Разработка методики поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения тилозина в мёде

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация

Разработана методика поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения антибиотика тилозина в мёде. С этой целью проведена иммунизация кроликов конъюгатом тилозина с бычьим сывороточным альбумином, получены антисыворотки. Оптимизированы условия взаимодействия антисывороток в конкурентном формате с тилозином в пробе и с тилозином, меченным флуоресцеином. Разработанная методика характеризуется пределом обнаружения тилозина 34.7 нг/мл и рабочим диапазоном определяемых концентраций от 65.2 до 564.0 нг/мл. Показана высокая воспроизводимость измерений с помощью портативного детектора: значения относительного стандартного отклонения (sr) лежат в диапазоне 1.5–2.5%. Методика апробирована на образцах меда; процент открытия варьировал от 98 до 103.8%. Продолжительность анализа без учета подготовки проб – 10 мин.

Толық мәтін

Антибиотики широко применяются в ветеринарии для борьбы с бактериальными инфекциями [1]. При этом распространенным стало добавление антибиотиков в корма для того чтобы обеспечить не только лечение, но и профилактику инфекций [2]. Следствием этого является развитие резистентной микрофлоры в организме конечного потребителя [3, 4]. При несоблюдении дозирования и нарушении сроков ожидания после применения препарата антибиотики попадают в продукты питания – мясо, молоко, яйца и др. [5–7].

Важной проблемой является контаминация антибиотиками продукции пчеловодства, что обусловлено сложностями мониторинга заболеваемости и массовым профилактическим применением. В мёде и другой продукции пчеловодства обнаруживаются антибиотики разных классов – бета-лактамы (пенициллин, ампициллин), амфениколы (тиамфеникол, хлорамфеникол), тетрациклины (окситетрациклин, тетрациклин), макролиды (тилозин, эритромицин) и аминогликозиды, фторхинолоны (ципрофлоксацин, энрофлоксацин) и др. [8, 9].

К широко используемым в пчеловодстве антибиотикам относится тилозин – бактериостатический препарат из группы макролидов, блокирующий биосинтез белков вследствие образования комплекса с 50S-субъединицей рибосом [10]. Низкая скорость трансформации и перенос по пищевым цепям обусловливают угрозы попадания этого соединения в организм человека [11–13]. Установленные токсические эффекты тилозина [14, 15] привели к разработке нормативных документов, регулирующих предельно допустимые уровни потребления и концентрации этого антибиотика в продуктах питания. Согласно законодательству Евразийского Экономического Союза присутствие остаточных количеств тилозина в мёде не допускается [16].

В соответствии с указанными требованиями для контроля тилозина разработаны методики, использующие ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием [17, 18], инфракрасную спектроскопию [19] и др., характеризующиеся высокой чувствительностью и селективностью и дающие возможность подтвердить структуру определяемого соединения [20–22]. Однако из-за необходимости использования дорогого специализированного оборудования, сложной пробоподготовки (включающей как жидкостную, так и твердофазную экстракцию), высокой стоимости анализа и значительным временным интервалом между отбором проб и получением результатов данные методики непригодны для широкомасштабного первичного скринингового тестирования. Эта задача решается при использовании альтернативных методов – иммунохимических, позволяющих минимизировать либо исключить пробоподготовку, быстро осуществлять необходимые взаимодействия в присутствии компонентов тестируемых проб и регистрировать их результаты простыми, в том числе портативными (переносными), детекторами [23–25]. При контроле антибиотиков, в том числе тилозина, в пищевой продукции наиболее широко применяют иммуноферментный анализ (ИФА) [26–28], иммунохроматографический анализ (ИХА) [29–31] и поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) [32] Особенностью ПФИА, отличающей его от ИФА и ИХА, является проведение всех взаимодействий в растворе без диффузионно-контролируемого формирования детектируемых комплексов на поверхности носителя и без разделения прореагировавших и непрореагировавших компонентов реакционной смеси. При этом формирование иммунных комплексов, отражающее наличие целевого аналита в пробе, регистрируется в режиме реального времени без дополнительных реагентов и взаимодействий. Эти особенности ПФИА делают его относительно простым и экспрессным методом, что определяет интерес к его применению для мониторинга безопасности пищевой продукции [33].

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ для определения низкомолекулярных антигенов основан на конкуренции между содержащимся в пробе аналитом и его производным, меченным флуорофором, за связывание с антителами. Реакционная смесь облучается плоскополяризованным светом, возбуждающим флуорофор, и регистрируется поляризация излучаемого света. Величина поляризации флуоресценции при постоянной температуре и вязкости зависит только от размеров флуоресцирующей молекулы или содержащего ее комплекса, поэтому при формировании комплекса антитела и аналита, меченного флуоресцентной меткой, поляризация флуоресценции изменяется, а степень этого изменения определяется концентрацией в пробе аналита, конкурирующего за связывание с антителом [33].

Основной областью применения ПФИА является медицинская диагностика – мониторинг уровней низкомолекулярных фармацевтических препаратов и регуляторов метаболизма в биологических жидкостях [34, 35]. В ряде работ показана эффективность ПФИА для контроля пищевой продукции на содержание остаточных количеств антибиотиков [36], токсинов [37], пестицидов [38], гормонов [39] и др. Для проведения ПФИА коммерчески доступны серийные стационарные приборы [33], однако для целей скрининга интересен компактный инструментарий, который может применяться во внелабораторных условиях. В частности, описаны примеры успешного применения в последние годы портативного детектора Sentry [40–42], но они ограничены небольшим числом аналитов и видов тестируемых проб.

Целью данного исследования является разработка методики поляризационного флуоресцентного иммуноанализа с использованием портативного детектора для определения тилозина и ее апробация для анализа проб мёда. Ранее такое сочетание регистрируемого параметра и средств измерений для иммуноопределения тилозина не применяли.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты. В работе использовали N-гидроксисукцинимид (N-ГС), N, N'-дициклогексилкарбодиимид (N, N-ДЦК), тилмикозин, линкомицин, клиндамицин, пирлимицин, спирамицин, эритромицин, вальнемулина гидрохлорид, тиамулин, стрептомицин, рокситромицин, спектиномицин, тилозина тартрат (Sigma Aldrich, США), азид натрия (Serva, США), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Fluka, Швейцария), полный и неполный адъюванты Фрейнда (InvivoGen, Франция), О-(карбоксиметил)гидроксиламин полухлорид (КМО) (Sigma Aldrich, США), тиосемикарбазид флуоресцеина (Fluka, Швейцария), сульфат и гидросульфат натрия (Sigma Aldrich, США), этилацетат (Scharlau, Германия), дихлорметан, метанол, диметилформамид (ДМФА), глицерин (Реахим, Россия), триэтиламин (Merck, Германия), хлороформ ос. ч. (Химмед, Россия).

Материалы и оборудование. Конъюгат тилозин-флуоресцеин (ТИЛ-ФЛУ) очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле 60 (0.063–0.200 мм, 70–230 mesh) (Merck, Германия), для тонкослойной хроматографии (ТСХ) применяли пластины Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) [43]. Для измерений поляризации флуоресценции использовали портативный детектор Sentry 200 (Ellie, США), а для кинетических измерений – флуориметр BEACON2000 (Panvera, США). При обработке данных применяли программное обеспечение Origin (OriginLab, США).

Получение иммуногена. Для синтеза методом активированных эфиров [44] предварительно получали производное тилозина с О-(карбоксиметил)гидроксиламином следующим образом: 5 мг КМО и 2 мг гидросульфата натрия растворяли в 1 мл деионизованной воды. Полученный раствор по каплям добавляли в метанольный раствор тилозина тартрата (53 мг/мл) и перемешивали в течение 2.5 ч при комнатной температуре. После окончания реакции смесь сушили под вакуумом. Полученный остаток растворяли в 1 мл дихлорметана, добавляли 0.5 мл этанола и 1 г безводного сульфата натрия. Смесь оставляли на ночь при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После фильтрации растворитель испаряли при 60 оC.

15 мг синтезированного ТИЛ-КМО, 4 мг N, N'-ДЦК и 2 мг N-ГС растворяли в 1 мл ДМФА и перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. Активированный ТИЛ-КМО по каплям добавляли к 1 мл раствора БСА (10 мг/мл) в 50 мМ карбонатном буферном растворе (рН 9.5) и перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. Непрореагировавшие компоненты удаляли диализом против 50 мM фосфатно-солевого буферного раствора (рН 7.2).

Получение антисывороток. Кроликов иммунизировали путем внутрикожного введения конъюгатов ТИЛ-БСА. Эксперименты проводили в соответствии с этическими принципами, изложенными в Европейской директиве (2010/63/ЕС). Вначале 100 мкг ТИЛ-БСА в виде эмульсии в полном адъюванте Фрейнда вводили в несколько точек на спине. Далее иммуноген вводили с интервалом в 4 недели по 20–50 мкг с использованием неполного адъюванта Фрейнда с добавкой стерильного 0.9%-ного раствора хлорида натрия в соотношении 1:1. Через неделю после каждой иммунизации у кроликов отбирали порцию крови из краевой вены уха; сыворотку отделяли, добавляли к ней глицерин в соотношении 1:1 и хранили при –20 оC.

Получение конъюгата тилозина с флуоресцентным маркером. Синтез проводили, как описано в работе [43]. Раствор тилозина с концентрацией 20 мг/мл в 0.4 М ацетатном буферном растворе (рН 4.7) смешивали с водным раствором флуоресцеин-5-тиосемикарбазида с концентрацией 10 мг/мл в объемном соотношении 1:1. Смесь перемешивали при 50 °C в течение 12 ч, после чего 5%-ным раствором NaHCO3 доводили рН до 8.5 и экстрагировали продукт синтеза этилацетатом. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали на роторном испарителе. Полученное маслянистое вещество желтого цвета очищали колоночной хроматографией в системе растворителей метанол–хлороформ (1:4, по объему) и затем проводили элюирование метанолом. Выход составил 70%. ТСХ: Rf(CHCl3–MeOH, 4:1) 0.41, Rf(CHCl3–MeOH, 5:1) 0.24, Rf(CHCl3–MeOH–AcOH, 60:10:1) 0.09; τ(ВЭЖХ) = 14.5 мин (градиент 20–80% ацетонитрила в 0.01%-ной водной трифторуксусной кислоте за 30 мин); флуоресценция (0.1 М Трис с pH 9.0): λex = 492 нм, λem = 516 нм; MALDI MS, m/z вычислено для C67H91N4O21S+, 1 319.6, найдено 1 317.5.

Концентрацию конъюгата определяли, используя молярный коэффициент поглощения флуоресцеина ε491 = 8.7 × 104 М–1 см–1 [45].

Определение рабочей концентрации конъюгата тилозин-флуоресцеин. Готовили серии разведений конъюгата ТИЛ-ФЛУ в 50 мM боратном буферном растворе (рН 8.5) (ББ) и измеряли их поляризацию флуоресценции с помощью портативного детектора Sentry 200 при длине волны возбуждения 495 нм и регистрации эмиссии при 530 нм. Критерием выбора рабочей концентрации конъюгата ТИЛ-ФЛУ являлось превышение фонового значения сигнала в 10 раз (фоновым значением сигнала считали значение флуоресценции буферного раствора).

Характеристика взаимодействия конъюгата тилозин-флуоресцеин с антисыворотками. Рабочее разведение антисывороток определяли следующим образом. В пробирках из боросиликатного стекла готовили серию разведений антисывороток от 1:100 до 1:1 000 в ББ в объеме 500 мкл. К ним добавляли по 500 мкл раствора конъюгата ТИЛ-ФЛУ с концентрацией 5 нМ в том же буферном растворе, выдерживали при комнатной температуре 5 мин и измеряли поляризацию флуоресценции с помощью портативного детектора Sentry 200. Все эксперименты выполняли в двух повторах.

Изучение кинетики взаимодействия тилозин-флуоресцеин с антисывороткой. К 500 мкл конъюгата ТИЛ-ФЛУ в выбранном разведении добавляли 500 мкл антисыворотки против тилозина в разведении 1:1000 в ББ и с использованием флуориметра BEACON2000 измеряли поляризацию флуоресценции в течение 25 мин с 30-секундными интервалами.

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ. В стеклянные пробирки вносили по 50 мкл растворов тилозина в воде (0, 0.001, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 мкг/мл) и 500 мкл раствора конъюгата ТИЛ-ФЛУ с концентрацией 5 нМ в ББ. Затем добавляли 500 мкл антисыворотки против тилозина в выбранном разведении и через 10 мин регистрировали поляризацию флуоресценции с помощью портативного детектора Sentry 200. Каждое измерение проводили в трех повторах.

Определение аналитических характеристик поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Зависимость поляризации флуоресценции от концентрации тилозина (градуировочную кривую) строили в полулогарифмических координатах и аппроксимировали с помощью четырехпараметрической сигмоидной функции. Значения IC10, IC20, IC50, IC80 рассчитывали как концентрации, снижающие аналитический сигнал на 10, 20, 50 и 80% соответственно. Значение IC10 оценивали как предел обнаружения, IC20–IC80 – рабочий диапазон определяемых концентраций. Значения кросс-реактивности рассчитывали по формуле: CR(%) = IC50(ТИЛ)/IC50(аналог) × 100%.

Подготовку образцов мёда проводили, как описано в работе [22], с некоторыми модификациями. В полипропиленовые пробирки емк. 2 мл помещали 0.3 г мёда и добавляли аликвоты от 0 до 20 мкл раствора тилозина с концентрацией 100 мкг/мл. Образцы перемешивали на вихревом смесителе Vortex-1 (IKA, Германия) в течение 1 мин. Затем в каждую пробирку вносили 750 мкл 5 М водного раствора ацетата натрия, инкубировали 30 мин при 37 оC, затем вносили 750 мкл ацетонитрила. Экстракцию проводили в течение 30 мин и центрифугировали при 3 500 g в течение 10 мин. Отбирали 650 мкл верхнего органического слоя, упаривали его до удаления растворителя, сухой остаток растворяли в 650 мкл деионизованной воды и перемешивали. Полученный экстракт перед анализом разводили в пять раз ББ.

С помощью портативного детектора Sentry 200 регистрировали поляризацию флуоресценции в трех повторах для каждого образца и на основании градуировочной кривой ПФИА определяли концентрации тилозина. Соответствие между введенными и обнаруженными концентрациями тилозина оценивали в процентах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунизация животных и получение антисывороток. Тилозин относится к низкомолекулярным соединениям, его молярная масса составляет 916 г/моль. Для выработки иммунного ответа синтезировали конъюгат тилозина с белком-носителем – бычьим сывороточным альбумином – с соотношением гаптен: белок при синтезе 100:1. Проводили иммунизацию малыми дозами – 20–100 мкг/кролика, такой способ хорошо зарекомендовал себя ранее при получении поликлональных антител против фторхинолонов [46]. В результате от одного кролика получали серию антисывороток, отличавшихся количеством недель с начала иммунизации – 8, 10, 16, 18 и 21. Далее данные антисыворотки обозначены № 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно.

Синтез и очистка конъюгатов производного тилозина с флуоресцентной меткой. Для введения флуоресцентной метки в молекулу тилозина выбрали альдегидную группу С20, что позволило получить конъюгат в мягких условиях с хорошим выходом без предварительной защиты функциональных групп антибиотика [43].

Согласно [43] получили конъюгат тилозина с флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом (ТИЛ-ФЛУ) (схема 1), очищенный колоночной хроматографией на силикагеле 60. Выход синтеза составил 70%. Препарат растворяли в метаноле и далее для иммуноанализа разбавляли ББ.

 

Схема 1. Структура конъюгата тилозина с флуоресцеином.

 

Изучение взаимодействия конъюгата тилозин–флуоресцеин с антисыворотками. Взаимодействие синтезированного конъюгата ТИЛ-ФЛУ со специфическими антителами в антисыворотках регистрировали по изменению поляризации флуоресценции. При этом использовали разведения препаратов антисывороток от 100 до 1 200 (данные не приведены), критерием выбора разведения было значение поляризации флуоресценции на уровне 120 mP. Разбавленные антисыворотки смешивали с раствором конъюгата ТИЛ-ФЛУ и через 10 мин измеряли поляризацию флуоресценции. Данная величина возрастала, что свидетельствовало о связывании антител с конъюгатом ТИЛ-ФЛУ. В качестве отрицательного контроля использовали неиммунную сыворотку кролика, смешивание конъюгата ТИЛ-ФЛУ с которой показало низкие значения поляризации флуоресценции – 53±2 mP. Для сывороток, содержащих антитела к тилозину, наблюдалось изменение поляризации флуоресценции в зависимости от их разведения (рис. 1). Для дальнейшего осуществления конкуренции между меченым тилозином (ТИЛ-ФЛУ) и свободным тилозином за центры связывания антител использовали разведения антисывороток, обеспечивающие 50%-ное ингибирование сигнала (параметр IC50). Данные величины составили: 1: 1 050 для антисыворотки № 1, 1:1 070 для антисыворотки № 2, 1:750 для антисыворотки № 3, 1:700 для антисыворотки № 4 и 1:400 для антисыворотки № 5. Как видно, наибольшими разведениями характеризовались препараты № 2 и № 1.

 

Рис. 1. Изменения поляризации флуоресценции при взаимодействии конъюгата тилозин-флуоресцеин (конечная концентрация 2.5 нМ) с антисыворотками в разных разведениях в боратном буферном растворе. 25 оC, n = 2.

 

Выбор времени взаимодействия конъюгата тилозин–флуоресцеин с антисывороткой. Для изучения кинетики взаимодействия с конъюгатом ТИЛ-ФЛУ использовали антисыворотку № 1 и 5 нМ раствор конъюгата, обеспечивающий десятикратное превышение фонового сигнала. При формировании комплекса антитело–ТИЛ-ФЛУ меняется поляризация флуоресценции. В первые 3 мин наблюдается интенсивный рост сигнала (рис. 2), который затем замедляется и после 6 мин переходит в область плато, стабилизируясь в течение последующих нескольких минут. Время взаимодействия 10 мин выбрали в качестве оптимального и использовали для ПФИА тилозина.

 

Рис. 2. Кинетика связывания конъюгата тилозин-флуоресцеин (2.5 нМ) с антисывороткой № 1 (разведение 1: 1000 в боратном буферном растворе). 25 °C, n = 2.

 

Характеристика поляризационного флуоресцентного иммуноанализа тилозина. После выбора необходимых разведений антисывороток использовали их в конкурентной схеме. Для этой цели к разбавленной антисыворотке добавляли раствор тилозина (в разных концентрациях) в ББ, рабочий раствор конъюгата ТИЛ-ФЛУ и через 10 мин измеряли поляризацию флуоресценции. Полученные градуировочные зависимости (рис. 3) имеют S-образную форму и расположены близко друг к другу. Однако по параметрам кривой (IC10, IC20, IC50, IC80) – см. табл. 1 – наблюдаются различия. Для антисыворотки № 1 получены наименьшее значение предела обнаружения (IC10) 51.3 нг/мл, а также наиболее широкий диапазон определяемых концентраций (IC20–IC80) – от 101.5 до 1 050 нг/мл. Значения sr для соответствующей градуировочной кривой составили от 1.5 до 2.3%. Данную антисыворотку выбрали для дальнейшей работы.

 

Рис. 3. Градуировочные зависимости для определения тилозина методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в боратном буферном растворе (n = 3).

 

Таблица 1. Аналитические характеристики определения тилозина методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа с использованием различных антисывороток (n = 3)

Номер антисыворотки

Предел обнаружения, нг/мл

IC20, нг/мл

IC80, нг/мл

IC50, нг/мл

1

51.3

101.5±1.0

1050±1.2

326.5±1.5

2

56.8

91.9±1.5

476.3±1.4

209.2±1.9

3

64.1

109.7±1.2

688.6±2.1

274.9±2.0

4

56.6

85.6±0.9

353.5±1.3

174.0±1.4

5

62.0

95.5±1.4

419.6±1.5

200.2±1.2

 

Установили, что для работы с образцами мёда из-за влияния компонентов матрикса и после проведения экстракции во избежание ухудшения чувствительности ПФИА требуется увеличить содержание антисыворотки в реакционной смеси. Опробовали разведения от 1:100 до 1:1 000 ББ; наилучших аналитических характеристик достигли при использовании антисыворотки № 1 с разведением 1:400 – см. градуировочную кривую на рис. 4. Предел обнаружения тилозина составил 34.7 нг/мл, IC50–191.8 нг/мл, а рабочий диапазон определяемых концентраций (IC20–IC80) – 65.2–564.0 нг/мл. Отметим, что подбор условий проведения ПФИА с учетом особенностей тестируемого матрикса сопровождался нехарактерными изменениями аналитических характеристик – несмотря на возросшее содержание антител в реакционной смеси, несколько (в 1.5 раза) снизился предел обнаружения – с 51.3 нг/мл до 34.7 нг/мл. Аналогичные изменения произошли с рабочим диапазоном – он сдвинулся в область более низких концентраций. Возможное объяснение этого эффекта состоит в поликлональности антител, вследствие чего вклад низко- и высокоаффинных фракций в формирование детектируемых комплексов неодинаков при разных разведениях. Отметим также высокую точность измерений – значения sr не превышали 2.5%, что значительно ниже, чем в других полевых методов.

 

Рис. 4. Градуировочная зависимость для определения тилозина методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в боратном буферном растворе с использованием антисыворотки № 1 в разведении 1:400 (n = 3).

 

Для оценки селективности ПФИА вместо целевого аналита использовали антибиотики разных классов – тилмикозин, линкомицин, клиндамицин, пирлимицин, спирамицин, эритромицин, вальнемулин, тиамулин, стрептомицин, рокситромицин, спектиномицин. Для всех этих соединений кросс-реактивность не превосходила 0.1% (отсутствовали достоверные изменения сигнала при концентрациях 1 000 нг/мл), т. е. ПФИА высокоспецифичен по отношению к тилозину.

Анализ образцов мёда методом введено–найдено. Для экспериментов использовали образцы мёда из различных цветочных групп и регионов, в которых отсутствие тилозина было ранее подтверждено методом ВЭЖХ–МС [18]. Отобранные отрицательные образцы хранили при +4 оC до проведения анализа. Использовали только жидкую часть мёда без нерастворимых включений – фрагментов воска, кусочков прополиса, пыльцы и др. Для экстракции компонентов и введения в образец известного количества тилозина использовали равные объемы ацетонитрила и 5 М раствора ацетата натрия, образующих двухфазную систему. Такая смесь позволяет, с одной стороны, растворять сахара и переводить углеводную часть мёда в водную фазу экстрагирующей смеси, с другой – переводить целевой аналит в органическую фазу без потерь [22]. В результате отбора 86.7% от полученного органического экстракта (650 мкл от общего объема 750 мкл), последующего высушивания и повторного растворения экстрагированных компонентов пробы, а также разведения пробы перед проведением ПФИА тилозин из исходной пробы в 0.3 г перевели в объем 3.25 мл.

Как видно из табл. 2, в таких препаратах после экстракции, повторного растворения и концентрирования (с учетом доли тестируемого экстракта) разработанной методикой ПФИА выявляется 98.0–103.8% добавленного количества тилозина.

 

Таблица 2. Уровень открытия тилозина в меде методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в экспериментах введено–найдено (n = 2)

№ пробы

Введено, мг/кг

Найдено, мг/кг

Процент открытия,%

1

0

0

н.о.

2

1.67

1.42±0.05

99.2±3.0

3

3.33

2.99±0.04

103.8±1.0

4

6.67

5.66±0.05

98.0±1.0

 

Таким образом, разработанная методика ПФИА характеризуется проcтотой, экспрессностью, приемлемым диапазоном определяемых концентраций, высокой воспроизводимостью и поэтому перспективна для контроля безопасности мёда.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант 20-76-10033.

×

Авторлар туралы

С. Еремин

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: zhakh@geokhi.ru

химический факультет, Институт биохимии им. А.Н. Баха

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3; 119071, Москва, Ленинский проспект, 33

Л. Мухаметова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: zhakh@geokhi.ru

химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3

Д. Арутюнян

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: zhakh@geokhi.ru

химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3

А. Терещенков

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Email: zhakh@geokhi.ru
Ресей, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40

Н. Сумбатян

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: zhakh@geokhi.ru

химический факультет

Ресей, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3

А. Прийма

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Email: zhakh@geokhi.ru
Ресей, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5

И. Нестеренко

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Email: zhakh@geokhi.ru
Ресей, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5

А. Берлина

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: zhakh@geokhi.ru

Институт биохимии им. А.Н. Баха

Ресей, 119071, Москва, Ленинский проспект, 33

Д. Сотников

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: zhakh@geokhi.ru

Институт биохимии им. А.Н. Баха

Ресей, 119071, Москва, Ленинский проспект, 33

Әдебиет тізімі

  1. De Briyne N., Atkinson J., Borriello S.P., Pokludová L. Antibiotics used most commonly to treat animals in Europe // Vet. Rec. 2014. V. 175. № 13. P. 325.
  2. Barton M.D. Antibiotic use in animal feed and its impact on human healt // Nutr. Res. Rev. 2000. V. 13. № 2. P. 279.
  3. Cazer C.L., Eldermire E.R., Lhermie G., Murray S.A., Scott H.M., Gröhn Y.T. The effect of tylosin on antimicrobial resistance in beef cattle enteric bacteria: A systematic review and meta-analysis // Prev. Vet. Med. 2020. V. 176. Article 104934.
  4. Kim J., Ahn J. Emergence and spread of antibiotic-resistant foodborne pathogens from farm to tablу // Food Sci. Biotechnol. 2022. V. 31. № 12. P. 1481.
  5. Ghimpețeanu O.M., Pogurschi E.N., Popa D.C., Dragomir N., Drăgotoiu T., Mihai O.D., Petcu C.D. Antibiotic use in livestock and residues in food – A public health threat: A review // Foods. 2022. V. 11. № 10. Article 1430.
  6. Liu C., Li B., Liu M., Mao S. Demand, status, and prospect of antibiotics detection in the environment. // Sens. Actuators B: Chem. 2022. V. 369. Article 132383.
  7. Virto M., Santamarina-García G., Amores G., Hernández I. Antibiotics in dairy production: Where is the problem? // Dairy. 2022. V. 3. P. 541.
  8. Bargańska Ż., Namieśnik J., Ślebioda M. Determination of antibiotic residues in honey // Trends Anal. Chem.. 2011. V. 30. № 7. P. 1035.
  9. Orso D., Floriano L., Ribeiro L.C., Bandeira N.M., Prestes O.D., Zanella R. Simultaneous determination of multiclass pesticides and antibiotics in honey samples based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Food Anal. Methods. 2016. V. 9. P. 1638.
  10. De Liguoro M., Cibin V., Capolongo F., Halling-Sørensen B., Montesissa C. Use of oxytetracycline and tylosin in intensive calf farming: Evaluation of transfer to manure and soil // Chemosphere. 2003. V. 52. № 1. P. 203.
  11. Thompson T.S., Pernal S.F., Noot D.K., Melathopoulos A.P., van den Heever J.P. Degradation of incurred tylosin to desmycosin – Implications for residue analysis of honey // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 586. № 1–2. P. 304.
  12. Mitchell S.M., Ullman J.L., Teel A.L., Watts R.J. Hydrolysis of amphenicol and macrolide antibiotics: Chloramphenicol, florfenicol, spiramycin, and tylosin // Chemosphere. 2015. V. 134. P. 504.
  13. Wijayanti A.D., Ardiansyah R.D., Pratama A.M., Haryanto A., Fitriana I. Validation method for determining enrofloxacin and tylosin levels in broiler liver, kidney, and muscle using high-performance liquid chromatography // Vet. World. 2022. V. 15. № 2. P. 268.
  14. Reybroeck W., Daeseleire E., De Brabander H.F., Herman L. Antimicrobials in beekeeping // Vet. Microbiol. 2012. V. 158. № 1. P. 1.
  15. Cripps C.J. Veterinary regulations / Honey Bee Medicine for the Veterinary Practitioner. 1st Ed. / Eds. Kane T.R., Faux C.M. John Wiley & Sons, Inc., 2021. P. 191.
  16. Технический регламент Таможенного союза “О безопасности пищевой продукции” (с изменениями на 14 июля 2021 года) ТР ТС 021/2011. 173 с.
  17. Xu J., Yang M., Wang Y., Yang Y., Tu F., Yi J., Lu H., Jiang X., Chen D. Multiresidue analysis of 15 antibiotics in honey using modified QuEChERS and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry // J. Food Compost. Anal. 2021. V. 103. Article 104120.
  18. Granja R., Nio A.M., Zucchetti R., Nio R.M., Patel R., Salerno A.G. Determination of erythromycin and tylosin residues in honey by LC/MS/MS // J. AOAC Int. 2009. V. 92. № 3. P. 975.
  19. De Freitas A.G.M., Minho L.A.C., de Magalhães B.E.A., Dos Santos W.N.L., Santos L.S., de Albuquerque Fernandes S.A. Infrared spectroscopy combined with random forest to determine tylosin residues in powdered milk // Food Chem. 2021. V. 365. Article 130477.
  20. Di Corcia A., Nazzari M. Liquid chromatographic–mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal food products // J. Chromatogr. A. 2002. V. 974. № 1. P. 53.
  21. Peris-Vicente J., Peris-García E., Albiol-Chiva J., Durgbanshi A., Ochoa-Aranda E., Carda-Broch S., Bose D., Esteve-Romero J. Liquid chromatography, a valuable tool in the determination of antibiotics in biological, food and environmental samples // Microchem. J. 2022. V. 177. Article 107309.
  22. Thompson, T.S., van den Heever J.P., Komarnicki J.A.F. Tylosin A and desmycosin in honey by salting-out assisted liquid-liquid extraction and aqueous normal phase ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Anal. Bioanal. Chem. 2019. V. 411. № 24. P. 6509.
  23. Ahmed S., Ning J., Peng D., Chen T., Ahmad I., Ali A., Lei Z., Abu bakr Shabbir M., Cheng G., Yuan Z. Current advances in immunoassays for the detection of antibiotics residues: A review // Food Agric. Immunol. 2020. V. 31. № 1. P. 268.
  24. Dzantiev B.B., Byzova N.A., Urusov A.E., Zherdev A.V. Immunochromatographic methods in food analysis // Trends Anal. Chem. 2014. V. 55. P. 81.
  25. Lei H., Wang Z., Eremin S.A., Liu Z. Application of antibody and immunoassay for food safety // Foods. 2022. V. 11. № 6. Article 826.
  26. Gaudin V., Hedou C., Verdon E. Validation of two ELISA kits for the screening of tylosin and streptomycin in honey according to the European decision 2002/657/EC // Food Addit. Contam. Part A: Chem. 2013. V. 30. № 1. P. 93.
  27. Peng D., Ye S., Wang Y., Chen D., Tao Y., Huang L., Liu Z., Dai M., Wang X., Yuan Z. Development and validation of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the screening of tylosin and tilmicosin in muscle, liver, milk, honey and eggs // J. Agric. Food Chem. 2012. V. 60. № 1. P. 44.
  28. Burkin M., Galvidis I. Simultaneous separate and group determination of tylosin and tilmicosin in foodstuffs using single antibody-based immunoassay // Food Chem. 2012. V. 132. № 2. P. 1080.
  29. Yang J., Wang Y., Zhang Y., Zeng X., Liu J., Tian Y., Wang H., Xu Z., Shen Y. Reverse distal similarity of hapten structure enhancing antibody’s group-specificity: Development of an immunochromatographic strip for tylosin and tilmicosin in milk and water // J. Food Compost. Anal. 2023. V. 116. Article 105068.
  30. Hendrickson O.D., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Godjevargova T., Xu C., Dzantiev B.B. Development of a double immunochromatographic test system for simultaneous determination of lincomycin and tylosin antibiotics in foodstuffs // Food Chem. 2020. V. 318. Article 126510.
  31. Li X., Wu X., Wang J., Hua Q., Wu J., Shen X., Sun Y., Lei H. Three lateral flow immunochromatographic assays based on different nanoparticle probes for on-site detection of tylosin and tilmicosin in milk and pork // Sens. Actuators B: Chem. 2019. V. 301. Article 127059.
  32. Бакай К.А., Прийма А.Д., Сафронова В.А., Нестеренко И.С. Разработка экспресс-методики для определения тилозина в продукции животноводства // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. 2021. V. 82. P. 34.
  33. Hendrickson O.D., Taranova N.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Eremin S.A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons // Sensors. 2020. V. 20. № 24. Article 7132.
  34. Bojescu E.D., Prim D., Pfeifer M.E., Segura J.M. Fluorescence-polarization immunoassays within glass fiber micro-chambers enable tobramycin quantification in whole blood for therapeutic drug monitoring at the point of care // Anal. Chim. Acta. 2022. V. 1225. Article 340240.
  35. Qiu P., Song Z. Determination of nicotinic acid in food and pharmaceuticals by a simple and rapid fluorescence polarization immunoassay (FPIA) // Anal. Lett. 2023. V. 1225. Article 340240.
  36. Zhang Y., Duan C., Li Q., Bai Y., Dong B., Tang Y., He M., Hao C., Wen K., Shen J., Wang Z. Fluorescence polarization immunoassay based on fragmentary hapten for rapid and sensitive screening of polymyxins in human serum // Sens. Actuators B: Chem. 2022. V. 370. Article 132404.
  37. Lippolis V., Porricelli A.C., Mancini E., Ciasca B., Lattanzio V.M., De Girolamo A., Maragos C.M., McCormick S., Li P., Logrieco A.F., Pascale M. Fluorescence polarization immunoassay for the determination of T-2 and HT-2 toxins and their glucosides in wheat // Toxins. 2019. V. 11. № 7. Article 380.
  38. Ding Y., Chen H., Yang Q., Feng L., Hua X., Wang M. A fluorescence polarization immunoassay for detection of thiacloprid in environmental and agricultural samples // RSC Adv. 2019. V. 9. № 63. P. 36825.
  39. He S., Liang D., Xiong J., Wang Z., Zheng P., Zhang H., Ren Z., Jiang H. Development of a sensitive and rapid fluorescence polarization immunoassay for high throughput screening eight glucocorticoids in beef // J. Pharm. Biomed Anal. 2022. V. 214. Article 114719.
  40. Мухаметова Л.И., Еремин С.А., Арутюнян Д.А., Горяйнова О.С., Иванова Т.И., Тиллиб С.В. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ лактоферрина человека в молоке с использованием однодоменных антител // Биохимия. 2022. Т. 87. № 12. С. 2065.
  41. Chen Y., He Q., Shen D., Jiang Z., Eremin S.A., Zhao S. Fluorescence polarization immunoassay based on a new monoclonal antibody for the detection of the diisobutyl phthalate in yoghurt // Food Control. 2019. V. 105. P. 38.
  42. Raysyan A., Eremin S.A., Beloglazova N.V., De Saeger S., Gravel I.V. Immunochemical approaches for detection of aflatoxin B1 in herbal medicines // Phytochem. Anal. 2020. V. 31. № 5. P. 662.
  43. Терещенков А.Г., Шишкина А.В., Карпенко В.В., Чертков В.А., Коневега А.Л., Касацкий П.С., Богданов А.А., Сумбатян Н.В. Новые флуоресцентные производные макролидов для изучения взаимодействия антибиотиков и их аналогов с рибосомным туннелем // Биохимия. Т. 81. № 10. С. 1439.
  44. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, 2nd Ed. Academic Press, 2008. 1323 p.
  45. DeRose P.C., Kramer G.W. Bias in the absorption coefficient determination of a fluorescent dye, standard reference material 1932 fluorescein solution // J. Lumin. 2005. V. 113. № 3. P. 314.
  46. Нестеренко И.С., Бакай К.А., Прийма А.Д., Сафронова В.А., Сарханова А.А., Беляцкая А.В. Разработка методики конкурентного иммуноферментного анализа для определения остаточных количеств фторхинолонов в продукции животноводства // Ветеринария. 2022. V. 1. P. 59.

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Scheme 1. Structure of tylosin conjugate with fluorescein.

Жүктеу (16KB)
Метадеректер
3. Fig. 1. Changes in the polarization of fluorescence during the interaction of the tylosin-fluorescein conjugate (final concentration 2.5 nM) with antiserum in different dilutions in a borate buffer solution. 25 oSb n = 2.

Жүктеу (16KB)
Метадеректер
4. Рис. 2. Кинетика связывания конъюгата тилозин-флуоресцеин (2.5 нМ) с антисывороткой № 1 (разведение 1: 1000 в боратном буферном растворе). 25 °C, n = 2.

Жүктеу (9KB)
Метадеректер
5. Рис. 3. Градуировочные зависимости для определения тилозина методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в боратном буферном растворе (n = 3).

Жүктеу (13KB)
Метадеректер
6. Fig. 4. Calibration dependence for the determination of tylosin by polarization fluorescent immunoassay in borate buffer solution using antiserum No. 1 in a dilution of 1:400 (n = 3).

Жүктеу (10KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».