Stimulating effect of low concentrations of Eu³⁺ on spontaneous cardiac contractions

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Лантаноиды, в том числе европий (Eu³⁺), широко применяются в современной медицине и диагностике [1–4]. Легированные Eu³⁺ наночастицы NaYF₄ используются в технологии направленной доставки нейротрансмиттеров в синаптосомы для изучения потенциального токсического эффекта на эндотелиальные клетки [5]. Оксид Eu³⁺ служит также в качестве активатора люминофоров [6, 7]. Лантаноиды могут стимулировать нейрогенез [8] и использоваться в качестве препаратов для тераностики в современной медицине [9]. Кроме того, катионные люминесцентные комплексы Eu³⁺ используются для визуализации изменений концентрации ряда биологически активных молекул, локальных температурных градиентов, а также структуры органелл при исследовании клеток in vitro [10–13]. В этой связи возникает необходимость тщательного и всестороннего изучения влияния лантаноидов на организм человека. Считается, что редкоземельные металлы, включая Eu³⁺, малотоксичны [14], однако следует принять во внимание тот факт, что лантоноиды способны к биоаккумуляции, что может значительно увеличивать их токсичность [15]. На животных моделях было продемонстрировано, что лантаноиды в высокой концентрации токсичны для электровозбудимых клеток [16–19]. Ранее нами было показано, что в сердечной мышце лантаноиды в высокой концентрации обладают отрицательным хроно- и инотропным действием, снижают энергетическую функцию митохондрий сердца [17–19]. Однако в некоторых работах отмечался положительный эффект лантаноидов на работу сердечной мышцы, что может быть связано с их влиянием на Са²⁺-зависимые процессы [20–24]. Ранее нами также отмечалось, что ионы Eu³⁺ при определенных экспериментальных условиях могут стимулировать спонтанные сердечные сокращения [19]. Поэтому целью данной работы являлось дальнейшее изучение этого эффекта in situ на спонтанные сокращения мышечных препаратов сердца как в норме, так и в присутствии ингибитора митохондриального дыхания азида натрия, а также непосредственно на митохондрии, выделенные из сердца крысы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось с использованием двух экспериментальных моделей: мышечных препаратов, полученных из изолированных предсердий сердца самцов лягушки Rana ridibunda и митохондрий, выделенных из целого сердца самцов крыс линии Вистар. Выбор сердца лягушки Rana ridibunda в качестве экспериментальной модели связан, с одной стороны, с большей устойчивостью изолированных мышечных препаратов сердца лягушки, позволяющих, в отличие от аналогичных препаратов теплокровных животных, регистрировать спонтанные сокращения на протяжении длительного периода. С другой стороны, общность физиологических процессов, лежащих в основе сердечной деятельности холоднокровных и теплокровных животных [25], позволяет производить сравнение между разными типами животных. Выбор изолированных митохондрий сердца крысы обусловлен необходимостью визуализации энергетических процессов, происходящих в этих органеллах под воздействием изучаемых нами веществ. Эксперименты in situ проводили на взрослых самцах Rana ridibunda в феврале–марте.

Регистрацию сокращений осуществляли с помощью тензодатчиков, передающих сократительный сигнал с мышечного препарата на компьютер. Обработка сигнала от тензодатчиков производилась в программе WinPulse, сила сокращения выражалась в Ньютонах (Н). Учитывали следующие параметры сокращения: максимальное сокращение (F_max, мН); частота сокращений (Hz); максимальная скорость нарастания силы сокращения (V_max, мН/с); время, необходимое мышце для достижения максимальной силы сокращения (t, с), и период полурасслабления (t_1/2rel, с). Регистрацию сокращений предсердий проводили в изометрическом режиме при 20°С. Нитрат европия (Eu(NO₃)₃) был приготовлен в виде 100 мМ сток-раствора, который добавляли в нормальный физиологический раствор для холоднокровных животных (раствор Рингера) перед экспериментом до конечных концентраций 0.2 мМ и 1 мМ. Инкубация предсердий с Eu³⁺ осуществлялась 6-7 мин. Параметры сокращений измеряли до аппликации Eu³⁺ и в конце инкубации с металлом. Параметры сокращений в одном опыте усреднялись из нескольких сокращений (около 30) в течение 1 мин. Инкубацию предсердий с азидом натрия (NaN₃) осуществляли около 9 мин в контроле и через 20 мин после отмывания 0.2 мМ Eu³⁺. В работе было использовано 4 лягушки для каждого эксперимента.

Митохондрии выделяли по стандартной методике, описанной ранее [17, 18]. Для выделения одного препарата митохондрий сердца крысы (МСК) использовали 8 самцов линии Вистар массой 200–250 г. Суммарная масса сердечной ткани была около 10 г [18]. Было проведено три независимых эксперимента. Дыхание митохондрий в различных энергетических состояниях определяли полярографическим методом по изменению скоростей поглощения кислорода при 26°С. Детальное описание метода и состав сред приведены в работах [17, 18]. Концентрации Eu³⁺ и Ca²⁺ при изучении их эффектов на митохондрии выбирали по результатам ранее проведённых экспериментов с другими лантаноидами [17–19]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистической программы Microsoft Origin 6.0 с достоверностью р <0.05. Достоверность различий между выборками определялась с помощью парного t‐критерия Стьюдента в опытах с митохондриями и непарного в опытах по сокращению. В опытах по сокращению использовали относительные величины, соответствующие значения параметров в контроле принимались за 100%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Действие Eu³⁺ на спонтанные сокращения предсердий

В четырех опытах при температуре 20°С нами было обнаружено, что ионы Eu³⁺ в концентрации 0.2 мМ могут оказывать стимулирующее действие на спонтанные сердечные сокращения. Однако при концентрации 1 мМ Eu³⁺ всегда вызывал отрицательный инотропный и хронотропный эффекты (рис. 1). Ранее нами был описан слабый ингибирующий эффект 0.2 мМ Eu³⁺ на сердечные сокращения при температуре 12°С. Однако и тогда в двух экспериментах из шести наблюдалась стимуляция сокращений [19]. Возможно, при низких температурах стимулирующий эффект низких концентраций Eu³⁺ проявляется с задержкой. Поэтому в данном исследовании мы используем температуру 20°С.

 

Рис. 1. Эффект двух различных концентраций Eu³⁺ (0.2 мМ и 1 мМ) на сокращения предсердий лягушки при температуре омывающего раствора 20°С. (a) – показана полная схема опыта; (b) – одиночные сокращения, соответствующие сокращениям, помеченными черными кружками на полной схеме опыта. W – отмывание предсердий от Eu³⁺. Концентрации Eu³⁺ и продолжительность инкубации с Eu³⁺ помечены горизонтальной линией под сокращениями. Горизонтальными метками вверху справа показано время, мин (a), миллисекунды (b). Сила, развиваемая предсердиями, откалибрована вертикальной меткой милиНьютоны (mN).

 

Феномен стимулирования спонтанных сокращений ионами Eu³⁺ в наибольшей степени проявлялся в отношении двух параметров: силы максимального сокращения (F_max, мН) и максимальной скорости нарастания силы сокращения (V_max, мН/с) (табл. 1).

Стимулирующий эффект ионов Eu³⁺ проявлялся в значительном увеличении амплитуды и скорости нарастания спонтанных сокращений предсердий, инкубируемых в среде с 0.2 мМ Eu³⁺ (рис. 1, табл. 1). На рис. 1b показана форма одиночных сокращений в контроле и при аппликации разных концентраций Eu³⁺. Из представленных на рис. 1b данных видно, что амплитуда одиночного сокращения мышечного препарата в среде с 0.2 мМ Eu³⁺ почти в два раза выше, чем в контроле. После реаппликации 1 мМ Eu³⁺ положительные хроно- и инотропные эффекты 0.2 мМ Eu³⁺ подавлялись, как видно из экспериментальных данных, представленных на рис. 1а.

 

Таблица 1. Эффекты 0.2 мМ Eu³⁺ на сокращения предсердий Rana ridibunda при температуре омывающего раствора 20°С

Концентрация Eu3+, мМ	Hz, %	Fmax, %	Vmax, %	t, %	t1/2rel, %
0.2 (n = 4)	102 ± 7	171 ± 22 *	191 ± 19 *	95 ± 2	98 ± 7

Примечание: Hz – частота спонтанных сокращений; F_max – амплитуда спонтанных сокращений; V_max – максимальная скорость нарастания силы одиночных сокращений; t – время, необходимое мышце для достижения максимальной силы сокращения; t_1/2rel – время полурасслабления. Соответствующие значения параметров в контроле, в физиологическом растворе без Eu³⁺, приняты за 100 %. Количество независимых экспериментов (n) равно 4. Достоверность отличия от контроля: * p < 0.05 (непарный t‐критерий).

 

Таким образом, ионы Eu³⁺ при концентрации 0.2 мМ могут оказывать стимулирующее действие на сердечные сокращения. Чтобы выяснить, насколько эти сокращения устойчивы к ингибиторам дыхания митохондрий, мы использовали азид натрия (NaN₃) – ингибитор 4-го митохондриального комплекса. На рис. 2 представлены данные, свидетельствующие об ингибирующем влиянии 1 мМ NaN₃ на сердечные сокращения в контроле и через 20 мин после отмывания предсердия от 0.2 мМ Eu³⁺.

 

Рис. 2. Влияние NaN₃ на сокращения предсердий лягушки при температуре омывающего раствора 20°С. Показаны полные схемы опыта (а, c) и соответствующие им одиночные сокращения (b, d), помеченные черными кружками на полной схеме опыта. (а) – контрольное сокращение, (c) – сокращение после аппликации 0.2 мМ Eu³⁺; через 20 мин после отмывания предсердия от 0.2 мМ Eu³⁺ добавили 1мМ NaN₃. Концентрация NaN₃ и продолжительность инкубации с NaN₃ помечены горизонтальной линией под сокращениями. Горизонтальными метками вверху справа показано время, секунды (a, c), миллисекунды (b, d). Сила, развиваемая предсердиями, откалибрована вертикальной меткой (mN).

 

Представленные на рис. 2 результаты демонстрируют ингибирующий эффект 1 мМ NaN₃ на параметры мышечного сокращения. Аппликация 5 мМ NaN₃ вызывала в наших условиях необратимое подавление сокращений и последующую контрактуру предсердий. Как видно из рис. 2, аппликация 0.2 мМ Eu³⁺ увеличивала устойчивость сердечных сокращений к токсическому действию 1 мМ NaN₃. Так, при аппликации 1 мМ NaN₃, в четырех независимых экспериментах, амплитуда спонтанных сокращений в контроле уменьшалась больше, чем в опыте после воздействия 0.2 мМ Eu³⁺ (50 ± 4%, n = 4, контроль vs. 27 ± 3% n = 4, 0.2 мМ Eu³⁺, р < 0.01, непарный t-тест) (рис. 2). Аналогичный эффект наблюдался в отношении V_max. В контроле, в растворе Рингера с 1 мМ NaN₃, V_max уменьшалась на 42 ± 6% (n = 4), а после воздействия 0.2 мМ Eu³⁺ всего на 21 ± 1% (n = 4, p < 0.05, непарный t-тест). Таким образом, помимо потенцирования сердечных сокращений, аппликация 0.2 мМ Eu³⁺ увеличивает устойчивость сердечных сокращений к влиянию азида натрия – ингибитора митохондриального дыхания.

Для дальнейшего изучения механизма действия Eu³⁺ на сердечные клетки и непосредственно на энергетическую функцию мы изучали влияние Eu³⁺ на дыхание изолированных митохондрий сердца крысы (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние Eu³⁺ и Ca²⁺ на скорость потребления кислорода митохондриями сердца крысы. Митохондрии (1 мг/мл белка) вносили в среду, содержащую 125 мМ KCl, 20 мМ Трис-MOPS (рН 7,3) и 3 мМ Трис-РО₄, а также (где указано) 10 мМ глутамат с 2 мМ малат ( G+M), 5 мМ сукцинат с 2 мкМ ротенона (Succ), 50 мкМ Eu³⁺ (Eu³⁺) и 200 мкМ Ca²⁺ (Ca²⁺). По оси ординат отмечены скорости потребления кислорода (нмоль О₂/мин/мг белка) в состоянии 3 и состоянии 3Р_ДНФ. Для индукции состояния 3 и состояния 3Р_ДНФ в среду, содержащую энергизованные митохондрии сердца крысы, последовательно добавляли вещества до концентраций 130 мкМ АДФ и 30 мкМ ДНФ. Обозначениями под осью абсцисс показаны состояние 3 (State 3) и состояние 3Р_ДНФ (State 3U_DNP). Звездочками отмечены достоверные отличия от контроля, опыты без Eu³⁺ и Ca²⁺ (p < 0.05, парный t-тест). Представлены средние значения результатов для трех независимых экспериментов.

 

На рис. 3 видно, что дыхание митохондрий сердца крысы, энергизованных субстратами 1-го (G+M) или 2-го (Succ) дыхательных комплексов, в состоянии 3 (субстрат и АДФ в среде) или в состоянии 3Р_ДНФ (в присутствии разобщителя 2,4-динитрофенола) практически не изменялось в опытах с Eu³⁺. При этом, дыхание мито хондрий в этих состояниях заметно уменьшались в аналогичных экспериментах с нагруженными кальцием митохондриями, независимо от наличия в среде Eu³⁺ (рис. 3). Минимальный эффект Ca²⁺ и Eu³⁺ наблюдался для энергизованных сукцинатом митохондрий в опытах с ДНФ (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В подавляющем числе работ, начиная с самых первых, отмечается негативное влияние лантаноидов на мышечные сокращения. Ингибирующее действие лантана объясняется тем, что он может блокировать Ca²⁺ каналы, препятствуя входу Ca²⁺ в клетку [26, 27], ингибировать как Ca²⁺-АТФазу плазматической мембраны [28, 29], так и Ca²⁺-АТФазу саркоплазматического ретикулума (СР) [30], а также работу Na⁺/Ca²⁺-обменника (NCX) [31, 32]. Лантан способен проникать внутрь клетки [29], например, через Na⁺/Ca²⁺-обменник [29], замещать Ca²⁺ во внутриклеточных компартментах и снижать концентрацию Ca²⁺ внутри клетки [33–35]. При изучении механизмов влияния лантаноидов на мышечные структуры было установлено, что основными мишенями лантаноидов являются NCX [31, 32], Са-АТ -Фазы [20, 30] и рианодиновые рецепторы (RyR) [21, 24]. Однако ответ сердечной мышцы на аппликацию лантоноидов зависит не только от свойств редкоземельного металла и силы его связывания с ферментом, в частности с Са²⁺-АТФазой или с сайтом связывания в каналообразующем белке, но и от его действующей концентрации, что определяет характер влияния редкоземельного металла на сокращение. Существует ограниченное число работ, в которых отмечены стимулирующие эффекты малых концентраций лантаноидов на мышцу. Так, Lа³⁺ в концентрациях 0.05-0.3 mM дозо-зависимо потенциировал одиночное сокращение скелетных мышц. Было показано увеличение амплитуды, скорости развития и времени релаксации одиночного сокращения скелетного мышечного волокна лягушки [36]. Однако аппликация высоких концентраций лантана (больше 0.5 mM) приводила к потере возбудимости и ингибированию сокращения скелетных мышц [36]. Авторы предполагают, что этот эффект связан с синергизмом в действии ионов лантана и сходного по размерам и свойствам ионов кальция, в связи с чем ионы Lа³⁺ могут замещать Са²⁺ в процессе сокращения, связываясь с теми же регуляторными сайтами, что и кальций [36]. Установлено, что La³⁺ в концентрации 1 мМ усиливал безнатриевую контрактуру сердечных клеток цыпленка [22]. Причем это усиление было обусловлено увеличением высвобождения внутриклеточного Са²⁺ из СР и нарушением кальциевого барьера плазматической мембраны [22]. В работе других авторов было показано, что La³⁺ и Gd³⁺ в концентрациях 0.1–0.2 мМ ингибируют сердечные сокращения, однако при отмывании лантаноидов отмечалось необычное усиление одиночных сердечных сокращений [23]. Причем данный эффект проявлялся в большей степени в сердечной мышце лягушки по сравнению с таковым в сердце теплокровных и мог наблюдаться длительное время [23]. Авторы объясняют этот эффект действием лантаноидов на плазматическую мембрану клетки, в частности, ингибированием работы NCX [23]. Недавно было показано, что лантаноиды при малых концентрациях могут действовать как агонисты Ca²⁺ каналов, в том числе и рианодиновых рецепторов [21, 24]. Так было отмечено, что при низкой концентрации кальция Eu³⁺ активировал RyR2, а при высокой – блокировал [21, 24].

Представленные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что Eu³⁺ в низкой концентрации может стимулировать сердечные сокращения. При стимуляции сокращений при малых концентрациях Eu³⁺ мы наблюдали положительный инотропный эффект (табл. 1), который мы объясняем синергизмом в действии Са²⁺ и Eu³⁺ и возможной стимуляцией Са²⁺-зависимых процессов в кардиомиоцитах (электромеханического сопряжения). На рисунке 1 видно, что после аппликации 0.2 мМ Eu³⁺ за ранним падением амплитуды следует значительное увеличение силы сокращений. Аналогичный эффект наблюдался при аппликации трехвалентного алюминия (3.75 мМ) при электрической стимуляции предсердий лягушки [37]. Потенциацию сокращения авторы объясняют увеличением высвобождения Са²⁺ из СР под влиянием алюминия, поскольку кофеин, опустошая СР, ингибировал потенциацию [37]. Вполне вероятно, что при воздействии низких концентраций Eu³⁺ также происходит увеличение высвобождения Са²⁺ из СР кардиомиоцитов при каждом акте сокращения, возможно, за счет стимуляции Eu³⁺ RyR2.

La³⁺ уже в низких концентрациях ингибирует Ca²⁺-АТФазу плазматической мембраны [28, 29], что также может способствовать медленному увеличению концентрации внутриклеточного Са²⁺, который начинает закачиваться в СР. Однако на Ca²⁺-АТФазу СР в наших экспериментах низкие концентрации Eu³⁺ практически не влияли, поскольку время полурелаксации одиночного сокращения менялось незначительно. С помощью методов электронной микроскопии было установлено, что лантан вытесняет кальций преимущественно из сарколеммальных участков и Ca²⁺ перераспределяется в СР [38]. Не исключено, что в наших экспериментах с Eu³⁺ происходило аналогичное перераспределение Са²⁺ в СР. Лантаноиды также могут эффективно ингибировать NCX [31, 32], который является доминирующим механизмом оттока кальция из кардиомиоцитов [39]. NCX играет важную роль в регуляции гомеостаза кальция, влияя на процессы его депонирования, в частности, в СР [39]. Поэтому NCX оказывает огромное влияние на сократимость сердечной мышцы [39]. Не исключено, что небольшие концентрации Eu³⁺ в наших экспериментах начинают ингибировать работу NCX, что приводит к постепенному увеличению кальция в СР и стимуляции сокращений.

При высоких концентрациях лантаноидов происходит значительное блокирование Са²⁺-зависимых процессов в сердечных клетках и, как следствие, ингибирование сердечных сокращений [17–19, 34, 35]. На различных биологических моделях показано, что лантаноиды обладают низкой токсичностью [14], но в высоких концентрациях могут замещать Ca²⁺ и тем самым снижать показатели сократимости сердечной мышцы [17–19]. Это связано, главным образом, с их блокирующим действием на потенциал–управляемые Са²⁺-каналы кардиомиоцитов [26, 27].

В ходе данной работы мы также оценили влияние Eu³⁺ на функцию митохондрий. В опытах на изолированных из сердца крысы митохондриях было показано, что дыхательная функция митохондрий (скорость поглощения кислорода фосфорилирующими энергизованными митохондриями, находящимися в состоянии 3 по Чансу) в присутствии низких концентраций Eu³⁺ меняется незначительно и в нашей модели потенциирования/ингибирования сокращения влияние Eu³⁺ на митохондрии можно не учитывать.

В последние десятилетия спрос на редкоземельные элементы значительно вырос как в промышленности, медицине, так и в других сферах их применения. Как правило, РЗЭ в почве, воде и атмосфере содержатся в низких концентрациях, однако они могут накапливаться в окружающей среде, особенно в неблагополучных районах, где наблюдается техническое загрязнение РЗЭ [40]. Поэтому возможно медленное накопление этих элементов в окружающей среде и проявление их токсического действия на организм человека [40]. Механизмы и отдаленные эффекты токсического действия лантаноидов изучены пока недостаточно.

В своей работе мы показали, что в низкой концентрации Eu³⁺ может стимулировать сердечные сокращения за счет перераспределения внутриклеточного Са²⁺ и в этом случае увеличивать устойчивость сердечной мышцы к влиянию азида натрия — ингибитора митохондриального дыхания. При этом, как нами показано, Eu³⁺ не оказывает значительного токсического действия на дыхание митохондрий in vitro. Eu³⁺ в миллимолярных концентрациях может блокировать первоначальный вход Са²⁺ в сердечную клетку, тем самым нарушая систему электро-механического сопряжения в миокарде [19]. Полученные данные важны для понимания механизмов действия лантаноидов на сердечную мышцу и могут быть полезны в разработке заместительной терапии, а также для исследования Са²⁺-сенсоров и Са²⁺-каналов в качестве диагностических зондов.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

С.М.К. осуществлял планирование, сбор и обработку данных, исследовал дыхание митохондрий и участвовал в редактировании статьи. К.В.С. исследовал сократительные характеристики препаратов сердечной мышцы лягушки Rana ridibunda и участвовал в написании соответствующих разделов и в редактировании статьи. И.В.Ш. осуществляла литературный поиск, участвовала в анализе полученных данных и в написании статьи. В.П.Н. осуществлял общее руководство работы над статьей и участвовал в ее редактировании.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям ИЭФБ РАН по уходу и использованию лабораторных животных протоколы #6-5/2022 и # 6-6/2022 от 23.06.2022 г.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в ИЭФБ РАН с использованием средств государственного бюджета по госзаданию № 075-00264-24-00.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят И.В. Брайловскую за помощь при полярографическом измерении скоростей поглощения кислорода митохондриями.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

作者简介

K. Sobol

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: peep9@yandex.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

S. Korotkov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

Email: peep9@yandex.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

I. Shemarova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

Email: peep9@yandex.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

V. Nesterov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

Email: peep9@yandex.ru
俄罗斯联邦, St. Petersburg

参考

补充文件