О взаимодействии комплексов золота(III) с метионином

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Золото является фармацевтически важным металлом. В течение последних десятилетий комплексы золота широко изучались как противоартритные и противоопухолевые средства [1–6]. Поскольку комплексы золота(III) являются изоэлектронными с комплексами платины(II), они были проверены на противораковую активность in vitro и продемонстрировали значительные цитотоксические эффекты. Возможное применение комплексов золота(III) для лечения рака вызвало интерес к взаимодействию золота(III) с различными биологически важными лигандами, такими как аминокислоты и пептиды [7]. В наших предыдущих работах [8, 9] было показано, что взаимодействие комплексов золота(III) с биологически активными тиолами приводит к быстрому восстановлению золота(III) до золота(I) с образованием высокоустойчивых тиолатных комплексов. Однако помимо тиолов в организме присутствуют и другие компоненты, способные восстанавливать золото(III). В первую очередь это относится к метионину и его производным.

Метионин (HMet) представляет собой аминокислоту, содержащую тиоэфирную группу. Он входит в состав большинства белков и ферментов в организме человека и является вероятной мишенью для ионов металлов in vivo. Поэтому изучение взаимодействия HMet с комплексами золота актуально с точки зрения бионеорганической химии.

Цель настоящей работы – исследование взаимодействия между комплексами золота(III) и метионином. Выбор комплексов обусловлен их использованием в биологических исследованиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исходный раствор HAuCl₄ готовили растворением металлического золота (99.9%) в царской водке с последующим многократным упариванием с соляной кислотой, а затем с водой. Кроме того, в работе использовали соляную кислоту (фиксанал), фосфатный буфер с pH 6.86 (фиксанал); L-метионин (HMet, ПанЭко, Россия, >98%); L-глутатион восстановленный (GSH, АО “Вектон”, Россия, >98%); этилендиамин (en), 2,2ʹ-бипиридил (bipy, Reanal, Венгрия, ч. д. а.); раствор NaOH (без CO₂), бидистиллированную воду. Концентрацию HAuCl₄ устанавливали по УФ-поглощению раствора (ε = 5600 M^–1 см^–1 при 314 нм, среда – 0.1 M HCl).

Растворы метионина и глутатиона готовили непосредственно перед экспериментами из сухих реактивов. Исходный фосфатный буфер (рН 6.86) доводили до рН 7.4 добавлением щелочи; рН 2.0 создавали при помощи HCl.

Комплекс с бипиридилом Au(bipy)Cl₂⁺ получали в растворе согласно [10]. Комплекс Au(bipy)(OH)₂⁺ в растворе получали из Au(bipy)Cl₂⁺ замещением 2Cl^– на 2OH^– после выдерживания в среде фосфатного буфера с pH 7.4 не менее 1 ч. Комплекс золота(III) с этилендиамином [Au(en)₂]Cl₃ получали аналогично [11]. Комплекс золота(III) [Au(C₉H₁₉N₄)](ClO₄)₂ (N,Nʹ-бис-(2-аминоэтил)-2,4-пентандииминатозолота(III) бис-перхлорат) получали согласно [12].

Спектры поглощения записывали на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ “Спектр”) в диапазоне длин волн 220–400 нм, l = 1 см.

К раствору, содержащему комплекс золота(III), 0.2 M NaCl, а также буфер (0.01 M) или HCl (0.01 M), добавляли рассчитанный объем метионина, быстро перемешивали и начинали сканирование спектров через определенные промежутки времени. Мертвое время составляло 5–10 с. В большинстве случаев C_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л, соотношение C_RS/C_Au = 0.6–5.0. Для предотвращения быстрого спонтанного диспропорционирования:

$3{\mathrm{AuCl}}_2^{–}=2{\mathrm{Au}}_0+{\mathrm{AuCl}}_4^{–}+2{\mathrm{Cl}}^{–}$

помимо добавки NaCl (0.2 M) мы не использовали C_Au > 10^–3 моль/л, pH < 2. В этих условиях появление следов золота(0) не наблюдалось в течение 6 ч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нейтральный L-метионин (HMet) существует в водном растворе в виде цвиттер-иона ^–OOC–CH(NH₃⁺)–(CH₂)₂–S–CH₃ с протонированной аминогруппой и депротонированной –COO^–-группой. Константа протонирования аминогруппы (Met^– + H⁺ = HMet⁰) равна lgK_H = 9.00 (I = 0.2 M (NaCl)) [13]. Константа протонирования –COO^–-группы мала и может иметь значение только в сильнокислой области. Для равновесий замещения Cl^– на Met^– в комплексе золота(I)

${\mathrm{AuCl}}_2^{–}+i{\mathrm{Met}}^{–}={\mathrm{AuCl}}_{2–i}{\mathrm{Met}}_i^{–}+i{\mathrm{Cl}}^{–}, {\mathrm{\beta }}_{\mathit{i}}, (i=1, 2)$ (1)

величины констант равны: lgβ₁ = 3.8, lgβ₂ = 5.4 [13], т.е. комплексы золота(I) с Met^– гораздо менее устойчивы по сравнению с тиолатными комплексами [14]. Способ координации метионина к золоту(I) (через амино- или тиоэфирную группу –S–) достоверно неизвестен. В работе [15] на основании данных ЯМР авторы полагают, что метионин координирован к золоту(I) через атом серы. Однако из данных работы [13] следует, что более вероятна координация через атом азота аминогруппы.

Имеющиеся в литературе данные [15–19] по взаимодействию комплексов золота(III) с метионином и его дипептидами относятся к AuCl₄^– и AuenCl₂⁺. В работах [16–18] показано, что редокс-процесс включает две стадии: быстрое замещение одного хлорида на один остаток метионина и дальнейшее внутрисферное окисление метионина с одновременным восстановлением золота(III) до золота(I). Скорость восстановления имеет общий второй порядок, т.е. наблюдается полная аналогия с процессами взаимодействия AuCl₄^– с органическими сульфидами [20, 21]. Кинетика процессов сильно зависит от вида комплексов. Так, для AuenCl₂⁺ скорость в 200 раз ниже, чем для AuCl₄^– в таких же условиях (pH 2) [18]. Во всех указанных работах отмечено диспропорционирование золота(I), ведущее к выделению Au⁰, что обусловлено низкой устойчивостью образующегося в результате восстановления комплекса золота(I) с метионином. С цианидным комплексом золота(III) Au(CN)₄^– метионин вообще не взаимодействует [22].

Метионин обычно окисляется до сульфоксида ^–OOC–CH(NH₃⁺)–(CH₂)₂–S(O)–CH₃ [18, 19, 23]. Взаимное превращение остатков HMet и его сульфоксида (MetO) в белках играет значительную роль в различных биологических процессах: защите от окислительного стресса, регуляции активности, деградации белков и развитии ряда заболеваний [24].

Взаимодействие AuCl₄^– с HMet. На рис. 1 показано изменение спектра AuCl₄^– во времени при добавлении метионина (pH 2) для двух соотношений C_Met/C_Au.

 

Рис. 1. Изменение во времени УФ-спектра раствора при взаимодействии AuCl₄^– с метионином (C_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л, pH 2, l = 1 см): а – C_HMet = 6.0 × 10^–5 моль/л, время после смешения τ = 6 c (1), 30 с (2), 1 мин (3), 1 мин 30 с (4), 2–30 мин (5); б – C_HMet = 5.0 × 10^–4 моль/л, время после смешения τ = 8 c (1), 30 с (2), 1 мин (3).

 

Изменение УФ-спектра на начальном этапе по сравнению со спектром AuCl₄^– вызвано быстрым замещением Cl^– на HMet. При росте соотношения C_HMet/C_Au оно становится более резким. Изменения спектра во времени при C_HMet/C_Au = 0.6 качественно совпадают c данными работ [15, 17]. Несмотря на довольно быстрое в данном случае протекание редокс-процесса, в аналогичных условиях реакции с тиолатами [8] заканчиваются намного быстрее (за секунды).

Отметим, что при С_HMet/C_Au = 0.6 уже через 2.5–3 мин процесс практически прекращается. УФ-спектр раствора точно соответствует спектру AuCl₄^– в количестве 40 % от исходной концентрации C_Au (A = 0.22 при λ = 314 нм, ε = 5600 М^–1 см^–1), т.е. несмотря на высокий редокс-потенциал золота(III) (AuCl₄^– + 2ē = AuCl₂^– + 2Cl^–, E⁰ = 0.93 В), метионин отдает только два электрона и окисляется до сульфоксида.

Взаимодействие Au(bipy)Cl₂⁺ с HMet. На рис. 2 показано изменение УФ-спектра раствора Au(bipy)Cl₂⁺ под действием HMet (0.6/1) при С_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л. Происходит постепенное смещение максимума спектра комплекса в сторону свободного лиганда (Hbipy⁺), что свидетельствует о его высвобождении и, следовательно, восстановлении золота(III) до золота(I). Образование комплексов золота(I) с bipy нехарактерно.

 

Рис. 2. Изменение во времени УФ-спектра раствора при взаимодействии Au(bipy)Cl₂⁺ с HMet. C_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л, C_HMet = 6.0 × 10^–5 моль/л; τ = 5 c (1), 10 (2), 20 (3), 40 (4), 60 (5), 76 (6), 109 (7), 143 (8), 174 (9), 230 мин (10); pH 2.0, l = 1 см.

 

В целом процесс намного более медленный, чем в случае AuCl₄^–: величина τ_1/2 составляет ~80 мин, в то время как для AuCl₄^– она меньше 1 мин. Этот результат совпадает с наблюдением, сделанным в работе [18]: введение в молекулу комплекса бидентатного лиганда резко снижает скорость редокс-процесса несмотря на то, что возможность замещения ионов Cl^– на метионин сохраняется.

В таких же условиях восстановление комплекса Au(bipy)Cl₂⁺ под действием глутатиона протекает быстрее, чем за 15 с [10].

Взаимодействие Au(bipy)(OH)₂⁺ с HMet. В физиологических условиях (pH 7.4, C_NaCl = 0.16 моль/л) основной формой бипиридильного комплекса золота(III) является Au(bipy)(OH)₂⁺ [10].

На рис. 3 показано изменение УФ-спектра раствора Au(bipy)(OH)₂⁺ под действием HMet (0.6/1) при С_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л. Наблюдается постепенное уменьшение полосы поглощения комплекса в области 310–320 нм. Одновременно происходит увеличение A в области 280 нм. Это свидетельствует о восстановлении золота(III) до золота(I) и высвобождении бипиридила из состава комплекса.

 

Рис. 3. Изменение во времени УФ-спектра раствора при взаимодействии Au(bipy)(OH)₂⁺ с HMet. C_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л, C_HMet = 6.0 × 10^–5 моль/л; τ = 5 c (1), 1 (2), 5 (3), 10 (4), 20 (5), 30 (6), 40 (7), 50 (8), 60 (9), 70 (10), 80 мин (11); pH 7.4, l = 1 см.

 

Уравнение процесса можно представить в виде:

$\mathrm{Au}\left(\mathrm{bipy}\right){\left(\mathrm{OH}\right)}_2^{+}+\mathrm{R}–\mathrm{S}–{\mathrm{CH}}_3+2{\mathrm{Cl}}^{–}={\mathrm{AuCl}}_2^{-}+\mathrm{R}–\mathrm{S}\left(\mathrm{O}\right)–{\mathrm{CH}}_3+\mathrm{bipy}+{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}$, (2)

где R = ^–OOC–CH(NH₃⁺)–(CH₂)₂–. Значительных различий в скорости по сравнению с хлоридным комплексом Au(bipy)Cl₂⁺ при pH 2.0 нами не выявлено.

Взаимодействие Au(en)₂* с HMet. Из-за способности к депротонированию [11] комплекс Au(en)₂³⁺ при pH 7.4 в присутствии 0.2 M NaCl существует в виде смеси Au(en)₂³⁺ + Auen(en-H)²⁺. Эту систему будем обозначать как Au(en)₂*.

На рис. 4 показаны спектры Au(en)₂* при добавлении метионина (pH 7.4, фосфатный буфер). Несмотря на высокое соотношение C_Met/C_Au, равное 5, УФ-спектр раствора во времени совершенно не изменяется, т.е. процесс если и идет, то крайне медленно. После добавления к раствору HCl до C_HCl = 1.6 моль/л происходит быстрое замещение Au(en)₂* + 2H⁺ + 2Cl^– = Au(en)Cl₂⁺ + enH₂²⁺. Образующийся комплекс Au(en)Cl₂⁺ реагирует с метионином быстрее, что согласуется с данными [18, 19]. Таким образом, метионин, в отличие от тиолатов [8], вероятно, не способен заместить бидентатный лиганд en в Au(en)₂³⁺.

 

Рис. 4. Изменение во времени УФ-спектра раствора при взаимодействии Au(en)₂* с HMet. C_Au = 1.0 × 10^–4 моль/л, C_HMet = 5.0 × 10^–4 моль/л; τ = 7 c – 20 мин (1); pH 7.4, l = 1 см. Добавление к раствору HCl до C_HCl = 1.6 моль/л, τ = 8 с (2), 5 (3), 10 (4), 15 мин (5).

 

Взаимодействие Au(C₉H₁₉N₄) ²⁺ с HMet и GSH. Эксперименты по изучению взаимодействия метионина с комплексом золота(III) Au(C₉H₁₉N₄)²⁺ (рис. 5) с тетрадентатным лигандом показали, что даже при соотношении C_HMet/C_Au = 10 (pH 7.4) в течение 1 ч никаких признаков реакции не наблюдалось. Однако при взаимодействии с глутатионом (GSH) процесс идет достаточно быстро: в условиях, указанных на рис. 6, за 45 мин 66% золота(III) восстанавливается до золота(I).

 

Рис. 5. Строение комплекса Au(C₉H₁₉N₄)²⁺.

 

Рис. 6. Изменение во времени УФ-спектра раствора при взаимодействии Au(C₉H₁₉N₄)²⁺ с GSH. C_Au = 5.2 × 10^–5 моль/л, C_GSH = 1.0 × 10^–3 моль/л; τ = 8 c (1), 5 (2), 15 (3), 25 (4), 35 (5), 45 (6), 55 (7), 70 (8), 90 (9), 115 (10), 140 (11), 230 мин (12); pH 7.4, l = 1 см.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хотя метионин действительно взаимодействует с некоторыми комплексами золота(III), процессы протекают гораздо медленнее, чем под действием тиолов. Хорошо известно, что редокс-процессы с участием комплексов протекают в две ступени: замещение лиганда на нуклеофил и далее внутрисферный редокс-процесс. По данным [23], константы скорости замещения лигандов в нескольких комплексах золота(III) на остаток метионина или же на тиол различаются не очень сильно. Про механизмы внутрисферных редокс-процессов известно мало, но если обращаться к взаимодействию с обычными окислителями, то механизм окисления тиолов и тиоэфиров сильно различается. Для тиолов (при их избытке) это чаще всего образование дисульфидов, для тиоэфиров процесс сводится к переносу кислорода. Таким образом, возможная причина уменьшения скорости реакций комплексов золота(III) с метионином по сравнению с взаимодействием с тиолами состоит в очень разных механизмах редокс-процессов. Кроме того, золото(I) не образует высокоустойчивых комплексов с метионином. Таким образом, при соизмеримых концентрациях метионина и тиолов в физиологических условиях, основной путь превращения комплексов золота(III) будет состоять в восстановлении золота(III) тиолом и образовании высокоустойчивых тиолатных комплексов золота(I). Влияние взаимодействия с метионином будет гораздо меньше.

По мере увеличения дентатности лигандов в комплексе золота(III) скорость реакций с метионином сильно падает. Например, при переходе от AuCl₄^– к AuenCl₂⁺ скорость падает в сотни раз, хотя доступные для замещения ионы хлора сохраняются. Комплексы золота(III) Au(en)₂* и Au(C₉H₁₉N₄)²⁺, в которых лиганды координированы только через атомы азота, с метионином вовсе не реагируют. Хотя, как показали дополнительные эксперименты, оба комплекса взаимодействуют с GSH.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 121031700315-2).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

В. Ю. Харламова

Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kharlamova@niic.nsc.ru
Россия, пр-т Академика Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

И. В. Миронов

Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН

Email: kharlamova@niic.nsc.ru
Россия, пр-т Академика Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Список литературы

Дополнительные файлы