Получение пористых электропроводящих композитов на основе сополиуретанимидов и наночастиц графена для клеточных технологий

Full Text

Полиимиды (ПИ) представляют собой промышленно значимый класс полимеров с имидными циклами в цепи. За счет изменения строения «диангидридных» и «диаминных» радикалов макромолекулы ПИ можно получать конструкционные материалы с различными эксплуатационными свойствами. Благодаря выявленной в последние годы биосовместимости ПИ [1] и их уникальным физико-механическим свойствам они могут использоваться в медицинской технике, например, при разработке сердечно-сосудистых катетеров, устройств для доставки стентов и систем доставки лекарств [1]. Одно из важных свойств ПИ — это возможность стерилизации изделий на их основе надежными методами (автоклавирование при 300°С, радиационное облучение).

Свойства поверхности ПИ, как и другого полимерного материала, могут оказывать существенное влияние на его биологический ответ [2]. Повышенная клеточная адгезия обычно достигается в случае гидрофильных поверхностей, а гидрофобные поверхности поддерживают высокий уровень адсорбции белка. Однако повышенное влагопоглощение пленки может негативно сказываться на механических характеристиках ПИ в долгосрочной перспективе.

Известно, что большое влияние на пролиферацию фибробластов оказывают свободная поверхностная энергия полимерных пленок [3], их электропроводность [4], микрорельеф, а также механические свойства [5].

Следует отметить, что полимерным электропроводящим биоматериалам, содержащим углеродные наночастицы, в литературе уделяется заметное внимание [6, 7]. Однако исследования в области электропроводящих полиимидных композиций для биомедицинских приложений в литературе практически отсутствуют [8]. В последние годы в работах [9–11] получена и исследована электропроводящая композитная пленка на основе частично кристаллического термопластичного полиимида Р-ОДФО [Р — диангидрид 1,3-бис(3ʹ,4-дикарбоксифенокси)-бензола, ОДФО — 4,4ʹ-бис-(4ʺ-аминофенокси)бифенил] и графена, которая перспективна в качестве биоэлектрода для электрической стимуляции фибробластов кожи человека. В связи с этим становятся актуальными вопросы целесообразности использования в обозначенном направлении более доступной поли(оксидифенилен)пиромеллитимидной пленки после модификации ее структуры в целях придания пористости и электропроводящих свойств. Такая модификация имеет практическое значение в случае, если при культивировании клеток на поверхности модифицированной пленки обеспечиваются показатели биосовместимости и биоактивности не ниже, чем были достигнуты ранее [9–11].

Для оценки пролиферативной активности клеток на тех или иных субстратах используются результаты колориметрического ММТ-теста (ММТ-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток) [12, 13]. В литературе имеются сведения о результатах МТТ-теста в случае культивации фибробластов на поверхности непористой пленки термопластичного полиимида Р-ОДФО, обработанной коронным разрядом [9–11].

В представленной работе предполагалось, что использование в качестве субстрата пористой композитной пленки поли(оксидифенилен)пиромеллитимида приведет к близким значениям МТТ-теста по сравнению с непористой пленкой Р-ОДФО, обработанной барьерным разрядом.

Цель работы — синтез пористой пленочной композиции поли(оксидифенилен)пиромеллитимида с графеном [путем управляемой термодеструкции предварительно полученного сополи(уретан-имида) (СПУИ)], изучение механических и электропроводящих свойств композита и оценка цитотоксичности пленки относительно дермальных фибробластов человека.

Экспериментальная часть

Исходные материалы. Выбранные в качестве объекта исследований образцы пористой пленки поли(оксидифенилен)пиромеллитимида были получены в результате термолиза в условиях первоначальных работ [14–16]. Исходные для проведения термолиза образцы СПУИ были наработаны по методикам, изложенным там же. При этом в качестве мономеров использовались пиромеллитовый диангидрид с температурой плавления (T_m)~ 283–286°С (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № 412287); поликапролактон с молекулярной массой M_n = 2000, T_m ~ 50°С (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № 189421); 2,4-толуилендиизоцианат (ТДИ) с T_m ~ 20–22°С (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № T39853); 4,4ʹ-диаминодифениловый эфир с T_m ~ 188–192°С (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № 516805). В качестве растворителя использовали N,N-диметилацетамид (Vecton Co. LLC, ос.ч. COMP-3212, СТП ТУ КОМП 3-212–2010). В качестве наполнителя для приготовления композиции с поли(оксидифенилен)пиромеллитимидом использовался графен. Средний размер графеновых чешуек (мкм) 30–50, толщина графена (нм) 0.34–4.0, содержание углерода (мас%) C > 99%, содержание функциональных групп (мас%) 0 < 1% (ООО НПО «Графеновые материалы»). Для ММТ-теста использовались: DMEM — Dulbeccoʹs Modified Eagle Medium (ООО НПП «ПанЭко», кат. № С425п), L-глютамин ( Thermo Fisher Scientific, фирма Gibco, кат. № 25030024), антибиотик Penicillin Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, фирма Gibco, кат. № 15140122), фунгезон Amphotericin B (Thermo Fisher Scientific, фирма Gibco, кат. № 15290026), фетальная коровья сыворотка (Thermo Fisher Scientific, фирма Gibco, кат. № 10270106). В ходе процесса культиворования клеток применяли: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ) (Thermo Fisher Scientific, кат. № M6494), DPBS [сухой буфер фосфатно-солевой Дюльбекко (DPBS), без Ca и Mg, ООО НПП «ПанЭко», кат. № Р060п], ДМСО — диметилсульфоксид 99.80% х.ч. (ООО «НеваРеактив», COMP-2451, СТП ТУ КОМП 2-451–2011). Физиологический раствор: натрия хлорид буфус 0.9%, код АТХ V07AB, рег. № ЛП-№ (002008)-(РГ-RU) [АО производственная фармацевтическая компания Обновление (RENEWALтм)].

Приготовление полиамидокислотного преполимера сополи(уретан-имида) с повышенным содержанием имидных звеньев. В трехгорлую колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой и трубкой для подачи и вывода аргона, загружали 5.0 г (2.5 ммоль) поликапролактандиола и 0.87 г (5.0 ммоль) толуилен-2,4-диизоционата (ТДИ). Смесь на масляной бане нагревали до 80°С и выдерживали в течение 1 ч. Затем добавляли 1.1 г (5.0 ммоль) пиромеллитового диангидрида в виде тонкоизмельченного порошка. Смесь нагревали до 180°С и перемешивали в течение 2 ч до гомогенизации полученного расплава и прекращения выделения пузырьков образующегося в ходе реакции углекислого газа. Реакционную массу охлаждали до 160°С и в нее приливали 23 мл N,N-диметилацетамида для растворения образовавшегося продукта. Концентрация раствора по образовавшему макромономеру составляла 23 мас%. Макромономер из реакционного раствора не выделяли. Далее в колбу, содержащую приготовленный, как описано выше, раствор макромономера, загружали 11.0 г (55.0 ммоль) 4,4ʹ-диаминодифенилового эфира и 12.0 г (55.0 ммоль) пиромеллитового диангидрида и сразу же добавляли 50 мл N,N-диметилацетамида. После растворения мономеров реакционную смесь интенсивно перемешивали в течение 4 ч в токе аргона при комнатной температуре для завершения реакции полиацилирования диамина. Получали преполимер [сополи(уретан-амидокислоту)] в растворе N,N-диметилацетамида. Раствор с концентрацией 30 мас% по преполимеру пропускали через фильтр Шотта, обезгаживали в вакууме и затем готовили композицию с графеном.

Спектр ЯМР ¹H (ЯМР ¹H — протонный ядерный магнитный резонанс в отношении ядер водорода-1) преполимера (ДМСО-d₆) (ДМСО-d₆ — дейтерированный диметилсульфоксид) δ, м. д.: 9.91, 9.62, 9.12, 8.87, 8.38, 7.98–6.55, 3.99, 3.66, 2.29, 2.15, 2.11, 2.08, 1.54, 1.31.

Характеристическая вязкость преполимера [η] = 1.1·100 см^–3·г^–1.

Приготовление пленочной композиции полиамидокислотного преполимера сополи(уретан-имида) с графеном. В заранее приготовленные растворы с концентрацией 30 мас% преполимера [сополи(уретан-амидокислоты)] в N,N-диметилацетамиде вводили диспергированную в N,N-диметилацетамиде суспензию графена с таким расчетом, чтобы в итоговой композитной смеси содержание графена составило 1 мас%. После чего смесь перемешивали в течение 24 ч, затем подвергали диспергированию путем сонирования (обработкой ультразвуком — 24 кГц, ультразвуковая установка ИЛ100-6, ООО «Ультозвуковая техника-Инлаб») по 3 мин 5 раз с интервалами без обработки ультразвуком для охлаждения нагревающейся в процессе ультразвукового воздействия композиции до комнатной температуры.

Приготовление пленочной композиции сополи(уретан-имида) с графеном путем имидизации преполимера. На гидрофобизированных стеклянных подложках методом полива были сформованы пленочные композиции СПУИ с графеном, которые в ходе ступенчатого прогрева высушивались (отверждались) и подвергались термической имидизации. Режим прогрева: 80°С — 12 ч, 100°С — 1 ч, 120°С — 1 ч, 140°С — 1 ч, 170°С — 2 ч.

Формула полученного СПУИ:

где n = 1, m = 10.

Приготовление образцов пористой полиимидной пленки в условиях термолиза пленочной композиции сополи(уретан-имида) с графеном. Пленочные композиции СПУИ с графеном были подвергнуты термолизу: пленки, прогретые при 170°С, были дополнительно прогреты на воздухе при 300 и 350°С от 5 до 60 мин. Дополнительно была получена термически имидизованая полиимидная пленка ПМ-ДАДФЭ (лабораторный образец) [9–11] путем конденсации в растворе N,N-диметилацетамида, 4,4ʹ-диаминодифенилового эфира и пиромеллитового ангидрида в эквимольных соотношениях. Режим термического прогрева: 80°С — 12 ч, 100°С — 1 ч, 200°С — 1 ч, 300°С — 1 ч, 360°С — 0.5 ч.

Методы исследования. Спектры ¹Н ЯМР снимали в дейтерированном ДМСО (ДМСО-d₆) на ЯМР-спектрометре высокого разрешения AVANCE II-500 WB (Bruker) на рабочей частоте прибора 500 МГц при комнатной температуре. Диапазон измерений 1–10 м. д.

Механические характеристики пленок определяли при комнатной температуре в режиме одноосного растяжения на образцах в виде полос шириной 2 мм с длиной рабочей части 25 мм. Испытания проводили на универсальной разрывной машине Instron 5940 (Instron). Растяжение образцов пленок проводилось со скоростью 10 мм·мин^–1.

Измерения электрохимических характеристик проводили с использованием потенциостата-гальваностата Elins P40 на пленочных образцах, помещенных в тефлоновую ячейку и зажатых между двумя платиновыми плоскопараллельными электродами, расположенными на расстоянии 0.9 см друг от друга. Исследовали характеристики сухих пленок и пленок, помещенных в физиологический раствор (0.9% NaCl) при нормальных условиях (физиологический раствор состоял из натрия хлорида буфус 0.9 мас%).

Угол смачивания пленок СПУИ определяли методом сидячей капли с использованием прибора DSA30 (Kruss). Измерения проводили при комнатной температуре с использованием 17 мкл дистиллированной воды. Значения угла смачивания рассчитывали через 5 с после нанесения капли с использованием программного обеспечения DSA4. Значения были определены в 5 областях, случайным образом распределенных по поверхности.

МТТ-тест: в исследованиях in vitro использовались культуры фибробластов кожи человека, полученные из Коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в питательной среде из DMEM (DMEM — Dulbeccoʹs Modified Eagle Medium) (Paneco) с добавлением по отношению к культуральной среде: 1% L-глютамина, 1% антибиотиков (100 ед·мл^–1 пенициллина, 100 мкг·мл^–1 стрептомицина), 1% фунгизона (25 мкг·мл^–1 амфотерицина B) и 12%-ной фетальной коровьей сыворотки. Клетки культивировали в инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂ при повышенной влажности (85%).

Образцы пленок стерилизовали в автоклаве в течение 40 мин при температуре 120°C и давлении 1.5 атм. Пленки нарезали на круглые фрагменты и помещали в лунки 24-луночного культурального планшета; добавляли суспензию клеток (25·10³) в полной культуральной среде. Процесс заполнения планшета проводили в асептических условиях в ламинарном боксе. Для сравнения использовались клетки, выращенные на культуральном пластике (полистироле).

АСМ — атомно-силовая микроскопия, измерения проводили с использованием атомно-силового микроскопа Nanosurf FlexAFM (Nanosurf AG) в динамическом режиме с использованием кантилевера Tap150. Оверскан 20%. Для каждого образца проводилась съемка с полем 20 × 20 мкм и 1 × 1 мкм.

Оценку биосовместимости полученных пленок с живыми клетками проводили путем исследования пролиферативной активности дермальных фибробластов человека с помощью МТТ-теста. В основе этого теста лежит способность митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных и пролиферирующих клеток восстанавливать желтый тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ) до нерастворимых в воде пурпурно-синих внутриклеточных кристаллов формазана. На 1-е и 4-е сутки культивирования в лунки 24-луночного культурального планшета (объем питательной среды 1 мл) добавляли 100 мкл рабочего раствора МТТ в концентрации 5 мг·мл^–1 в DPBS и инкубировали образцы 2 ч. Затем аккуратно удаляли среду, стараясь не задеть образовавшиеся кристаллы формазана. В каждую лунку добавляли по 1 мл ДМСО, получившийся раствор тщательно перемешали семплером и инкубировали в течение 5 мин. После раствор перенесли в лунки 96-луночного культурального планшета. Каждый образец имел 9 повторов. Затем измеряли абсорбцию растворов с помощью планшетного спектрофотометра SPECTROstar Nano (BMG LABTECH). Оптическую плотность раствора формазана измеряли при длине волны 570 нм, для отсечения фонового сигнала — 690 нм. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MARS Data Analysis Software, Microsoft Office Excel 16.

Обсуждение результатов

Пленки поли(оксидифенилен)пиромеллитимида с развитой пористой поверхностью были приготовлены в условиях управляемой термодеструкции уретановых блоков в СПУИ, содержащем уретановые и имидные звенья в мольном соотношении 1:10 и допированном графеном (1 мас% от массы полимера).

В табл. 1 представлены механические характеристики пленок СПУИ (после прогрева при 170 и 300°С) и композитов СПУИ с 1 мас% графена (после прогрева при 170 и 300°С).

 

Таблица 1

Механические свойства пленок СПУИ и композитов на их основе

Образец	Свойства пленок
	модуль Юнга Е, МПа	модуль упругости при растяжении σр, МПа	относительное удлинение при растяжении εр, %
СПУИ-170°С	1796 ± 229	113 ± 8	172 ± 15
СПУИ-170°С+1% графена	1820 ± 68	99 ± 8	82 ± 11
СПУИ-300°С	1494 ± 96	103 ± 11	106 ± 12
СПУИ-300°С+1% графена	1880 ± 67	78 ± 8	43 ± 7
ПМ-ДАДФЭ лабораторный образец	2115 ± 226	122 ± 10	34 ± 4

 

Для полимерных систем, представляющих потенциальный интерес в качестве гибких электродов, имеют значимость деформационно-прочностные свойства образцов, содержащих графен пористых поли(оксидифенилен)пиромеллитимидных пленок (табл. 1).

Приведенные в табл. 1 данные позволяют сравнить механические свойства образцов полиимидных и СПУИ пленок и их композиций с графеном соответственно до и после термолиза уретановых блоков в СПУИ образцах. Исследовались образцы имидизованного при 170°С СПУИ (СПУИ-170°С); композиции имидизованного при 170°С СПУИ с 1 мас% графена (СПУИ-170°С + 1 мас% графена); термолизованного при 300°С пористого СПУИ (СПУИ-300°С); композиции термолизованного при 300°С пористого сополи(уретан-мида) с 1 мас% графена (CПУИ-300°С + 1 мас% графена). Как следует из данных табл. 1, все исследованные образцы характеризуются высоким уровнем механических свойств, соизмеримым с показателями непористой поли(оксидифенилен)пиромеллитимидной пленки (лабораторный образец), т. е. синтезированные образцы удовлетворяют требованиям к гибким полимерным электродам по критерию механических свойств [17–19].

Исследуемые в настоящей работе композитные пленки следует отнести к гибридным полимер-неорганическим композитам, состоящим из органической фазы (СПУИ или полиимида) и дисперсной минеральной фазы (наночастиц графена, образующих электропроводную перколяционную сетку) [20]. Для оценки возможности использования синтезированных в данной работе пленочных материалов в качестве электропроводящей матрицы, позволяющей проводить на ней электростимуляцию клеточных культур, требуется определить характеристики электропроводящих и электрохимических свойств этих материалов. Для исследования были выбраны следующие синтезированные образцы: композит СПУИ, имидизованный при температуре 170°С, с содержанием графена 1 мас% (СПУИ-170°С + 1 мас% графена); полиимид ПМ с содержанием графена 1 мас%, термолизованный при 300°С в течение 1 ч (СПУИ ПМ-300°С + 1 мас% графена); СПУИ с содержанием графена 1 мас%, термолизованный при 350°С в течение 1 ч (СПУИ-350°С + 1 мас% графена). В качестве объекта сравнения выбран известный в литературе образец пленочной композиции полиимида марки Р-ОДФО, содержащей 1 мас% графена (ПИ Р-ОДФО + 1 мас% графена), полученный нами ранее [9–11]. Отметим, что термин ПИ ПМ означает поли(оксидифенилен)пиромеллитимид.

Эксперимент по исследованию вольт-амперных характеристик образцов СПУИ проводился как на сухих пленках, так и на образцах, погруженных в физиологический раствор. Изучение материалов во влажной среде позволяло оценить электропроводность в условиях, близких к условиям электростимуляции клеток в культуральной среде [9]. На образцы подавался электрический потенциал пилообразной формы амплитудой ±100 мВ с периодом смены потенциала 30 с. При этом регистрировался электрический ток, протекающий по образцу. Величина налагаемого потенциала и частота его циклирования выбраны с учетом физиологических параметров электростимуляции живых клеток и тканей [9].

На рис. 1, а, б приведены вольт-амперные характеристики исследованных полимерных образцов в диапазоне потенциалов ±100 мВ, на рис. 1, б показаны вольт-амперные характеристики физиологического раствора (0.9%-ного водного раствора хлорида натрия).

 

Рис. 1. Вольт-амперные характеристики сухих образцов (обозначены красным цветом), образов, смоченных физиологическим раствором (обозначены синим цветом), и физиологического раствора (обозначены черным цветом).

а) 1 — полиимид Р-ОДФО [9–11] + 1 мас% графена, 2 — сополи(уретан-имид-170°С + 1 мас% графена; б) 3 — сополи(уретан-имид)-300°С + 1 мас% графена, 4 — сополи(уретан-имид)-350°С + 1 мас% графена.

 

Полиимиды — это диэлектрические материалы с сопротивлением выше 10¹⁵Ом·м (рис. 1, а) [9], а СПУИ имеют сопротивление порядка 10¹² Ом·м. Добавление графена в данные структуры приводит к снижению сопротивления, что свидетельствует о наличии в образце перколяционной сетки графена. На рис. 1 красным цветом представлены вольт-амперные характеристики для сухих образцов графенсодержащих полимеров. Линейность представленных зависимостей свидетельствует об исключительно электронном характере проводимости образцов. Электропроводность образцов коррелирует с углом наклона кривых вольт-амперных зависимостей и соответствует различной степени электрической перколяции проводящей компоненты (графена). Среди исследованных образцов самая высокая проводимость наблюдается в случае композиции на основе кристаллизующегося полиимида Р-ОДФО (рис. 1, а, кривая 1). Разумно полагать, что наличие гибких полиуретановых блоков в структуре СПУИ нарушает перколяцию слоев графена в объеме сополимера и, как следствие, обусловливает уменьшение проводимости образца (рис. 1, а, кривая 2). Весьма вероятно, что термолиз пленки СПУИ, приводящий к удалению полиуретановых блоков из объема полимера и обусловливающий образование пористой полиимидной пленки-мембраны [14, 15] с «разрыхленной» внутренней структурой, обусловливает снижение перколяции и уменьшение проводимости образца. Наименьшая проводимость наблюдается в случае полиимида, полученного в результате термолиза исходной сополи(уретан-имидной) композиции (рис. 1, кривые 1, 2). Следует отметить, что выбор в качестве объекта сравнения графенсодержащей композиции термопластичного полиимида Р-ОДФО [9] не совсем корректен вследствие различий в химической структуре этого полиимида с ПМ, а также формирования композиции с применением коронного разряда, однако является вынужденным ввиду отсутствия в литературе соответствующих данных, относящихся к иным полиимидам.

При исследовании образцов пленок в физиологическом растворе (рис. 1) проявляются те же факторы изменения электропроводности, что и при исследовании пленок в сухом состоянии. Важно отметить, что в случае композиций с графеном термолизованных полиимидов электронная проводимость материалов становится сопоставимой с ионной проводимостью ячейки (рис. 1, б, кривые 3, 4). По этой причине линейные вольт-амперные зависимости преобразуются в циклические вольт-амперограммы, характерные для ион-проводящего физиологического раствора (рис. 1, б).

Интересной особенностью является рост электропроводности образцов композиций исследованного СПУИ и полиимида Р-ОДФО при смачивании физиологическим раствором (рис. 1, кривые 1, 2). Из графика видно, что проводимость увеличивается почти в 2 раза в случае композиции полиимида Р-ОДФО (рис. 1, кривая 1). Предположительно, набухание пленки приводит к улучшению условий перколяции, вызывая более плотное прижимание слоев графена. Нельзя исключить также и возможность встраивания в структуру пленки ионов из физиологического раствора с образованием дополнительных электропроводящих мостиков между соседними слоями графена.

На рис. 2 показана временная развертка циклов перезарядки пленки (матрицы) на примере образца композиции СПУИ, термолизованной при 300°С и содержащей 1 мас% графена, в диапазоне потенциалов ±100 мВ. Видно, что в ходе непрерывного циклирования на протяжении 4 ч токи, протекающие через образец, остаются неизменными, что говорит о стабильности полимерной матрицы в данных условиях. Таким образом, матрица пригодна для проведения продолжительной электростимуляции клеточных культур.

 

Рис. 2. Развертка токов во времени для образца композиции сополи(уретан-имида), содержащего 1 мас% графена, термолизованного при 300°С.

Показаны величины токов в первые минуты измерений и спустя 4 ч непрерывного циклирования потенциалом ±100 мВ П-образной формы.

 

Величины угла смачивания исследуемых пленок представлены в табл. 2.

 

Таблица 2

Угол смачивания поверхности исследованных пленок полярной жидкостью

Образец	Угол смачивания, град
СПУИ-170°С	57 ± 5
СПУИ-170°С + 1% графена	60 ± 5
ПИ-300°С	62 ± 6
ПИ-300°С + 1% графена	63 ± 6
ПИ ПМ-ДАДФЭ лабораторный образец	65 ± 4

 

Как видно из данных табл. 2, угол смачивания полученных материалов находится в диапазоне 57°–63°. Известно, что оптимальный угол смачивания воды с поверхностью пленки для адгезии клеток составляет примерно 70° [21], но для лучшего прикрепления клеток поверхность должна иметь развитый микрорельеф [10].

АСМ-изображения фрагментов верхней (свободной) поверхности сополимера и его композитов (матрица сканирования 1 × 1 мкм), полученных на разных стадиях прогрева образца от 170 до 300°C, представлены на рис. 3. Видно, что шероховатость у наполненных образцов выражена слабее. На АСМ-изображениях тонкой структуры поверхности пленки, нагретой при 170 и 300°С (матрица сканирования 1 × 1 мкм), отчетливо видна мелкозернистая морфология. Между зернами видны небольшие зазоры, и они локализованы в приповерхностном слое пленки. Видны каверны. Поверхность достаточно гладкая. Как видно, изменение высоты геометрии поверхности у наполненных образцов выражено сильнее. Поверхность ненаполненного образца, нагретого до 300°C, сильно текстурирована и имеет более развитый рельеф, чем у всех остальных образцов. Изменение высоты рельефа варьируется в пределах 1–2 мкм. Пленки, нагретые до 300°C, имеют доменную морфологию с удлиненными эллиптическими образованиями, плотно прилегающими друг к другу на поверхности. Такое морфологическое устройство свидетельствует о пористой структуре полученных пленок и их композитов, причем, по данным морфологического анализа, пористость ненаполненных образцов выражена сильнее, о чем свидетельствует также наша предыдущая работа [15]. Видно, что морфология поверхности пленок и их композитов исследованных сополимерных образцов становится более выраженной в результате термического разрушения блоков поликапролактона и приобретает доменную структуру. Анализируя структуры на АСМ микрофотографиях и сравнивая со значениями полученных величин угла смачивания, можно сделать вывод о том, что у наполненных образцов гидрофобность немного выше, чем у ненаполненных, однако это не является критичным фактором, который бы не позволил использовать эти полимеры в качестве подложек, способных проводить электрический ток. В дальнейшем полученные сополимеры и их композиты были исследованы на предмет биосовместимости с клеточными культурами.

 

Рис. 3. Микрофотографии атомно-силовой микроскопии свободной поверхности пленок сополимера и его композитов на разных стадиях прогрева.

В режиме топографии (а) сополи(уретан-имид)-170°C, (в) сополи(уретан-имид)-170°C + 1 мас% графена, (д) сополи(уретан-имид)-300°C, (ж) сополи(уретан-имид)-300°C + 1 мас% графена; в режиме амплитуды (б) сополи(уретан-имид)-170°C, (г) сополи(уретан-имид)-170°C + 1 мас% графена, (е) сополи(уретан-имид)-300°C, (ж) сополи(уретан-имид)-300°C + + 1 мас% графена; площадь сканирования 1 × 1 мкм.

 

Стандартным методом оценки жизнеспособности животных клеток на поверхности полимерных субстратов (подложек) является МТТ-тест, который заключается в определении митохондриальной активности клеток [9]. В результате восстановления образуется нерастворимый в водной среде формазан, количество которого коррелирует с количеством жизнеспособных клеток. Формазан переводят в раствор с помощью диметилсульфоксида и его концентрацию определяют оптическим методом с помощью спектофотометра, поскольку раствор формазана поглощает свет на длине волны около 570 нм.

В представленной работе дермальные фибробласты человека выращивались на субстратах (поверхностях): СПУИ, имидизованного при 170°С (СПУИ-170°С); композиции СПУИ, имидизованной при 170°С и содержащей 1 мас% графена (СПУИ-170°С + 1 мас% графена); полиимида, термолизованного при 300°С (СПУИ-300°С); композиции полиимида, термолизованной при 300°С и содержащей 1 мас% графена (СПУИ-300°С + 1 мас% графена). МТТ-тесты проводили после первых и четырех завершающих суток культивирования клеток на поверхности исследованных субстратов. Результаты МТТ-тестов представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Диаграмма метилтетразолиевых тестов по результатам культивирования дермальных фибробластов человека в течение 1 (левый столбец каждого образца) и 4 сут (правый столбец каждого образца) на поверхностях субстратов.

1 — сополи(уретан-имид)-170°С, 2 — сополи(уретан-имид)-170°С + 1 мас% графена, 3 — сополи(уретан-имид)-300°С, 4 — сополи(уретан-имид)-300°С + 1 мас% графена и контрольный образец (культуральный пластик полистирол).

Научное редактирование проведено научным сотрудником ИНХС им. А. В. Топчиева РАН А. Я. Якимовой.

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в композиты графена приводит к небольшому снижению значений показателей МТТ-тестов, в случае полиимидных образцов соответствующие показатели выше, чем у сополи(уретан-имидных) (табл. 2). Это обстоятельство не может быть связано с цитотоксическим действием графена и, вероятно, объясняется изменением структуры поверхности композитных пленок и влиянием этих изменений на клеточную адгезию. Представленные данные (рис. 4) свидетельствуют о том, что всем исследованным композитным пленкам соответствуют высокие значения оптической плотности растворов формазана при 570 нм, т. е. по результатам МТТ-тестов материалы являются биосовместимыми и в сочетании с данными по их электропроводности могут быть использованы для электрической стимуляции клеток при решении задач клеточных и регенеративных технологий. Таким образом, полученные наполненные сополимеры могут быть в дальнейшем использованы в качестве материалов для целенаправленного электрического воздействия на клеточный субстрат для стимуляции его роста.

Выводы

В ходе селективной деструкции уретановых звеньев термолизом в наполненном графеном сополимере получены полиимидные пленки с пористой поверхностной структурой. Отношения уретановых блоков к имидным составляло в мольном соотношении 1 к 10. Масса введенного графена составляла 1% от общей массы сополимера. Показано, что синтезированные образцы по критерию механических свойств удовлетворяют требованиям к гибким полимерным электродам. Параметры вольт-амперных характеристик синтезированных гибридных образцов отвечают критерию требований, предъявляемых к полимерным материалам для биоэлектродов. Из результатов проведенных метилтетразолиевых тестов с использованием дермальных фибробластов следует, что разработанные гибридные пленки являются биосовместимыми и в сочетании с данными по электропроводности пленок могут быть использованы для электрической стимуляции клеток при решении задач клеточных и регенеративных технологий. При этом показано, что топографические особенности пленок, а также механические и электрические свойства внеклеточных материалов могут оказывать влияние на адгезию и пролиферацию фибробластов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Финансирование работы

Работа выполнена по теме НИР госзадания «Полимерные и композиционные материалы для перспективных технологий». Регистрационный номер проекта 124013000726-6.

Информация о вкладе авторов

А. Л. Диденко участвовал в постановке задачи исследования и интерпретации его результатов, отвечал за общее планирование исследования и координацию работы всех участников, в соответствии с заданной архитектурой полимеров предложил и опробовал модифицированные методики синтеза полимеров и формования из них пленочных образцов, принимал лидирующее участие в написании статьи; М. А. Шишов провел инструментальное исследование характеристик электропроводящих и электрохимических свойств сополи(уретан-имидных) и полиимидных материалов по специально разработанной им методике, интерпретировал полученные результаты, написал соответствующую часть статьи; А. С. Нестерова провела синтез полимеров, подготовила образцы пленок полимеров для исследования электрофизическими и биологическими методами, участвовала в обсуждении полученных результатов, принимала участие в написании соответствующей части статьи; А. М. Камалов выполнил обзор литературы по теме статьи, интерпретировал полученные результаты, принимал участие в написании соответствующей физической части статьи; Г. В. Ваганов провел механические испытания полимерных пленок, интерпретировал полученные результаты, принимал участие в написании соответствующей части статьи; Н. В. Смирнова провела анализ результатов МТТ-тестов исследованных пленок, интерпретировала полученные результаты, принимала участие в написании соответствующей части статьи; К. А. Колбе выполнил МТТ-тесты синтезированных полимеров, интерпретировал полученные результаты, принимал участие в написании соответствующей части статьи; В. Е. Юдин суммировал результаты участников исследования, обеспечив целостный характер исследования, участвовал в постановке задачи исследования, написании статьи; В. В. Кудрявцев обосновал концепцию исследования, участвовал в постановке цели и задачи исследования, интерпретации результатов на всех этапах исследования, принимал участие в написании статьи, провел редактирование статьи. Все соавторы принимали активное участие в обсуждении полученных результатов и формулировке выводов по работе.

About the authors

Андрей Леонидович Диденко

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Author for correspondence.
Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4285-7734

к.х.н., с.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Алмаз Маратович Камалов

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2044-957X

к.т.н., с.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Михаил Александрович Шишов

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5100-2565

к.т.н., с.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Наталья Владимировна Смирнова

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5524-2785

к.б.н., с.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Константин Андреевич Колбе

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2304-1759

м.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Анна Сергеевна Нестерова

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru

м.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Глеб Вячеславович Ваганов

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru

к.т.н., с.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Владимир Евгеньевич Юдин

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5517-4767

д.ф-м.н., г.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

Владислав Владимирович Кудрявцев

Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Email: vanilin72@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7392-4659

д.х.н., проф., г.н.с., филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ–ИВС

Russian Federation, 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31

References

Supplementary files