Determination of nine organophosphorus pesticides by high-resolution hplc-ms/ms in medicinal plant materials

Толық мәтін

Фосфорорганические пестициды (ФОП) широко применяются на всех этапах выращивания растений. С 1960-х гг. они пришли на смену персистентным хлорорганическим пестицидам, которые являются популярным и востребованным классом современных пестицидов [1, 2].

В литературе практически отсутствуют сведения о том, насколько широко и в каких объемах применяется тот или иной конкретный представитель группы ФОП производителями и поставщиками лекарственного растительного сырья и сельхозпродукции. Отсутствуют также статистические данные о том, в каких регионах и в каких количествах на территории Российской Федерации применяются ФОП. То же самое относится и к поставщикам сырья из других стран.

Используемые в настоящей работе в качестве объектов анализа девять ФОП доступны на рынке пестицидов и имеют низкую стоимость, поэтому высока вероятность их широкого применения при выращивании лекарственного растительного сырья (ЛРС) и сельхозпродукции.

Известно, что даже при соблюдении сельскохозяйственных и производственных норм обработки ФОП могут оставаться в обрабатываемых растениях, а также поступать в атмосферу, почву и водоемы [3–5]. Некоторые ФОП обладают высокой персистентностью, способны оставаться в неизменном состоянии и сохранять свою токсичность в течение длительного времени [6]. Кроме того, существует опасность попадания пестицидов в организм человека [7, 8]. Одним из источников токсичных ФОП может являться ЛРС, входящее в состав лекарственных препаратов и БАД [9, 10]. Известно, что растения способны кумулировать пестициды, поэтому возможность обнаружения и определения низких концентраций ФОП позволяет в течение длительного времени отслеживать “жизненный цикл” ФОП в растениях и вырабатывать дополнительные рекомендации по их безопасному применению.

В Государственной фармакопее (ГФ) РФ XV [11] нормируются 33 ФОП, при этом их пределы допустимого содержания коррелируют между собой в фармакопеях России, Европы [12] и США [13]. В настоящее время в ГФ РФ XV регламентированы методы определения только хлорорганических пестицидов, а действующие фармакопеи EP 10 и USP 42 NF-37 отошли от регламентирования унифицированных методик определения ФОП в ЛРС и предлагают использовать любой метод определения ФОП в ЛРС, удовлетворяющий критериям соответствующих общих фармакопейных статей (ОФС) и валидированный в соответствии с SANCO/10232/2006 [14] (для EP 11) или SANTE/11813/2017 [15] и OPPTS 860.1490 [16] (для USP 45 NF-40).

До недавнего времени при определении ФОП наиболее часто использовали метод газовой хроматографии (ГХ) в сочетании с пламенно-ионизационным, азотно-фосфорным или атомно-эмиссионным детектором с использованием внутренних стандартов (ВС) [17–20]. Поскольку ФОП – это полярные и слаболетучие соединения, их определение с помощью ГХ часто включает процедуру дериватизации. Для прямого определения полярных, слаболетучих соединений с низкой термической стабильностью предпочтительнее использование высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Кроме того, этот метод является одним из самых чувствительных и селективных, что позволяет определять низкие концентрации остаточных ФОП в ЛРС и пищевых продуктах.

Для повышения точности анализа развиваются направления с применением дейтерированных ВС [21, 22]. Такой подход позволяет учитывать возможные потери аналитов при подготовке проб и хроматографировании, так как потери дейтерированных аналогов полностью сопоставимы с потерями определяемых веществ. Применение при анализе дейтерированных ВС нивелирует влияние матричного эффекта, являющегося валидационным параметром в фармакопеях Европы и США.

Описаны способы определения ФОП в лекарственных растениях методами газовой хромато-масс-спектрометрии [23, 24] и ВЭЖХ-МС [25, 26]. В большинстве из них для пробоподготовки используется метод твердофазной экстракции QuEChERS в различных вариациях. Масс-спектрометрия высокого разрешения с использованием дейтерированных ВС позволяет сократить процесс подготовки проб и избежать трудоемких манипуляций при подготовке ЛРС к анализу.

Перечень пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, представлен в государственном каталоге [27], где ограничено применение персистентных хлорорганических пестицидов. Перечень включает девять ФОП: диазинон, диметоат, ометоат, пиримифос-метил, пиримифос-этил, малатион, малаоксон, хлорпирифос-метил, фозалон, которые мы выбрали в качестве образцов для настоящего исследования (схема 1).

 

Схема 1. Структурные формулы фосфорорганических пестицидов.

 

Цель данной работы – разработка и валидация методики одновременного определения девяти ФОП, позволяющей определять остаточные содержания ФОП в ЛРС и лекарственных препаратах растительного происхождения.

Экспериментальная часть

Объекты исследования. Образцы ЛРС – корневища с корнями валерианы лекарственной (Rhizomata cum radicibus Valerianae officinalis), приобретенные в аптеке (АО “Красногорсклексредства”, Россия, серия 10123). Стандартные образцы диазинона (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 74332), диметоата (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 45449), ометоата (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 36181), пиримифос-метила (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 32058), пиримифос-этила (Supelco (Sigma-Aldrich), США,Cat. № 45628), малатиона (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 36143), малаоксона (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 36142), хлорпирифос-метила (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 45395), фозалона (Supelco (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 36194). Предварительно мы синтезировали и охарактеризовали дейтерированные стандарты малатион-d6 и дихлорфос-d6 [28].

Растворы и реагенты. Реактивы: ацетонитрил HPLC-grade (CarloErba, Германия, Cat. № 7), деионизованная вода после очистки системой Milli-Q (Millipore, США), муравьиная кислота (Merck (Sigma-Aldrich), США, Cat. № 1.00263).

Рабочие растворы готовили растворением точных навесок ФОП в ацетонитриле в день проведения анализа в диапазоне концентраций от 0.05 до 10 000 нг/мл.

Испытуемые образцы корневищ с корнями валерианы с введенными ФОП готовили из рабочих растворов ФОП в диапазоне концентраций от 0.01 до 10 000 нг/г.

Оборудование. Использовали аналитическую станцию, состоящую из жидкостного хроматографа Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific, США), оборудованного системой автоматического ввода пробы, с масс-селективным тандемным анализатором высокого разрешения Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific, США) c источником ионов и ионизацией электрораспылением. Для разделения аналитов использовали хроматографическую колонку Zorbax 300SB-C18 (Agilent Technologies, США). Экспериментальные данные регистрировали и обрабатывали с помощью программных пакетов Xcalibur (Thermo Scientific, США).

Методика определения фосфорорганических пестицидов в лекарственном растительном сырье. При разработке методики с целью повышения точности идентификации и определения содержания выбранных ФОП, а также для построения градуировочных зависимостей использовали предварительно синтезированные дейтерированные ВС малатион-d6 и дихлорфос-d6 [28].

Пробоподготовка. На аналитических весах взвешивали 1 г (точная навеска) измельченного в лабораторной мельнице растительного сырья, проходящего через сито 1 мм, добавляли 5 мл ацетонитрила, содержащего дейтерированные ВС (500 нг/мл малатион-d6, 500 нг/мл дихлорфос-d6), перемешивали в течение 4 мин при 500 об/мин. Далее центрифугировали при 5500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость пропускали через шприцевой фильтр для микрофильтрации ПТФЭ с размером пор 0.20 мкм. Органический экстракт переносили в стеклянную виалу емк. 2 мл.

Определяемые ФОП разделяли в режиме градиентного элюирования, скорость подвижной фазы 0.35 мл/мин, температура термостата колонки 40°C. Подвижная фаза А – 0.1 об. % НСООН в воде, подвижная фаза Б – ацетонитрил. Программа градиентного элюирования: 0–2 мин: 95% А; 2–10 мин: 5–95% Б; 10–11 мин: 95% Б; 11–15 мин: 95% A. Объем вводимой пробы составлял 0.01 мл.

Использовали электрораспылительную ионизацию в режиме регистрации положительно заряженных ионов аналитов (ФОП). Величина разрешения масс-анализатора составляла не менее 30 000 в режиме МС/МС.

Результаты и их обсуждение

Оптимальные условия детектирования ФОП представлены в табл. 1. Температура входного ионного капилляра составляла 325°С, температура газа-осушителя – 350°С, скорость подачи обдувочного газа составляла 50 усл. ед. (согласно номенклатуре производителя), вспомогательного газа – 10 усл. ед. (согласно номенклатуре производителя) и продувочного газа – 1 усл. ед. (согласно номенклатуре производителя), в работе источника ионизации использовали азот в качестве газа-носителя. Напряжение на распыляющем капилляре составляло 3500 В. Масс-спектры фрагментации получали в варианте диссоциации, вызванной соударениями (CID) и высокоэнергетической диссоциации (HCD). При выборе ионных реакций выбирали две наиболее интенсивные, полученные для этих вариантов диссоциации.

 

Таблица 1. Оптимальные условия одновременного детектирования фосфорорганических пестицидов с использованием электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов

Пестицид	Ионная реакция	Оптимальный режим фрагментации	Энергия фрагментации, В
Диазинон	305.1083 => 169.0794*	HCD	35
	305.1083 => 153.1022**	HCD	35
Диметоат	230.0069 => 198.9647*	HCD	10
	230.0069 => 170.9698**	HCD	20
Ометоат	214.0297 => 182.9875*	CID	40
	214.0297 => 196.0192**	HCD	15
Пиримифос-этил	334.1349 => 198.1059*	HCD	35
	334.1349 => 182.1288**	HCD	35
Пиримифос-метил	306.1036 => 278.0723*	CID	40
	306.1036 => 164.1182**	HCD	35
Малатион	331.0433 => 285.0015*	CID	25
	331.0433 => 127.0390**	HCD	15
Малаоксон	315.0662 => 127.0390*	HCD	15
	315.0662 => 269.0243**	CID	20
Хлорпирифос-метил	321.9023 => 289.8760*	CID	25
	321.9023 => 124.9821**	HCD	25
Фозалон	368.9941 => 322.0064*	CID	20
	368.9941 => 182.0003**	HCD	25
Малатион D6	337.081 => 291.0391*	CID	25
Дихлорфос D6	226.9908 => 133.0530**	HCD	30

*Ионная реакция для определения содержания, **ионная реакция для подтверждения присутствия.

 

В процессе разработки методики выбирали и оптимизировали условия масс-спектрометрического детектирования в режиме сканирования фрагментных ионов, образующихся в результате фрагментации ионов-предшественников аналитов.

Выбор условий масс-спектрометрического детектирования. Исследуемые ФОП (схема 1) имеют в своей структуре полярные и основные группы, а также донорно-акцепторные центры. За счет наличия в структуре атомов азота, кислорода и серы молекулы ФОП легко протонируются, образуя положительно заряженные ионы в слабокислой среде, поэтому в ходе выбора условий масс-спектрометрического детектирования использовали электрораспылительную ионизацию в режиме регистрации положительно заряженных ионов. В результате анализа масс-спектров выбрали ионные реакции, приводящие к наиболее интенсивным и устойчивым фрагментным ионам. Условия одновременного детектирования ФОП оптимизировали в режиме прямого ввода раствора стандарта исследуемых ФОП (раствор с содержанием каждого пестицида 1 мкг/мл в воде) непосредственно в источник ионов.

Для исследования параметров, отвечающих за настройки работы масс-детектора, напряжения на входной линзе при настройке ионной оптики “нулевого” квадруполя и энергии фрагментации в ячейке соударений, использовали типичные параметры работы масс-спектрометрического детектора, рекомендуемые производителем и прописанные в файле автоматической настройки системы – автотюнинга. Напряжение на входной линзе варьировали в диапазоне 10–90 В. Для каждого ФОП использовали два типа энергии фрагментации – CID и HCD. Оптимальное напряжение на входной линзе для каждого ФОП представлено в табл. 1. Условия масс-спектрометрического детектирования выбранных ФОП приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Условия масс-спектрометрического детектирования выбранных фосфорорганических пестицидов и их дейтерированных аналогов

Параметр	Оптимизированное значение
Температура газа-осушителя, °С	350
Температура входного ионного капилляра, °С	325
Скорость подачи газа-осушителя, усл. ед.	50
Скорость подачи газа-распылителя через иглу небулайзера, усл. ед.	10
Напряжение источника ионизации, В	3 500
Напряжение на линзе	Для каждого соединения устанавливается отдельно
Энергия фрагментации	Для каждого соединения устанавливается отдельно
Ион – предшественник	Для каждого соединения устанавливается отдельно
Диапазон сканирования, m/z	80–350
Время сканирования, мс	22 для каждой ионной реакции
Разрешение масс-спектрометра	30 000
Полярность регистрируемых ионов	Положительные

 

На следующем этапе для ионных MRM-переходов определяемых ФОП выбирали пики ионов, имеющие наибольшую интенсивность в масс-спектрах фрагментации протонированных молекул аналитов. В качестве ионов-прекурсоров выбрали протонированные молекулярные ионы. В табл. 3 приведены наиболее интенсивные пики, полученные в режиме сканирования.

 

Таблица 3. Наблюдаемая фрагментация протонированных молекулярных ионов фосфорорганических пестицидов и их молекулярные формулы (фрагментация в режимах CID = 25, HCD = 25)

Элементный состав	m/zтеор	m/zнабл	Δm/z, млн–1	Интенсивность, %
Диазинон CID
C8H13N2S	169.0794	169.0792	–0.22	75.29
C8H13ON2	153.1022	153.1021	–0.17	36.93
C10H18O3N2PS	277.077	277.0772	0.21	2.7
Диазинон HCD
C8H13N2S	169.0794	169.0793	–0.1	100
C8H13ON2	153.1022	153.1021	–0.1	50.35
H4O3PS	114.9613	114.9613	–0.04	6.54
Диметоат CID
C4H8O3PS2	198.9647	198.9648	0.05	100
C3H8O2PS2	170.9698	170.9699	0.13	1.92
C4H9O2NPS2	197.9807	197.9815	0.79	1.26
Диметоат HCD
C2H8O3PS	142.9926	142.9924	–0.21	100
C3H8O2PS2	170.9698	170.9696	–0.16	83.08
C4H8O3PS2	198.9647	198.9646	–0.08	35.51

 

Элементный состав	m/zтеор	m/zнабл	Δm/z, млн–1	Интенсивность, %
Ометоат CID
C4H8O4PS	182.9875	182.9873	–0.25	100
C5H11O3NPS	196.0192	196.019	–0.18	18.74
C2H8O3PS	142.9926	142.9925	–0.15	3.51
Ометоат HCD
C2H8O3PS	142.9926	142.9924	–0.2	100
C4H8O4PS	182.9875	182.9874	–0.1	39.53
C3H8O3PS	154.9926	154.9924	–0.18	33.32
Пиримифос-этил CID
C11H21O3N3PS	306.1036	306.1041	0.52	45.36
C9H16N3S	198.1059	198.1059	0	71.4
C9H16ON3	182.1288	182.1288	0	17.83
Пиримифос-этил HCD
C9H16N3S	198.1059	198.1059	–0.03	100.00
C9H16ON3	182.1288	182.1288	0.03	28.27
C11H21O3N3PS	306.1036	306.1042	0.61	18.32
Пиримифос-метил CID
C9H17O3N3PS	278.0723	278.0726	0.36	9.46
C9H14N3	164.1182	164.1182	–0.03	7.53
C10 H17O2N3PS	274.0774	274.0778	0.4	5.06
Пиримифос-метил HCD
C9H14N3	164.1182	164.1181	–0.09	17.55
C9H17O3N3PS	278.0723	278.0727	0.42	5.06
C10H17O2N3PS	274.0774	274.0778	0.46	2.22
Малатион CID
C8H14O5PS2	285.0015	285.0019	0.41	100
C6H7O3	127.039	127.0388	–0.12	14.07
C4H3O3	99.0077	99.0076	–0.12	3.73
Малатион HCD
C4H3O3	99.0077	99.0076	–0.11	100
C6H7O3	127.039	127.0388	–0.13	78.88
C2H8O3PS	142.9926	142.9925	–0.1	25.42
Малаоксон CID
C6H7O3	127.039	127.0388	–0.16	100
C8H14O6PS	269.0243	269.0246	0.31	63.77
C4H3O3	99.0077	99.0076	–0.09	58.99
Малаоксон HCD
C4H3O3	99.0077	99.0076	–0.11	100
C6H7O3	127.039	127.0388	–0.13	72.99
C2H8O3PS	142.9926	142.9925	–0.09	18.5
Хлорпирифос-метил CID
C6H4O2NCl3PS	289.876	289.8765	0.45	100

Элементный состав	m/zтеор	m/zнабл	Δm/z, млн–1	Интенсивность, %
C2H8O3PS	142.9926	142.9925	–0.12	3.67
C2 H6 O2PS	124.9821	124.9819	–0.14	1.12
Хлорпирифос-метил HCD
C2H8O3PS	142.9926	142.9925	–0.14	100
C6H4O2NCl3PS	289.876	289.8765	0.45	48.23
C2H6O2PS	124.9821	124.9819	–0.13	9.76
Фозалон CID
C11H14O4NClPS	322.0064	322.0068	0.42	100
C8H5O2NCl	182.0003	182.0003	–0.04	35.91
C10H10O3NClPS2	321.9523	321.9524	0.12	8.07
Фозалон HCD
C8H5O2NCl	182.0003	182.0003	–0.03	100
H4O3PS	114.9613	114.9613	–0.06	11.6
C10H15O3NClPS2	326.9914	327.0783	86.91	4.21
Малатион-d6 CID
C8H8[2]H6O5PS2	291.0391	291.0393	0.17	100
C6H7O3	127.039	127.0389	–0.08	11.16
C4H3O3	99.0077	99.0076	–0.06	3.08
Малатион-d6 HCD
C4H3O3	99.0077	99.0075	–0.13	100
C6H7O3	127.039	127.0388	–0.17	82.03
C5H2[2]H6O3PS2	217.0024	217.0023	–0.04	19.32
Дихлорфос-d6 CID
C2H2[2]H6O4P	133.0531	133.0529	–0.2	79.23
C2H[2]H6O3ClP	151.0192	151.0191	–0.19	39.14
C3[2]H6O2Cl	115.0427	115.0429	0.15	0.16
Дихлорфос-d6 HCD
C2H2[2]H6O4P	133.0531	133.0529	–0.23	100
C2H[2]H6O3ClP	151.0192	151.0191	–0.14	7.07
C3[2]H6O2Cl	115.0427	115.0428	0.1	0.07

 

Для ометоата, малаоксона, хлорпирифос-метила, малатиона, пиримифос-метила и фозалона оптимальный режим фрагментации для двух ионных реакций не совпадает. Так, на рис. 1 в качестве примера представлены масс-спектры фрагментаций молекулярных ионов ометоата, полученные в режиме высокого разрешения в вариантах CID и HCD. Фрагмент для определения содержания 182.9875 характеризуется более высокой интенсивностью в режиме CID, а фрагмент для подтверждения присутствия 196.0192, наоборот, лучше проявляется в режиме HCD-фрагментации. На основании полученных данных для каждого ФОП выбрали по две наиболее интенсивные ионные реакции. В табл. 1 представлены выбранные наиболее интенсивные реакции для каждого ФОП и ВС (дейтерированых аналогов).

 

Рис. 1. Масс-спектры фрагментаций протонированного молекулярного иона ометоата с m/z 214.0297, полученные в вариантах CID (25 B) и HCD (25 B). Режим регистрации положительных заряженных ионов.

 

Выбор условий хроматографического разделения. Установили, что в качестве неподвижной фазы при определении ФОП в ЛРС оптимально использование колонки Agilent Zorbax 300SB-C18, 100 мм × 2.1 мм с диаметром зерна сорбента 3.5 мкм.

Для разделения ФОП использовали подвижную фазу, состоящую из ацетонитрила и 0.1%-ного раствора водного муравьиной кислоты. Использование муравьиной кислоты способствует наименьшему размыванию пиков ФОП. В табл. 4 представлены условия и параметры хроматографического разделения ФОП. Расчетная величина мертвого времени составляет 0.7 мин. В табл. 5 приведены параметры хроматографического разделения ФОП в выбранных условиях.

 

Таблица 4. Условия хроматографического разделения

Параметр	Значение
Объем вводимой пробы, мл	0.010
Элюент А	0.1%-ная муравьиная кислота в воде
Элюент Б	Ацетонитрил
Температура термостата колонки, оС	40
Скорость подачи элюента, мл/мин	0.350
Программа элюирования, состав подвижной фазы	0.00–2.00 мин 5% элюента Б; 2.01–10.00 мин 5–95% элюента Б; 10.01–11.00 мин 95% элюента Б; 11.01–15.00 мин 5% элюента Б (градиентный режим)

 

Таблица 5. Параметры хроматографического разделения фосфорорганических пестицидов

Пестицид	Время удерживания, мин	Коэффициент емкости	Число теоретических тарелок
Диазинон	9.0 ± 0.2	11.9	268 366
Диметоат	5.5 ± 0.2	6.9	50 232
Ометоат	1.8 ± 0.2	1.6	6355
Пиримифос-этил	9.7 ± 0.2	12.9	310 628
Пиримифос-метил	9.0 ± 0.2	11.9	336 017
Малатион	8.5 ± 0.2	11.1	156 127
Малаоксон	6.9 ± 0.2	8.8	208 024
Хлорпирифос-метил	9.3 ± 0.2	12.2	118 868
Фозалон	9.3 ± 0.2	12.2	205 796

 

В качестве критерия присутствия ФОП в пробах использовали относительное время удерживания и представленные в табл. 1 ионные реакции (совпадение двух выбранных ионов из масс-спектров фрагментации протонированных молекул аналитов, соответствующих определяемому компоненту).

Оптимизация процедуры подготовки проб. Распространенным способом подготовки образцов при определении ФОП является система QuEChERS, разработанная в 2003 г. для анализа пищевых продуктов [29]. Для достижения удовлетворительных результатов определения ФОП проанализировали различные условия экстракции (тип растворителя для экстракции и тип очистки). Использование системы QuEChERS показало неудовлетворительные результаты, что, вероятно, связано с большими потерями образца в ходе процедуры пробоподготовки.

В качестве оптимального метода пробоподготовки выбрали экстракцию ацетонитрилом без использования твердофазной очистки экстракта. За основу взяли методику, предложенную Аматэ и др. [30], для определения афлатоксинов, красителей и пестицидов в специях.

На рис. 2 в качестве примера приведены хроматограммы малатиона в пробах корневищ с корнями валерианы в выбранных условиях разделения и подготовки проб. На хроматограммах представлена величина аналитического сигнала иона из масс-спектров фрагментации протонированных молекул аналитов, выбранного для количественного анализа.

 

Рис. 2. Суперпозиция хроматограмм стандартного раствора, содержащего 100 нг/мл малатиона, по двум ионным реакциям. 1 – ионная реакция для определения содержания 214.0297 => 182.9875; 2 – ионная реакция для подтверждения присутствия 214.0297 => 196.0192.

 

Валидацию методики определения ФОП в ЛРС методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения проводили на основе ОФС 1.1.0012 “Валидация аналитических методик” и ОФС 1.5.3.0011 “Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах” Государственной фармакопеи РФ XV издания [11] по следующим параметрам: специфичность, линейность, правильность и аналитическая область, предел количественного определения, прецизионность.

Согласно требованиям к валидации аналитических методик SANCO, оценивали влияние матричного эффекта, хотя это не входит в обязательные критерии валидации.

Специфичность. Для подтверждения специфичности использовали пробы корневищ с корнями валерианы, не содержащие ФОП, и сравнивали с модельными пробами данного ЛРС, в которые в ходе пробоподготовки добавляли рабочий стандартный раствор ФОП в ацетонитриле. На полученных хроматограммах отсутствовали пики компонентов, мешающих определению ФОП. Время удерживания основного пика на хроматограммах испытуемых растворов совпало с временем удерживания основного пика на хроматограммах для каждого ФОП. Время удерживания для каждого пестицида, коэффициент емкости и эффективность разделения приведены в табл. 5.

Линейность. Для каждого определяемого пестицида готовили серию градуировочных растворов в диапазоне концентраций 0.01 до 10 000 нг/г. В качестве ВС использовали добавку 500 нг/мл малатион-d6 и 500 нг/мл дихлорфос-d6. Для хлорсодержащего пестицида хлорпирифоса площадь пика нормировали с пересчетом на дихлорфос-d6, в остальных случаях с пересчетом на малатион-d6. Для построения градуировочных зависимостей использовали отношения площадей пиков выбранной ионной реакции для определения ФОП к площадям пиков дейтерированных аналогов. По полученным значениям строили градуировочные графики. Установили, что графики зависимостей отношений площади пика каждого ФОП к площади пика ВС от его содержания линейны и описываются уравнением y = ax. Полученные результаты приведены в табл. 6 и удовлетворяют критериям приемлемости по показателю “линейность”.

 

Таблица 6. Метрологические характеристики определения фосфорорганических пестицидов в модельных пробах корневищ с корнями валерианы

Пестицид	Уравнение градуировочной зависимости	Диапазон линейности градуировочного графика, нг/г	R2
Диазинон	Si = 9.04 × 10–2ci	0.01–10	0.996
Диметоат	Si = 0.22ci	0.1–100	0.997
Ометоат	Si = 0.186ci	0.1–100	0.998
Пиримифос-этил	Si = 0.322ci	0.01–10	0.995
Пиримифос-метил	Si =6.51 × 10–2 ci	0.01–10	0.993
Малатион	Si = 3.46 × 10–3ci	0.1–100	0.997
Малаоксон	Si = 3.32 × 10–2ci	0.01–10	0.994
Хлорпирифос-метил	Si = 1.11 × 10–4ci	1–500	0.997
Фозалон	Si = 1.71 × 10–4ci	10–5000	0.996

Примечание: S_i = S_опр/S_вн.ст. – отношение площадей пика выбранной ионной реакции для количественной оценки определяемого аналита к площади пика соответствующего дейтерированного ВС; с_i – концентрация определяемого компонента в пробе, нг/г.

 

Предел количественного определения. В соответствии с полученными данными валидируемая методика обеспечивает следующие значения пределов количественного определения, нг/г: 0.01 для диазинона, 0.1 для диметоата, 0.1 для ометоата, 0.01 для пиримифос-этила, 0.01 для пиримифос-метила, 0.1 для малатиона, 0.01 для малаоксона, 10 для фозалона. Для этих значений отношение сигнал/шум для каждого компонента превышает 10 : 1. Данные значения предела количественного определения позволяют определять ФОП в ЛРС в количествах, соответствующих пределам допустимого содержания, обозначенных в ОФС 1.5.3.0011.15.

Правильность разработанного подхода проверяли методом введено–найдено. Для этого готовили серии проб корневищ с корнями валерианы с внесенными ФОП с концентрациями каждого аналита (нг/г) 0.04, 0.4, 4, 40, 400, 4000. Степень извлечения каждого пестицида лежала в диапазоне 70–110% (табл. 7).

 

Таблица 7. Правильность и прецизионность определения фосфорорганических пестицидов в модельных пробах корневищ с корнями валерианы

Пестицид	Введено, нг/г	Найдено, нг/г	sr, %	s, нг/г	Степень извлечения, %
Диазинон	0.04	0.037	4.02	0.0015	91.7
	0.4	0.42	2.53	0.0107	106.0
	4	4.09	2.41	0.0987	102.3
Диметоат	0.4	0.39	8.28	0.032	97.4
	4	3.69	6.07	0.22	92.2
	40	42.3	6.67	2.82	105.8
Ометоат	0.4	0.41	4.45	0.018	102.8
	4	3.74	2.04	0.076	93.6
	40	41.3	6.33	2.61	103.3
Пиримифос-этил	0.04	0.036	6.55	0.0024	90.4
	0.4	0.42	2.17	0.0092	106.3
	4	4.16	4.4	0.18	104.1
Пиримифос-метил	0.04	0.039	3.1	0.0012	96.8
	0.4	0.42	2.98	0.012	103.9
	4	3.70	2.91	0.11	92.5
Малатион	0.4	0.42	7.12	0.030	105.2
	4	4.23	3.36	0.14	105.9
	40	40.5	20.1	8.1	101.2
Малаоксон	0.04	0.038	6.11	0.0023	93.9
	0.4	0.37	7.01	0.026	93.0
	4	4.16	3.2	0.13	104.0
Хлорпирифос-метил	4	3.78	1.1	0.043	94.3
	40	36.2	4.5	1.64	90.5
	400	387.7	10.6	41.1	96.9
Фозалон	40	34.5	8.07	2.78	86.2
	400	378.8	2.29	8.67	94.7
	4000	4133.2	9.2	380.4	103.3

 

Прецизионность. Повторяемость методики характеризует ее прецизионность при выполнении повторных испытаний в пределах короткого промежутка времени в условиях сходимости на одном и том же оборудовании. Определение проводили на шести испытуемых растворах корневищ с корнями валерианы лекарственной. Каждый раствор хроматографировали три раза.

Прецизионность оценивали методом введено-найдено на примере трех концентраций с тремя повторами для каждой и выражали в виде стандартного отклонения, относительного стандартного отклонения и относительной погрешности. Результаты представлены в табл. 7 и удовлетворяют валидационному критерию “прецизионность”.

Матричный эффект. Для каждого пестицида определяли матричный эффект (МЭ), сравнивая наклон градуировочных кривых в матрице (корневища с корнями валерианы) и ацетонитриле, использую формулу, приведенную в работах [21, 31]:

$МЭ,\%=\left(\frac{\begin{array}{l}Наклонградуировочного\\ графикавматрице\end{array}}{\begin{array}{l}Наклонградуировочного\\ графикавацетонитриле\end{array}}\right)-1)\times 100.$

Для большинства пестицидов МЭ оказался отрицательным со значениями ниже 20%, т.е. происходит подавление интенсивности аналитического сигнала на хроматограммах. Это может быть связано с присутствием в корневищах с корнями валерианы эфирных масел и других вторичных метаболитов, конкурирующих с аналитами при хроматографическом разделении либо изменяющих свойства элюента, которые влияют на процесс дальнейшей ионизации. Так, МЭ для диазинона составил –13.7%, для диметоата –14.6%, для ометоата –7.6%, для пиримифос-метила –10.3%, для пиримифос-этила –17.0%, для малатиона –2%, для малаоксона –0.4%, для фозалона –10.7%. Хлорпирифос-метил показал при анализе увеличение хроматографического сигнала и соответственно положительный МЭ – +13.4%. Учет МЭ свидетельствует о приемлемости методики для анализа ЛРС.

* * *

Разработана и валидирована методика одновременного определения девяти ФОП, допустимых к применению на территории РФ, в ЛРС методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. Методика валидирована по следующим валидационным параметрам: специфичность, линейность, правильность и аналитическая область, предел определения, прецизионность, матричный эффект. Показано, что результаты валидации удовлетворительны по всем указанным критериям. Предложенный подход может быть успешно использован для идентификации и определения ФОП в ЛРС в широком диапазоне концентраций от 0.01 до 10 000 нг/г. Наряду с фармацевтическими компаниями, которые занимаются переработкой ЛРС и производством лекарственных растительных препаратов, предлагаемая методика может использоваться для анализа содержания ФОП в сырье производителями сельхозпродукции.

Финансирование работы

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

O. Fateenkova

I.M. Sechenov First MSMU of the Ministry of Health of the Russian Federation

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: Fateenkova-Olga@mail.ru
Ресей, Mosсow

A. Savvateev

I.M. Sechenov First MSMU of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: Savvateev_A_M@staff.sechenov.ru
Ресей, Mosсow

A. Braun

Laboratory for the Chemical and Analytical Control of the Military Research Centre

Email: Fateenkova-Olga@mail.ru
Ресей, Moscow

V. Beloborodov

I.M. Sechenov First MSMU of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: Fateenkova-Olga@mail.ru
Ресей, Moscow

I. Gravel

I.M. Sechenov First MSMU of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: Fateenkova-Olga@mail.ru
Ресей, Mosсow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар