Systematization of the gas-chromatographic parameters of trimethylsilyl derivatives of amino acids

Full Text

С момента появления инструментальных хроматографических методов разде ле ния аминокислоты (АК) остаются одним из важнейших объектов анализа. Им по свя щено настолько большое число публикаций, что целесообразно указать лишь неко то рые из них [1–3]. Это обусловлено как значением таких аналитов в биохи мии [4], так и осо бенностями подготовки проб. Для определения аминокислот в составе белков не обхо димой стадией является предварительный гидролиз полипептидов. По скольку сво бодные ами но кислоты в нейтральных средах пред ставляют собой цвит тер-ионы (H₃N⁺–CHR–CO₂^-), то как в га зо вой, так и в высоко эф фектив ной жид костной хро ма тогра фии (ВЭЖХ) требуется по луче ние их произ водных для хрома тографического разделения (дериватизация), желательно по всем входящим в сос тав молекул ами но-, карбоксильным и иным группам [5–8].

Число различных реагентов, предложенных для дериватизации АК с целью их газохроматографического разделения, по-видимому, превышает их число для сое динений других классов [2, 4–6]. Более того, как отмечено в “Энциклопедии хрома то графии” [5, 6], их количество постоянно увеличивается. Опять-таки, не претен дуя на полноту цитирования, в качестве одного из последних примеров можно при вес ти такую рекомен да цию, как селективное N-силилирование эфиров аминокислот три метилхлор сила ном в при сутствии цинковой пыли [9]. Представляет интерес од но временное обра зование алкиловых эфиров по карбоксильным и N-диметилами но метиленовых про извод ных по аминогруппам в результате реакции аминокислот с диалкилацеталями ди ме тилформамида [10]. Заслуживает внимание получение три метилсилильных эфи ров АК по группам –ОН и –СО₂Н одновременно с образо ва ни ем N-перфторациль ных производных [11] в результате обработки гек саметил ди си лазаном в смеси с перфторкарбоновыми кислотами, а также многие другие примеры. Каждый из способов дери вати за ции имеет свои особенности, но такой ва риант, как полу че ние триметил си лильных производных АК, широ ко применяют до настоя ще го времени. Реко мен дуемое для этих целей число реагентов пре вы шает несколько десятков [4–6].

Преимуществом получения триметилсилильных (ТМС) производных является использование одного реагента и протекание реакции в одну стадию в гомогенных средах, причем при со от ветствующем выборе реаген тов их избытки не меша ют регистрации сигналов продуктов. Слабые сигналы молекуляр ных ионов, по крайней мере для производных с небольшим числом ТМС-групп, реги с триру ют ся доста то ч но уве рен но [12]. Однако они обладают важной осо бен но с тью [5, 6], на которую обратили внима ние достаточно давно [13, 14], но на практике учитывают не всегда. Дело в том, что кар б о к сильные группы в сос та ве АК образуют ТМС-эфи ры при действии практически любых силилирующих реа ген тов, что нельзя сказать про ами но группы. В зависи мо с ти от активности реа ген та, типа мат рицы, стабиль но сти производных [15], ус ло вий ре ак ции и хранения проб, а также других факторов, воз мо ж но образова ние как N-мо но-, так и N,N-бис-ТМС-произво д ных с группами –NHSi(CH₃)₃ и –N[Si(CH₃)₃]₂. Это нарушает взаим но од но значное соот ве т ствие (1 ←→ 1) числа ис ходных аналитов и продуктов их дериватизации [5], что может осложнить идентификацию АК в составе сло ж ных образ цов. Для мо но ами но монокарбоновых кислот (даже для простейшей из них – глицина) степень неоп ре деленности равна двум, но в случае ди ами но карбо но вых кислот и кислот, со дер жащих амидные фрагменты (лизин, ас па ра гин, глу та мин), она значи тельно во зра стает. Например, отмечено [5], что ли зин, кроме моно-ТМС-эфира по группе –СО₂Н, теоретически может образовывать восемь раз личных N-ТМС-про из вод ных. Ко не ч но же, не все они образуют ся с равной вероятностью, но это да же усложня ет задачу их идентификации. Так, еще в 1970 г. было установ лено [13], что осно в ными ТМС-производными лизина оказыва ют ся трис- и тетра кис-замещен ные, которые можно различить просто по порядку их га зохромато гра фи ческого элю иро вания. Однако такая информация не устраняет полностью не оп реде лен ность ре зультатов, так как для трис-ТМС-производных лизина существует три стру к турных изомера, а для тетра кис- – два. Такие изомеры неразличимы по масс-спектрам, в от личие от про из водных с разным числом ТМС-фра г ме нтов [12, 16].

Следовательно, при представлении результатов хромато-масс-спектрометри че ской идентификации АК в виде ТМС-производных необходимо учитывать следую щие особенности таких аналитов:

1. Поскольку молекулярные массы ТМС-производных АК определить удается не всегда, то достаточно часто встречается форма записи “название аминокисло ты – ТМС”. Это соответствует уровню так называемой групповой идентифи ка ции (подразумевает указание только химической природы аналита), так как со от ветствует неопреде лен ному числу ТМС-фрагментов в моле ку ле, либо при су т ствию в молекуле их максимально возможного числа. Из много численных примеров такой формы записи результатов можно указать работы [17, 18].
2. Следующий “уровень” уточнения результатов газохроматогра фи че ской иден ти фикации ТМС-производных АК предполагает не установление чис ла ТМС-групп в молекулах, а указание последовательности элюирова ния раз ли ч ных ТМС-производных одних и тех же АК в форме “ТМС № 1”, “ТМС № 2” и т.д. Например, в публикации [19] находим “2-methylaspartic acid TMS № 1” и “2-methylaspartic acid TMS № 2”, причем их индексы удерживания (RI) равны 1556 и 1392 соответственно, т.е. не соответствуют увеличению их номеров. Для ТМС-производных валина № 1 и 2 значе ния RI указаны в правиль ной по сле до вательности (1083 и 1239), но компоненту № 1 кор ректно приписана струк ту ра моно-ТМС эфира, а компоненту № 2 – ошибоч ная стру к тура O,N,N-трис-ТМС-производного, которое не охарактеризовано до настоящего време ни. Для двух ТМС-производ ных глу таминовой кислоты определены правиль ные значе ния RI (1528 и 1627), но для обоих соединений указана одна и та же структура трис-ТМС производного. Перечисление подобных многочисленных несообраз но с тей не следует восприни мать только как критику [20]; это, скорее, иллю ст ра ция объектив ных сложностей иден ти фи кации ТМС-производных соедине ний с не сколькими активными ато мами водорода в составе разных функцио на ль ных групп.
3. Одновременное присутствие среди продуктов дериватизации АК N-моно- и N,N-бис-ТМС-произво д ных АК обус ло влено не прочностью связи N–Si (адди ти в ная оценка ее энергии в схе ме Бен сона 355 кДж/моль превышает аналогич ную оценку энергии связи С–С – 346 кДж/моль [21]), а легкостью гидролиза N-ТМС-производных следами во ды. Сле довательно, N-ТМС-производные (осо бенно N,N-бис-ТМС) отличаются, как правило, плохой со хранностью в про бах. Не ста бильность ТМС-производных АК объясняет низкую воспроизводимость ре зультатов их количественного определения. По классификации, предложенной в ра боте [15], часть АК (очень нестабильные) характеризуется относительными ста н дартными отклонениями площадей пиков на уровне 70–170% (!), тогда как умеренно нестабильные остальные – на уровне 15–50%. Иными словами, для количест вен ных определений лучше выбирать не ТМС-, а другие производные аминокис лот.
4. По указанным причинам при обнаружении в оригинальных работах примеров неконкретного представления данных о ТМС-производных АК при создании ба зы NIST [12], в которой каждому соединению соответствует структурная фо р мула, в окончательную версию базы они попадали только в тех случаях, если по значениям RI их уда валось соотне с ти с ко н кретными структурами.
5. Таким образом, условие однозначности результатов ин ди видуальной иден ти фи кации ТМС-производных АК предполагает исключение ответов с не опреде ленным числом ТМС-групп. Изве с т ны многочис лен ные примеры использова ния именно такой формы представления данных [22–24]. Однако часто это со провождается искусственными огра ни чениями чис ла структур в подобных пе речнях. При мером такого подхода (одна структура некоторого ТМС-производ ного для каж дой аминокислоты) является руководство [18], причем его трудно доступность для Рос сийских читателей делает невозмо ж ным контроль приведенной в нем инфор ма ции. Следовательно, если в образцах обнару живаются другие ТМС-произ во д ные аминокислот, не представленные в списках их про из водных, то это не избежно приводит к отрицательным результатам идентифика ции.

Из перечисленного следует:

– хромато-масс-спектрометрическая идентификация ТМС-производных амино ки с лот без привлечения данных по индексам удержива ния нерациональна, хотя известны при ме ры использования только массовых чисел характерис ти ческих ио нов в масс-спе к т рах при определении ограниченного числа аминокислот [24];

– для эффективного использования информации по индексам удерживания необ хо дима систематизация известных значений RI не только чаще всего определяемых ТМС-производных АК, но и всех теоретически возможных продуктов их дери вати за ции.

Настоящая работа посвящена систематизации индексов удерживания ТМС-про из водных аминокислот на стандартных неполярных полидиметилсилоксановых не подвижных фазах и рассмотрению возможностей их оце нки и контроля с ис по ль зо ванием простейшей аддитивной схемы. Систематизация включает группирование индексов удерживания для производных, содержащих разное число ТМС-групп в молекуле, и их последующую статистическую обработку.

Экспериментальная часть. Выбор исходных данных и их обработка

Значения RI ТМС-производных аминокислот на стандарт ных непо ля р ных по ли диметилсилоксановых неподвижных фазах за имствовали из всех доступных ли те ратурных источников, вклю чая [17, 22, 23, 25] (цитирован ы в нас то ящей работе), а с так же сайта http://webbook.nist.gov (часть данных базы [12]). При отсутствии дан ных для ука зан ных фаз дополнительно при влекали значения на так называе мых semi-standard фазах (содержат 5% фенильных групп).

Стандартная статистическая обработка данных включала вычисление средних арифметических значений и соответствующих стандартных отклонений (в каждом случае указано число из ме рений, N). В интервалы <RI> ± s_RI попадает в сре д нем 68% значений исходных выборок. Такая форма предста в ле ния данных не эквива ле н тна статистической обработ ке в базе [12], в ко то рой сред ние значения RI ха ракте ризуют медианами (m_1/2), а их разброс – медианами аб со лю т ных от кло не ний (MAD) [26, 27]. Следовательно, в интервалы m_1/2 ± MAD попа да ет око ло 50% значений вы борок, а MAD(RI) < s_RI.

Результаты и их обсуждение

Результаты систематизации и статистической обработки индексов удерживания триметилсилильных производных 21 наиболее распрост ра нен ных и, следовательно, наиболее подробно охарактеризованных аминокислот на стандартных непо ля р ных поли ди метил силоксановых неподвижных фазах приведе ны в табл. 1.

Таблица 1. Индексы удерживания различных триметилсилильных производных некоторых аминокислот на стандартных непо ля р ных поли ди метил силоксановых неподвижных фазах (жирным шрифтом выделены данные для чаще всего обнаруживаемых про из водных)

^аПустая графа соответствует невозможности образования производных, прочерк означает, что их существование воз мо ж но, но они не обна ру жены и, следовательно, не охарактеризованы; ^бдля пентакис-ТМС аспарагина, глутамина и лизина данных нет; ^вдля бис-ТМС аспарагина известны два значения RI (1543 и 1589), неудовлетворительно согласующиеся друг с другом; ^гдля тетракис-ТМС-аспарагина несколько известных значений RI соответствуют средней величине 1673 ± 10, что соответ ст ву ет RI трис-ТМС-производного. Только одно значение 1863 может быть приписано тетракис-ТМС-производно му; ^дединственное известное значение RI тетракис-ТМС аспарагиновой кислоты (1541) в пределах погрешности не от ли ча ется от значения RI трис-ТМС-производ но го (1518 ± 26) и, скорее всего, ошибочно; ^едля трис-ТМС лизина известны не совпадающие друг с другом значения RI: 1708 (регистрируется чаще других) и 1847; ^ждва известных значения RI пентакис-ТМС аргинина (1632 и 1640, за пределами таблицы) не отличаются от значения RI тет ракис-ТМС-производного (1632) и, скорее всего, ошибочны, как и величина RI = 1632, которая меньше значения для трис-ТМС-производного (1814).

Для каждой аминокислоты указаны ее молекулярное массовое число, трехбук вен ное обозначение, перечислены группы с активными атомами водорода в молекуле и общее число активных ато мов водорода (n_H). Например, для Ser такая запись име ет вид “(CO₂H)(NH₂)(ОН) – 4”, Asp и Glu – “(CO₂H)(NH₂)(CONH₂) – 5”, а для аспарагино вой и глутаминовой кислот – “(CO₂H)₂(NH₂) – 4”. Значение n_H позво ля ет предста вить себе теоретически возможное число ТМС-производных для каж дой АК. Од на ко в действительности такое соответствие достигается только при небольших зна че ниях n_H. Нап ри мер, образование трис-ТМС-производных моноаминокарбоновых кислот отмечено только для Gly, Ala, Ile, Met, OH-Pro, Phe (n_H = 3). Бис-ТМС-про из водное зафиксировано для Pro (n_H = 2), а тетракис- – для Cys (n_H = 4). Во всех остальных случаях полное замещение всех активных ато мов водорода триметилси лильными фрагментами не всегда реализуется и поэтому для чаще всего обнаруживае мых производных n(ТМС) < n_H.

Особенности индексов удерживания триметилсилильных производных аминокислот. Значения RI в табл. 1 предусмотрены для производных от моно- до те т ракис-ТМС потому что только четыре АК характеризуются значениями n_H > 4: Asn, Gln, Lys и Arg. Однако необходимости увеличивать число граф нет, так как для пента кис-ТМС производных Asp, Gln и Lys данные отсутствуют, а значения RI пента кис-ТМС производного аргинина (1632 и 1640), скорее всего, ошибочны, так как не отлича ются от значения 1632 для тетракис-ТМС-производного (см. обсуждение ниже). Эксперимен таль ное оп ределение числа ТМС-групп в случаях 4 < n(ТМС) ≤ 7 весь ма сложно, так как в масс-спектрах таких поли-ТМС-производ ных сигналы молеку ляр ных ионов прак тически отсутствуют. В каждой графе перед значением RI в ско б ках приведе ны молеку ля р ные массовые числа соответствую щих производных.

Форма представления данных в табл. 1 достаточно компактна, но в то же вре мя позволяет сделать важные выводы о характере образующихся продуктов сили лирования. Жирным шрифтом в таблице выделены данные для чаще всего обнару жи ва е мых производных, так что даже беглый взгляд на таблицу позволяет сразу их выя вить. Вывод о частоте обнаружения немедленно следует на основа нии чи сла усред ня е мых значений индексов (N). Образование бис-ТМС-производных наи более ти пи чно для 12 АК: Gly, Ala, Pro, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Asp, Trh и Trp, трис-ТМС- – для 11: Gly, Ser, Cys, OH-Pro, Asn, Asp, Lys, Gln, Thr, Glu и His. Од но вре ме нным об ра зо ва нием бис- и трис-производных (частоты обнаружения при близи тельно оди на ковы) характеризуются Gly, Thr и Asp. Тетракис-ТМС-производные за фи кси рованы то лько для аспарагина и лизина (n_H = 5); для лизина такие производные от носятся к главным продуктам, что было впервые отмечено еще в 1970 г. [13]. Об ра щает на себя внимание отсутствие преобладающих продуктов дериватизации ар гинина, для которого имеются ограниченные сведения (N = 1–2) об RI моно-, бис-, трис- и тет ра кис-ТМС-про изводных. Сложности образования ТМС-производных аргинина об ус ловлены, по-видимому, его максимальной осно в ностью среди всех аминокислот (рК_а = 13.8 ± 0.1), pI = 10.8 [28]), что связано с на ли чием в молекуле гуанидино во го фрагмента.

Для девяти АК известны значения RI моно-ТМС-производных. В семи случаях (Gly, Ala, Pro, Cys, Ile, Met и Arg) это единичные значения, определенные непосре д с т венно в лабораториях NIST [12]. Их образование возможно только в специаль ных экспериментах без использования избытков силилирующих реагентов. Однако для двух АК мо но-ТМС-производные от носятся к числу часто обнаруживаемых: лейцин (N = 16) и фе нил аланин (N = 13). Раци о на льного объяснения причин такой селекти в ности моно-силили ро вания для Leu и Phe пока нет.

Кроме частот обнаружения в качестве еще одного показателя сложностей или неоднозначностей образования ТМС-производных АК можно выбрать отсутствие для них значений RI в базе NIST. Как отмечено выше, это определяется не от сутст вием литературных данных, а невозможностью их однозначного соотнесения с кон кретными структурами. Так, в базе NIST17 [12] нет сведений о RI любых ТМС-произ во дных OH-Pro, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg и Trp. Однако масс-спектры некоторых из них в базе пред став лены; в таких случа ях вместо от сутствую щих эксперимен таль ных значений RI приведены их оценки по аддитив ной схеме [29].

Комментарии к аддитивности индексов удерживания ТМС-производных ами нокислот. Возможности формирования аддитивной схемы их оценок. Как правило, увеличение числа ТМС-фрагментов в молекулах за ко номерно при водит к увеличению индексов удерживания. Следовательно, представля ет интерес возмож ность создания некоторой аддитивной схемы, ко торая была бы полез ной как для оценки еще неизвестных значений RI, так и для проверки прави ль ности уже суще ствующих данных. Однако решение этой задачи затрудняет как присутствие в мо лекулах ами но кислот до по л нительных групп (–ОН, –СО₂Н, –NH₂, –SH, –CONH₂), так и проявле ние стерических эффектов, которые в слу чае амино кислот могут быть до с та точно неожиданными [30].

Здесь некоторых комментариев заслуживает вопрос: почему для оце нки RI ТМС-про изводных аминокислот целесообразно выбрать именно простейшую аддитивную схему. По совре мен ным представлениям набольшую точность оценок RI обеспечивают их корреля ции с нормальными температурами кипения соединений разных таксоно ми ческих групп (неаддитивный подход), поскольку точность определения Т_кип может превышать межлаборатор ную воспро изводимость индексов [31, 32]. Однако для ТМС-производных АК значения Т_кип при атмосферном давлении неизвестны, что сразу же означает неприменимость такого подхода. Большое число публикаций посвя ще но взаимосвязи хроматографических параметров удерживания и термодинамичес ких характеристик аналитов (см., например, [33–37]). Однако относитель но небольшая точность экспериментального определения термодинамических параметров привела к тому, что в подобных работах их обычно оценивают по хроматографи чес ким данным, а не наобо рот. В дополнение к этому необ хо димо заме тить, что в по следнее время значите льно выросла “по пулярность” слож ных алго рит мов оце нок RI, ос но ванных на принци пах ней рон ных сетей [38, 39], равно как и более сло ж ных (например, Gene Expression Pro gram ming [40]). Одна ко сведения об их приме нении конк ре т но к триметилсилиль ным произ во д ным ами но кислот отсут ст вуют и, следователь но, возможнос ти про с тейших адди тив ных схем далеко не ис черпаны. Такие схемы вполне могут быть “локальными”, т.е. ограничиваться достаточно узкой группой ТМС-производных аминокислот, поскольку попытки распространения вычислений на соединения любой химической природы приводят к снижению точности оценок. Так, например, оценки RI с использованием аддитивной схемы [29], приведенные в базе [12], для большинства ТМС-производных характеризуются доверительными интервалами ±89 ед. инд. при доверительной вероятности 50% и ±382 ед. ин д. при доверительной вероят ности 95%, что неприемлемо для практических целей.

Поскольку сами аминокислоты не могут являться объектами газохроматогра фи ческого разделения из-за их цвиттер-ионной структуры, прежде всего следует проверить постоянство разностей индексов удерживания DRI = RI(бис) – – RI(моно). Моно-ТМС-производные АК однозначно содержат фрагмент –CO₂Si(CH₃)₃, а бис- (при отсутствии других групп –ОН) – фраг менты –CO₂Si(CH₃)₃ и –NHSi(CH₃)₃. На ли чие в молекулах иных функциональных групп может приводить к неопределен ности локализации вто рого ТМС-фрагмента. Так, бис-ТМС-производные Ser, Thr, Tyr и OH-Pro вместо фра гмента –NHSi(CH₃)₃ содер жат фрагменты –OSi(CH₃)₃, в случае ТМС цистеина об ра зование S-ТМС или N-ТМС производных приблизитель но рав новероятно, а для таких амино кис лот, как Asn, Lys, His и Arg по ложение вто рой гру п пы –Si(CH₃)₃ становится неопределенным.

Значения DRI = RI(бис) – RI(моно) ТМС-производных простейших аминокислот (глицин и аланин) значительно превы ша ют (199 и 174) аналогичные значения для пяти остальных (число охарактеризованных мо но-ТМС-произ водных огра ниче но), а для фенилаланина они занижены, что, скорее всего, обуслов ле но экранирова нием фрагмента –NHSi(CH₃)₃ объемистой фенильной группой. За вычетом этих ис ключений среднее значение DRI = RI(бис) – RI(моно) составляет 118 ± 9 ед. инд. Однако та кая величина может представлять лишь огра ни ченный практиче с кий ин терес для оцен ки RI еще не охарактеризованных моно-ТМС-производных АК по данным для лучше охарактеризованных бис-ТМС-производных. Например, для мо но-ТМС валина получаем (1228 ± 17) – (118 ± 9) = 1110 ± (17² + 9²)^1/2 ≈ 19. Главная эвристиче с кая ценность такого ре зу льтата в том, что он демонстрирует сущест во вание элементов аддитивности в ин де ксах удерживания ТМС-производных АК.

Следующий “шаг” проверки аддитивности – характеристика разностей DRI = RI(трис) – – RI(бис), которые отчетливо разделяются на две подгруппы. Первую из них образуют аминокислоты, трис-ТМС-производные которых однозначно содер жат структур ный фрагмент –N[Si(CH₃)₃]₂: Gly (DRI = 198), Ala (261), Met (271) и, ско рее всего, Arg (224). Их усреднение дает оценку 238 ± 35 (4). При этом, как и в предыдущем случае, значение этого инкремента для фенилала нина (139) значите льно меньше, чем для остальных АК, из-за влияния стерических факторов. Если так, то для вто рой под груп пы (Ser, Thr, Asp, Gln, Glu, His) остается предполо жить присутствие двух структурных фрагментов –NHSi(CH₃)₃ и –XSi(CH₃)₃, где X = NH, N, O или S. Среднее значение DRI для этой подгруппы статис ти чески значимо от ли ча ется от первого: 111 ± 16 (7). Аномально низкие значе ния DRI = RI(трис) – RI(бис) выявлены для изолейцина (DRI = 23, единичное значение RI трис-ТМС изолейци на, скорее все го, оши боч но и исключено) и трипто фа на (DRI = 5, природа второго атома азо та в сос таве индольного фрагмента существенно отли ча ется от первого). Таким образом, значения инкрементов DRI = RI(трис) – RI(бис) для вариантов –NHSi(CH₃)₃ + XH → –N[Si(CH₃)₃]₂ + + XH и –NHSi(CH₃)₃ + XH → –NHSi(CH₃)₃ + + –XSi(CH₃)₃ прин ци пиально различаются.

Самым неожиданным оказывается то, что даже весьма ограниченные дан ные для ТМС-производных АК позволяют проверить корректность двух полученных оценок DRI = RI(трис) – – RI(бис) 238 ± 35 и 111 ± 16. Дело в том, что в табл. 1 от ра жен ранее не отмечавшийся факт, а именно наличие двух сильно различающихся ве личин RI для трис-ТМС лизина, а именно 1708 ± 18 (4) и 1847 ± 3 (2) (единствен ное значе ние в базе NIST [12] 1718), что свидетельствует о возможности образо ва ния его раз ных трис-ТМС производных. С учетом полученных выше оценок мож но по лагать, что бóльшее из этих двух значений принадлежит O,N,N-трис-ТМС-про из во д ному (O,N6,N6), а меньшее – O,N,N′-трис-ТМС-про из во д ному (O,N2,N6). Ес ли так, то мы можем оценить экспериментально не определенное до на сто ящего времени значе ние RI бис-ТМС-лизина двумя независимыми спосо ба ми, а имен но вычитая из большей величины RI большее значение DRI и соответ ст вен но из ме ньшего – меньшее. Получаем:

(1847 ± 3) – (238 ± 35) ≈ 1609 ± 35,

(1708 ± 18) – (111 ± 16) ≈ 1597 ± 24.

Полученные независимые оценки DRI в пределах их погрешностей совпадают между собой и, следовательно, относятся к одному и тому же бис-ТМС-производ но му лизина (среднее значение обеих оценок – 1603).

Подобные вычисления можно продолжить и в сторону увеличения значений RI. Если мы переходим от трис-ТМС ли зи на к тетракис-ТМС-производному, то по лу чаем:

(1847 ± 3) + (111 ± 16) ≈ 1958 ± 16,

(1708 ± 18) + (238 ± 35) ≈ 1946 ± 39.

Обе величины в пределах стандартных отклонений совпадают с экспери ме н та ль ным зна че ни ем 1934 ± 17. Таким образом, возможности проверки предлага емой аддитивной схемы непосредственно определяются характером массива исходных данных и подтверждают ее корректность. Правда, следует заметить, что на основа нии подоб ных оценок невозможно различить два изомерных тетракис-ТМС-про из водных ли зина: O,N2,N2,N6- и O,N2,N6,N6-. Скорее всего, образование обоих производных приблизительно равновероятно.

К сожалению, попыткам продолжения формирования такой адди тив ной схемы с оценками DRI = RI(тетракис) – RI(трис) препятствует объективно малое чис ло известных значений RI тетракис-ТМС-производных (всего пять). При этом оказы вается, что значения такого инкремента для Glu (226) и Lys (226) зако но мерно со от ветствуют величине DRI = RI(трис) – RI(бис) для трансформации структуры –NHSi(CH₃)₃ + + XH → –N[Si(CH₃)₃]₂ + XH. Значение DRI для Cys оказыва ется анома льно большим (405, что, видимо, определяется наличием группы –SH), а для тетракис-ТМС производных Asn и Arg они отрицательны, что заставляет усо м ни ться в пра ви ль ности для них значений RI. Однако нельзя отрицать по лезность даже таких ог рани ченных оценок. Например, в примечаниях к табл. 1 отмечено, что еди н ствен ное известное значение RI для тетракис-ТМС-производ но го аспарагиновой кисло ты (1541) в пределах погрешности не отличается от зна че ния RI трис-ТМС-произ водного (1518 ± 26). С высокой вероятностью оно оши бо ч но. Значение RI это го про изводного в соответствии со сформированной адди ти в ной схемой должно со ставлять (1518 ± 26) + (238 ± 35) ≈ 1756 ± (26² + 35²)^1/2 ≈ 44.

Стоит обратить внимание, что значения стандартных отклонений полученных оценок RI достаточно велики, что является не недостатком аддитивной схемы, а, скорее, ее преимуществом. Они определяются исключительно разбросом из ве ст ных справочных данных и не могут быть искусственно уменьшены.

Именно сравнение данных для различных ТМС-производных позволяет выя в лять явно ошибочные значения RI, поскольку иными способами это сделать слож но. В первую очередь это относится к АК, которые могут образовывать произ во д ные с n(ТМС) ≥ 4, в том числе Asp, Asn, Glu и Arg. Так, для аспарагиновой кислоты из вестно значение RI тетракис-ТМС-производного (1541), которое совпадает со зна чением RI трис-ТМС-производного (1544) [12], и поэтому его следует считать оши бочным. Для ар гинина известное значе ние RI тетракис-ТМС-производного (1632) меньше RI трис-ТМС-про из водного (1814), но совпадает с данными для пентакис-ТМС-производного (1632, 1640). Очевид но, что эти значения не могут принадлежать тетра- и пентакис-производ ным, однако установить точное число и положение ТМС-групп в молекуле по этим данным не представляется возможным. Весьма сложный случай выявлен для аспарагина, у которого бóльшая часть извест ных значений RI тетракис-ТМС-производного (1673 ± 10) не отличается от RI трис-ТМС Asn (1681 ± 10) и, следовательно, ошибочна. Только одно значение 1863 > 1681 можно полагать корректным, и оно может быть приписано тетракис-ТМС-производному. Таким образом, та кой критерий, как число независимо определенных значений RI, нельзя считать надежным во всех случаях. Объекти в ной причи ной подобных оши бок оказыва ет ся невозможность установления количества три метилсилиль ных групп по масс-спект рометричес ким данным. Подобные примеры ил люстриру ют как сложность рассматри ваемой проблемы , так и необходи мость систе матизации индексов удержи вания ТМС-производных аминокислот как самостоя тель ную и нередко достаточно трудоемкую задачу .

Комментируя статистически обработанные индексы удерживания, следует за метить, что при их дополнении новыми данными как средние значения RI, так и их станда рт ные отклонения могут незначительно изменяться (различия не выходят за пределы стандартных отклонений). Этот эффект хорошо заметен при сравнении ин формации для одних и тех же соединений в различных выпусках базы данных [12] (2005, 2008, 2011, 2014, 2017, 2020 и 2023 гг.).

***

Таким образом, систематизацию известных газохроматографических индексов удерживания (RI) различных соединений на стандартных неполярных по ли диме тил силоксановых неподвижных фазах (на примере триметилсилильных про извод ных аминокислот), включающую группирование значений RI разных производных одних и тех же аминокислот по числу триметилсилильных групп в молекуле и их последующую статистическую обработку, следует считать важнейшей стадией кон троля справочных газохроматографических данных. Получение простейших аддити в ных оценок ин дексов даже на основании ог рани че н ных массивов данных предста в ляет значительный интерес для оцен ки еще неизве ст ных значений RI, про вер ки пра ви ль ности сущест вующих данных, а так же выявления ошибоч ных значе ний.

Финансирование работы

Финансирование настоящей работы осуществлялось за счет средств бюджета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования “Санкт-Петербургский государственный университет”, Институт химии. Дополнительных грантов на проведение или руководство этим конкретным исследованием получено не было.

Конфликт интересов

Автор данной работы заявляет, что у него нет конфликта интересов.

About the authors

I. G. Zenkevich

Author for correspondence.
Email: izenkevich@yandex.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files