собственный опыт авторов данного обзора, включение модифицированных нуклеотидов в цепь днДНК требует высокой активности фермента. Даже небольшое снижение активности фермента приводит к падению уровня встраивания модифицированных нуклеотидов в днДНК и, вероятно, служит причиной образования укороченных продуктов [110]. Интересно, что для встраивания искусственных нуклеотидов имеет значение соотношение концентраций всех нуклеотидов в реакционной смеси. Так, увеличение концентрации модифицированного антрахиноном дНТФ в десять раз по сравнению с природным дНТФ приводило к ингибированию реакции PEX [83].

Изучено влияние структуры модифицированных нуклеотидов на совместимость с различными полимеразами в реакциях амплификации. Так, на примере дУТФ, меченных красителем Cy5, показано, что в ПЦР наиболее эффективный субстрат для полимераз Taq и Vent (exo-) характеризуется электронейтральностью флуорофора и средней или большой длиной связующих звеньев между репортерной группой и пиримидиновым основанием [64]. Нуклеотиды дУТФ, меченные электронейтральными цвиттер-ионными аналогами флуорофоров Cy3 или Cy5, вступали в ПЦР, катализируемую Taq-полимеразой, примерно на порядок эффективнее, чем дУТФ, меченные отрицательно заряженными аналогами цианиновых красителей [65]. Введение взаимокомпенсирующих зарядов во флуорофоры или другие функциональные группы, сопряженные с нуклеотидами, можно рассматривать как основу для создания ПЦР-совместимых модифицированных нуклеотидов [65]. Эффективность флуоресцентного мечения ДНК Taq-полимеразой в ПЦР при введении дУТФ, модифицированных аналогами красителя Cy5 (2–10% замещения дТТФ в реакционной смеси), распознавание образования дуплексов ДНК зависят также от относительной ориентации красителя и линкера между красителем и пиримидиновым основанием, а также от присутствия гидрофильных групп в красителе [128]. Аналогично в реакциях PEX два дУТФ, меченных ферроценом и отличающихся друг от друга лишь длиной линкера, связывающего метку с нуклеотидом, показали разную совместимость с ферментами [108]. Тем не менее в недавних публикациях PEX и изотермическую амплификацию ДНК с модифицированными ферроценом нуклеотидами использовали для разработки диагностических платформ для выявления однонуклеотидного полиморфизма, основанных на электрохимическом детектировании сигнала меченых нуклеотидов [66, 73].

Введение в реакцию амплификации синтетических модифицированных нуклеотидов вносит в ее течение свои особенности. Показано, что присутствие модифицированного нуклеотида в реакционной смеси для амплификации обычно приводит к более низкому выходу продуктов или даже полному ингибированию реакции амплификации [8, 74, 76, 85, 90, 97, 107, 108]. Следовательно, общий выход встроенных меток, который обычно определяет чувствительность электрохимического детектирования, становится компромиссом между уровнем мечения отдельного ампликона и выходом меченых ампликонов в реакции амплификации [74, 76, 85, 90, 97, 107]. Например, модифицированный флуоресцеином или родамином дУТФ продемонстрировал значительное снижение выхода реакций амплификации ПЦР и изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА, англ. recombinase polymerase amplification, RPA) с увеличением доли нуклеотида в реакционной смеси относительно природного дТТФ при повышении уровня мечения ампликонов [90]. Другим примером включения модифицированных нуклеотидов в ПЦР является использование 5-(4-азидофенил)-2′-дезоксицитидин-5′-трифосфатов (дЦТФ-АЗФ), где ампликоны днДНК ожидаемого размера получены при 10–80%-ной замене дЦТФ на дЦТФ-АЗФ, в то время как при 100%-ной замене дЦТФ на дЦТФ-АЗФ полноразмерных продуктов ПЦР не наблюдалось [99]. Практически неизмененный выход ампликонов зарегистрирован вплоть до 60%-ного замещения дЦТФ на дЦТФ-АЗФ, в то время как для 80%-ной замены наблюдалось заметное снижение интенсивности полосы ампликонов на гель-электрофореграмме [97]. Ранее показано, что заметный выход продукта ПЦР может наблюдаться только при 50%-ной замене дАТФ на связанный с фенотиазином дАТФ [85]. При включении в ПРЦ дУТФ, меченных ферроценом, на гель-электрофореграмме наблюдали выход полноразмерных продуктов (длиной 998 п.о.) при 25–75%-ном замещении дТТФ на дУТФ-Fc [108].

Сегодня сформировался запрос на вывод ДНК-диагностики за стены специализированных лабораторий и проведения тестирования “на месте оказания медицинской помощи” и “в полевых условиях” в медицине, экологии и сельском хозяйстве [4, 129]. В рамках этой тенденции использование изотермической амплификации ДНК рассматривается как привлекательный подход к обнаружению инфекционных агентов in situ, благодаря постоянной температуре реакции, которая снижает сложность требуемого оборудования, обеспечивая при этом время и чувствительность тестирования, сравнимые с таковыми при ПЦР [2, 130–134]. Изотермическая амплификация может быть интегрирована в различные биосенсорные системы, в том числе основанные на электрохимической регистрации результата реакции [6, 7, 129]. Помимо этого, появляются новые задачи для классических методов амплификации, таких как ПЦР. Так, производные дУТФ, меченные аналогом Cy5, использовали в реакции ПЦР для идентификации циркулирующих в России вариантов коронавируса SARS-CoV-2 с помощью системы ПЦР в реальном времени, основанной на праймерах, специфичных к консервативному генетическому локусу, фрагменту (при 2%-ном замещении природных дТТФ) [135]. Выбор консервативного участка E-гена, кодирующего малый трансмембранный белок E, в качестве мишени для обратной транскрипции с последующей амплификацией позволил выявлять коронавирус независимо от его подтипов, характеризующихся антигенной гетерогенностью в N- и S-белках [135]. Комбинация электроактивных меченых нуклеотидов с изотермической амплификацией ДНК и последующим прямым электрохимическим детектированием модифицированных ампликонов днДНК перспективна для обнаружения патогенных микроорганизмов или вирусов в “полевых условиях” с использованием портативных и технически простых электрохимических устройств (рис. 5). Предпринято несколько попыток включить модифицированные нуклеотиды с электроактивными метками в ампликоны ДНК с помощью методов изотермической амплификации, таких как РПА [76, 89] и амплификации с использованием полимеразы и никирующего фермента (nicking enzyme amplification reaction, NEAR, в результате которой генерируются многочисленные короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, копирующие матричную последовательность) [85, 136]. Следует отметить, что в NEAR фрагменты онДНК синтезируются на немодифицированной матрице, в то время как в РПА, аналогично ПЦР, требуется полимераза для “считывания” модифицированной цепи ДНК [76, 85, 89, 134]. На практике ферменты, используемые в РПА, более “капризны” по отношению к искусственным нуклеотидам по сравнению с ферментами, используемыми в ПЦР [89, 90]. Так, производные дУТФ, меченные остатками тирозина, были успешно включены в ампликоны днДНК с помощью РПА при 100%-ной замене дТТФ [89]. В другом случае при 100%-ной замене немодифицированного нуклеотида на модифицированный ферроценом на гель-электрофореграмме не наблюдалось образования полноразмерных ампликонов [76]. Предположительно, существует зависимость скорости и выхода реакций амплификации ДНК в присутствии искусственных модифицированных нуклеотидов от последовательности образующегося ампликона. Флуоресцентно меченные дУТФ и дЦТФ, содержащие цвиттер-ионный индодикарбоцианиновый краситель, аналог Cy5, показали хорошую совместимость с РПА, дав полноразмерные целевые продукты фрагмента гена ebpS возбудителя бактериальной пневмонии (Staphylococcus aureus) с высокой плотностью флуоресцентной метки (при 4%-ном замещении соответствующих природных нуклеотидов в реакционной смеси) [137]. Кроме того, электроактивные модифицированные нуклеотиды использовали для детектирования белков (например, белка р53) [100], создания геносенсоров [74] и выявления однонуклеотидных полиморфизмов [73, 76, 77, 106], ассоциированных с различными заболеваниями (рис. 3).

 

Рис. 5. Объединение реакции изотермической амплификации с внесением модифицированных нуклеотидов и вольтамперометрической регистрации выхода – путь к определению вирусного или бактериального заражения in situ.

 

***

Обнаружение и идентификация нуклеиновых кислот – одно из центральных направлений современной биологической химии. Ферменты, модифицирующие нуклеиновые кислоты, такие как полимеразы, лигазы и нуклеазы, используемые в генотипировании, пока не нашли широкого применения в электрохимических методах анализа. Таким образом, необходимо прилагать дополнительные усилия для более тесной интеграции электрохимии и молекулярной биологии. Электрохимические методы, обладая высокой чувствительностью, низкими затратами на оборудование, возможностью миниатюризации и прямым электронным считыванием, являются привлекательной альтернативой общепринятым методам обнаружения нуклеиновых кислот, основанным на колориметрии или турбидиметрии. Хотя регистрация сигнала электроактивных нуклеиновых кислот может быть достигнута с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза в сочетании с электрохимическим детектором, эти методы не подходят для миниатюризации анализа. Из известных электрохимических подходов маркировка электроактивными фрагментами обладает совокупными преимуществами: положительным сигналом обнаружения, низким фоном и возможностью введения нескольких электрохимически различимых меток. Современное развитие ДНК-технологий открывает все новые области применения синтетических модифицированных нуклеотидов, несущих электроактивные фрагменты, включая разработку портативных анализаторов для обнаружения патогенных микроорганизмов и вирусов in situ, электрохимических подходов к генотипированию, систем для анализа экспрессии генов, секвенирования нуклеиновых кислот, методов определения гибридизации и повреждения нуклеиновых кислот, а также регистрации взаимодействий ДНК–белок. Разработка, синтез и проверка производных нуклеотидов на электрохимическую активность и в качестве субстратов ДНК- и РНК-полимераз – новое направление на стыке органической, биологической и аналитической химии.

Финансирование работы

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 19-14-00247, https://rscf.ru/project/19-14-00247/

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Е. V. Suprun

Moscow State University; Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Author for correspondence.
Email: lenasuprun@mail.ru

химический факультет

Russian Federation, 119991, Moscow; 119121, Moscow

S. A. Khmeleva

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Email: lenasuprun@mail.ru
Russian Federation, 119121, Moscow

K. G. Ptitsyn

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Email: lenasuprun@mail.ru
Russian Federation, 119121, Moscow

L. K. Kurbatov

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Email: lenasuprun@mail.ru
Russian Federation, 119121, Moscow

S. P. Radko

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Email: lenasuprun@mail.ru
Russian Federation, 119121, Moscow

References

Supplementary files