Metagenomic analysis of the microbiota of a laboratory mite population of Neoseiulus californicus (mesostigmata, phytoseiidae) and the optimisation of microbiota composition to improve mite breeding efficiency

Full Text

Фитосейидный клещ Neoseiulus californicus (McGregor 1954), первоначально описанный как представитель рода Typhlodromus Scheuten 1857, широко используется для биологической борьбы с вредителями растений в условиях защищенного грунта, такими как обыкновенный паутинный клещ (Tetranychus urticae (Koch 1836)), красный томатный паутинный клещ (Tetranychus evansi (Baker & Pritchard 1960)) и другими мелкими вредителями, поражающими растения (Sanchez et al., 2008). Большое число видов жертв N. californicus и его способность переносить временные периоды голодания (питается пыльцевыми зернами растений) (Akyazi, Liburd, 2019) указывают на отсутствие строгой пищевой специализации этого вида хищных клещей, что вероятно отражается на составе его микробиоты. В настоящее время исследования микробиоты N. californicus и других видов фитосейидных клещей находятся в начальной стадии. До эпохи полногеномного секвенирования интерес исследователей к бактериальным симбионтам фитосейидных клещей фокусировался на внутриклеточных бактериях Wolbachia, Cardinium и Spiroplasma, вызывающих сдвиг в соотношении полов в сторону самок и цитоплазматическую несовместимость инфицированных и свободных от инфекции линий клещей. Для обнаружения внутриклеточных бактерий использовались методы, основанные на идентификации генов бактерий методом ПЦР (Breeuwer, Jacobs, 1996; Johanowicz, Hoy, 1996; Weeks et al., 2003; Enigl, Schausberger, 2007). С появлением методов полногеномного секвенирования стали появляться работы с описанием всей микробиоты изучаемых клещей на основе метабаркодирования бактериальных генов (Andrianov, 2022). В работе Мерлина с соавторами (Merlin et al., 2023) изучен вопрос о влиянии растения хозяина на состав микробиоты системы “хищник – жертва” на примере пары видов N. californicus и T. urticae при развитии на растениях хлопчатника, кукурузы, обыкновенной фасоли или на томате. Предполагалось, что летучие фитонцидные соединения растений будут оказывать влияние на видовой состав микробиоты клещей. Тем не менее характеристика микробиоты на основе метабаркодирования по гену 16S rRNA выявила устойчивые качественные отличия микробиоты N. californicus от T. urticae, но влияние вида растения на микробиоту клещей не было обнаружено. Видовой состав микробиоты N. californicus в разных опытах оказался изменчив. Если принять интуитивно понятное допущение, что значимые для биологии клещей виды бактерий имеют высокую численность, то наибольшее значение для клещей N. californicus имеют бактерии из родов Pseudomonas, Flavobacterium, Enterococcus, Bacillus и Stenotrophomonas.

Изучение микробиоты другой пары видов, образованной хищным фитосейидным клещом Neoseiulus cucumeris (Oudemans 1930) и его жертвой акаридиевым клещом Tyrophagus putrescentiae (Schrank 1781), методом метабаркодирования гена 16S rRNA также выявило радикальные различия микробиоты хищника и жертвы (Pekas et al., 2017). Микробиота хищного клеща образована преимущественно видами бактерий из родов Brevibacterium, Staphylococcus и Bacillus, причем на долю Staphylococcus kloosii (Schleifer et al. 1985) приходится 61–72% всех бактерий. Еще 12–14% приходится на Staphylococcus saprophyticus (Fairbrother 1940). Эти бактерии отсутствуют в чистых культурах клеща T. putrescentiae. Его микробиота содержит преимущественно Blattabacterium-like и Solitalea-like бактерии. Типичные для человека кишечные бактерии Escherichia coli, Lactococcus sp., Leuconostoc sp. и Propionibacterium немногочисленны и вероятно случайны в микробиоте клещей.

В недавно опубликованной работе с использованием секвенирования по Sanger фрагментов 16S rRNA гена и традиционных микробиологических подходов проведено изучение микробиоты трех видов фитосейидных клещей: Phytoseiulus persimilis (Athias-Henriot 1957), Amblyseius swirskii Athias-Henriot 1962 и Neoseiulus cucumeris (Sumner-Kalkun et al., 2023). Полученные данные подтвердили вывод из работы Пекас с соавторами (Pekas et al., 2017) о большой численности популяции бактерий S. kloosi в микробиоте N. cucumeris. Обнаружение S. kloosi в микробиоте N. cucumeris двумя независимыми методами указывает на важную роль этой бактерии для биологии N. cucumeris. Основными представителями микробиоты A. swirskii и N. cucumeris являются Serratia marcescens NECW30 (Bizio 1823) и Elizabethkingia meningoseptica (King 1959) Kim et al. 2005 из группы энтеробактерий. Микробиота P. persimilis существенно отлична. Наибольшую представленность имеют S. maltophilia PHPW29, Serratia odorifera (Grimont et al. 1978) и Arthrobacter sp. PHPS1 (Conn and Dimmick 1947). Эксперименты по обработке P. persimilis двумя видами бактерий из рода Serratia показали их контрастное влияние на параметры жизнеспособности популяции (Sumner-Kalkun et al., 2023). Обработка клещей бактерией S. marcescens, характерной для микробиоты других видов фитосейид, снижала выживаемость, плодовитость и активность питания, но другой вид бактерий из рода Serratia – S. odorifera из микробиоты P. Persimilis – действовала противоположно, проявляя свойства пробиотика для P. persimilis. Следует отметить, что патогенность S. marcescens ранее отмечалась для лабораторных популяций клещей Galendromus (Galendromus) occidentalis (Nesbitt 1951), у которых инфекция этой бактерией приводит к нарушению пищеварения и прилипанию клещей к субстрату (Hoy, Jeyaprakash, 2005, 2008).

Особое практическое значение для использования фитосейидных клещей как агентов биоконтроля имеют патогенные виды бактерий. В настоящее время доказана патогенность для клещей нескольких видов бактерий. Для лабораторной линии клеща P. persimilis был описан синдром “невосприимчивости” или non-responding (NR) syndrome, характеризующийся уменьшением размеров взрослых особей, сокращением продолжительности жизни и плодовитости клещей, а также снижением их активности в питании паутинными клещами. В ногах зараженных клещей наблюдались кристаллы. Причиной синдрома невосприимчивости оказалась спонтанная инфекция штаммом бактерии Acaricomes phytoseiuli DSM 14247 (Pukall et al. 2006). Ее роль в патогенезе данного синдрома была подтверждена возможностью инфицировать клещей из нормальных линий в соответствии с постулатами Коха (Gols et al., 2007; Schütte et al., 2008).

Наличие бактерии Oligosporidium occidentalis ассоциировано с заболеванием клещей Gelendromus (Galendromus) occidentalis (Becnel et al., 2002), а фитопатогенная бактерия Brenneria salicis (Day 1924) Hauben et al. 1999 ассоциирована с заболеванием N. cucumeris (Hoy, Jeyaprakash, 2008; Pekas et al., 2017). У фитосейидных клещей обнаружены широко распространенные среди видов членистоногих внутриклеточные бактерии Wolbachia, Cardinium и Spiroplasma (Enigl, Schausberger, 2007; Wu, Hoy, 2012; Famah et al., 2014). В настоящее время нет данных об облигатности симбиоза каких-либо штаммов бактерий из этой группы и фитосейидных клещей. Вероятно, симбиоз имеет факультативный характер. Наличие этих бактерий может быть бессимптомным и часто ассоциировано со сдвигом соотношения полов в пользу самок и с цитоплазматической несовместимостью, обнаруживаемой при скрещивании линий с разным инфекционным статусом (Wu, Hoy, 2012).

В данном сообщении мы впервые для популяций фитосейидных клещей, используемых в практике защиты растений в России, приводим данные метабаркодирования их микробиоты. Под микробиотой мы понимаем совокупность видов бактерий, определяемых по нуклеотидной последовательности бактериального гена 16S rRNA. В работе изложены результаты эксперимента по оптимизации микробиоты популяции N. californicus путем последовательной обработки клещей антибиотиком (тетрациклином) и пробиотической бактерией Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872 с целью оптимизации технологии разведения хищного клеща и повышения эффективности его применения для контроля паутинных клещей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии клещей Neoseiulus californicus

Хищные клещи N. californicus для данного исследования были получены из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии (Glinushkin et al., 2019) и разводилась в культуре на кормовых паутинных клещах T. urticae. Культуру N. californicus выращивали при температуре 25ºC, относительной влажности воздуха 90% и продолжительности светового дня 20 часов. Для проведения экспериментов в контролируемых условиях использовались плоты, в которых клещи питались на листьях фасоли, окруженных водой, что предотвращало рассеивание клещей (рис. 1а).

 

Рис. 1. Экспериментальная установка для разведения лабораторных линий N. Californicus: а – плоты листьев фасоли, которые заражены паутинными клещами и на которых в контролируемых условиях питаются клещи N. californicus; б – самка N. californicus, в центре тела просвечивает созревающее яйцо. Фотография Ю. И. Мешкова.

 

На каждый плот помещали по 10 самок N. californicus. Кормление N. californicus проводили на 3-й и 5-й дни, помещая на лист фасоли паутинных клещей. Количество клещей подсчитывали через 7 дней после начала эксперимента, что соответствует жизненному циклу N. californicus от яйца до имаго. Мы получили линию клещей N. californicus BioDefence2 от единственной оплодотворенной самки и производную линию с оптимизированной микробиотой BioDefence3. Линия Biodefence2 служила контрольной группой в эксперименте по оптимизации микробиоты линии BioDefence3.

Оптимизацию микробиоты проводили последовательной обработкой линии клещей тетрациклином для устранения патогенных бактерий и затем обработкой пробиотическими бактериями B. subtilis для восстановления жизнеспособности линии клещей. Для обработки тетрациклином использовался тетрациклин гидрохлорид для микробиологии от фирмы “Helicon” (https://www.helicon.ru/catalog/reagenty/kultivirovanie-kletok/antibiotiki/tetratsiklina-gidrokhlorid-art-srl-38614/). Концентрированный раствор 30 мг/мл получали в 70% спирте и разводили водой в 10 раз непосредственно перед опрыскиванием листьев фасоли с культурой паутинных клещей. Непосредственная обработка N. californicus тетрациклином невозможна, так как опрыскивание раствором антибиотика вызывает их гибель. Для обработки N. californicus тетрациклином мы использовали паутинных клещей, резистентных к опрыскиванию раствором тетрациклина и выращенных на обработанных антибиотиком листьях фасоли. Концентрацию тетрациклина подбирали экспериментально для каждой партии тетрациклина в предварительных опытах с последовательными двукратными разведениями основного раствора антибиотика. Концентрация тетрациклина в два раза меньшая, чем токсичная доза, вызывающая частичную гибель лабораторной популяции N. californicus, была выбрана для опыта. Через сутки после обработки листья фасоли использовали для загрузки плотов хищными клещами или для подкормки клещей на плотах. Для получения обработанной тетрациклином линии, клещи проходили весь жизненный цикл от яйца до яйца на обработанных тетрациклином листьях. Для этого родителей удаляли после откладки яиц, а клещей, вышедших из яиц, доращивали на листьях, обработанных тетрациклином, до взрослой стадии. Через 7 дней поколение клещей N. californicus, выросшее на обработанных тетрациклином листьях, собирали и переносили на плоты, не обработанные тетрациклином, но опрысканные 5% раствором спор B. subtilis для восстановления жизнеспособности линии клещей. В качестве пробиотических бактерий мы использовали суспензию спор бактерий рода Bacillus производства фирмы “Chisal NV” (Belgium), поставщик в России – фирма “Пробиотика” (https://probiotica.ru/chrisal_products/stb_-_nasishenie_prostranstva/215594/). Исходный препарат “Сенная палочка”, являющийся суспензией спор бактерий с концентрацией 5 х 10⁷ живых бактерий в одном миллилитре, разводили стерильной водой перед опытом в 20 раз для активации бактерий и опрыскивали листья с клещами ежедневно. После откладки яиц родителей удаляли, и поколение клещей, выросшее на листьях с пробиотическими бактериями, вели далее как производную линию BioDefence3. Культивирование линии BioDefence3 вели при ежедневном опрыскивании пробиотическими бактериями. Всего для выделения суммарной ДНК было получено 30 плотов с клещами линии BioDefence2 и 30 плотов с клещами линии BioDefence3. Перед выделением суммарной ДНК клещей переносили в культуральный флакон без кормовых клещей, где они голодали в течение двух суток. Далее взрослых клещей индивидуально собирали в лизирующий раствор для выделения суммарной ДНК и определения нуклеотидной последовательности хологенома линии клещей.

Выделение суммарной ДНК линии клещей и определение нуклеотидной последовательности ее хологенома методом нанопорового секвенирования длинных фрагментов ДНК

Высокомолекулярную ДНК для нанопорового секвенирования выделяли с помощью классического фенол-хлороформного метода с Протеиназой К, модифицированного для выделения высокомолекулярной ДНК. Примесь РНК удаляли обработкой рибонуклеазой Т1. Качество и чистоту выделенной ДНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop (Thermo Scientific). Концентрацию ДНК определяли с помощью флуорометра Qubit (Invitrogen) и наборов реагентов (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Invitrogen). Заключительный этап выделения высокомолекулярной ДНК проводили на магнитных шариках с использованием буфера для больших фрагментов (LFB) из набора SQK-LSK110 (Oxford Nanopore Technologies). Для подготовки библиотеки концы молекул ДНК достраивались, а затем лигировались с адаптерами с помощью модуля NEBNext Companion Module. Библиотеки для нанопорового секвенирования готовили при помощи набора SQK-LSK110 (Oxford Nanopore Technologies). Секвенирование геномной библиотеки проводилось на потоковой ячейке MinION R9.4.1 на приборе MinION нанопор секвенатор 512 каналов (Oxford Nanopore Technologies) под управлением программы MinKNOW v.5.1.0. Сохраняли риды с длиной более 200 п. н. Бейсколлинг проводили на сервере с графическим процессором при помощи программы Guppy (v6.0.1+652ffd179) (https://github.com/asadprodhan/GPU-accelerated-guppy-basecalling). Сборку контигов из первичных чтений вели в программе canu v.2.3 assembler (Koren et al., 2017). N50 для полученных сборок было равно 97122 п. н. для сборки BioDefence2 и 44867 п. н. для сборки BioDefence3, что говорит о достаточно хорошем качестве сборки. Качество сборки генома N. californicus было проверено в программе BUSCO ver. 5.4.2. (Manni et al., 2021). При оценке качества мы получили 77.1% корректно собранных генов домашнего хозяйства для BioDefence2 и 79.3% для BioDefence3. Для поиска генов использовалась программа AUGUSTUS (Stanke et al., 2006). Аннотацию собранных генов проводили в программе OrthoFinder (Emms, Kelly, 2019), которая собирает ортологичные гены в группы. Выявленные гены выравнивали на базу данных nr с помощью программы BLAST. Сборки хологенома двух линий N. californicus BioDefence2 и BioDefence3 были размещены в базе данных GenBank. Сборки последовательностей, присоединенные к проекту BioDefence2, доступны по номеру SRR23949036. Все данные проекта зарегистрированы с номером BioProject ID PRJNA946627. Сборки последовательностей, присоединенные к проекту BioDefence3, доступны по номеру SRR26395938. Все данные проекта зарегистрированы с номером BioProject ID PRJNA1028568.

Для проведения метагеномного анализа мы извлекли из геномного проекта все последовательности прокариотического гена 16S rRNA с помощью программы Centrifuge и базу данных NCBI в качестве референса (Kim et al., 2016). Все последовательности, принадлежащие более чем одному виду бактерий, мы классифицировали как химерные и удалили их. В результате мы нашли наиболее сходные последовательности известных видов бактерий и провели идентификацию всех видов микробиоты N. californicus. Каждый из идентифицированных видов бактерий характеризуется числом относящихся к нему последовательностей в геномном проекте или параметром NumReads, который является ранговой оценкой количества бактерий данного вида в микробиоте. Систематическое положение идентифицированных видов бактерий представлено в виде дерева, построенного в программе Krona (Ondov et al., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Виды бактерий, образующие микробиоту линий N. californicus, были определены в результате метабаркодирования полученных хологеномов по гену 16S rRNA. В результате организм – источник полученных нуклеотидных последовательностей – был определен до вида, и получен список видов бактерий, образующих микробиоту клеща. Мы ограничили свой анализ бактериями, так как идентификация бактерий по генам 16S rRNA максимально надежна, а референсная база имеет минимальное число ошибок, по сравнению с грибами. Каждый из идентифицированных таким образом видов бактерий характеризуется числом чтений, картированных на геном, или числом numReads. Число numReads может быть использовано для ранговой оценки количества бактерий данного вида в микробиоте клеща и, следовательно, дает качественную оценку значимости этого вида бактерий для изучаемой популяции N. californicus. Полученная оценка не является количественной, так как бактерии с прочными клеточными стенками неизбежно будут представлены меньшим числом прочтений, чем виды бактерий с тонкими клеточными стенками из-за разницы в эффективности выделения ДНК. Тем не менее сравнение микробиоты линий BioDefence2 и BioDefence3 возможно, так как выделение ДНК из клещей этих линий проводили одним методом, и состав видов микробиоты обеих линий сходен. Сравнение видового состава микробиоты линий BioDefence2 и BioDefence3 представлено на рис. 2 и в табл. 1.

 

Рис. 2. Сравнение микробиоты сублиний BioDefence. Цветом обозначено число NumResds каждого из таксонов, что является ранговой оценкой количества данного вида в микробиоте. На врезке в центре представлена легенда для цветов диаграммы с соответствием цвета и числа NumResds. Числа в секторах диаграммы соответствуют числу видов бактерий: а – микробиота линии BioDefence2, б – микробиота линии BioDefence3.

 

Таблица 1. Сравнение микробиоты N. californicus линий BioDefence2 и BioDefence3

№	Группа бактерий	Бактериальная микробиота BioDefence2 (исходная линия)	Бактериальная микробиота BioDefence3 (обработанная линия)
1	Enterobacterales		Klebsiella pneumoniae
2			Klebsiella oxytoca
3		Enterobacter sp. LU1
4		Enterobacter sp. RHBSTW-00975
5		Enterobacter hormaechei	Enterobacter hormaechei
6			Enterobacter cloacae
7			Citrobacter freundii
8		Escherichia coli	Escherichia coli
9		Salmonella enterica	Salmonella enterica
10		Mixta intestinalis
11			Serratia marcescens
12		Pantoea dispersa	Pantoea dispersa
13		Proteus mirabilis
14	Xanthomonadales	Stenotrophomonas sp. ASS1
15		Stenotrophomonas sp. WZN-1
16		Stenotrophomonas sp. PAMC25021
17		Stenotrophomonas maltophilia	Stenotrophomonas maltophilia
18		Stenotrophomonas maltophilia R551-3
19		Lysobacter sp. HDW10
20	Pseudomonadales		Pseudomonas fluorescens
21			Pseudomonas protegens
22			Pseudomonas aeruginosa
23			Pseudomonas chlororaphis
24		Pseudomonas putida	Pseudomonas putida
25			Pseudomonas stutzeri
26		Pseudomonas alkylphenolica
27		Pseudomonas sp. S1-A32–2
28		Acinetobacter johnsonii
29		Acinetobacter johnsonii XBB1
30		Acinetobacter baumannii	Acinetobacter baumannii
31	Aeromonadales		Aeromonas hydrophila
32			Aeromonas veronii
33		Aeromonas caviae
34	Vibrionales		Vibrio parahaemolyticus
35	Burkholderiales		Burkholderia cenocepacia
36			Burkholderia cepacia
37			Burkholderia multivorans
38			Burkholderia ubonensis
39			Burkholderia gladioli
40			Burkholderia gladioli pv. gladioli
41			Burkholderia pseudomallei
42			Ralstonia solanacearum
43			Achromobacter denitrificans
44			Achromobacter xylosoxidans
45			Bordetella hinzii

46	Nitrosomonadales	Methylophilus sp. TWE2
47	Hyphomicrobiales		Agrobacterium tumefaciens
48			Rhizobium leguminosarum
49			Bradyrhizobium diazoefficiens
50	Rhodospirillales		Azospirillum brasilense
51	Sphingomonadales		Sphingobium yanoikuyae
52	Actinomycetia	Renibacterium salmoninarum
53		Renibacterium salmoninarum ATCC33209
54		Neomicrococcus aestuarii
55		Leucobacter denitrificans
56		Brevibacterium sp. WO024
57		Amycolatopsis methanolica 239
58			Streptomyces lydicus
59			Streptomyces albus
60			Streptomyces venezuelae
61			Streptomyces lincolnensis
62			Micrococcus luteus
63			Cutibacterium acnes
64			Rhodococcus ruber
65	Bacillales	Staphylococcus succinus
66		Staphylococcus kloosii
67		Peribacillus simplex NBRC15720 = DSM 1321
68		Oceanobacillus sp. 160
69		Kurthia sp. 11kri321
70			Bacillus cereus
71			Bacillus thuringiensis
72	Myxococcales		Myxococcus xanthus
73			Sorangium cellulosum
74	Eubacteriales	Clostridium botulinum
75	Acholeplasmatales	Acholeplasma palmae
76		Acholeplasma axanthum
77	Chroococcidiopsidales	Chroococcidiopsis thermalis PCC7203
78	Synechococcales	Synechococcus sp. JA-3–3Ab
79	Flavobacteriales	Chryseobacterium glaciei
80		Chryseobacterium sp. G0201
81		Chryseobacterium indoltheticum
82		Chryseobacterium carnipullorum
83		Fluviicola taffensis DSM 16823
84	Sphingobacteriales	Sphingobacterium sp. B29
85	Chlorobiaceae	Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1
86		Chlorobium phaeobacteroides DSM 266
87	Thermotogales	Pseudothermotoga hypogea DSM 11164 = = NBRC106472
88		Pseudothermotoga thermarum DSM 5069

Примечания. В сравнение включены первые 50 видов бактерий с максимальным значением параметра NumReads. Патогенные и образующие токсин виды бактерий из состава микробиоты линии BioDefence2 выделены жирным шрифтом.

 

При построении диаграммы использованы первые 50 видов бактерий микробиоты каждой из линий с максимальным значением параметра NumReads. Основу микробиоты обеих линий N. californicus BioDefence2 и BioDefence3 составляют сапрофитные аэробные почвенные бактерии S. maltophilia, Acinetobacter sp. и энтеробактерия Enterobacter hormaechei (Hormaeche and Edwards 1960).

S. maltophilia – почвенная аэробная грамм-негативная, подвижная бактерия, биопленкообразователь и оппортунистический патоген человека, высокоустойчивый к большинству антибиотиков. Эта бактерия также является компонентом микробиоты ротовой полости разводимых в террариумах видов змей (Hejnar et al., 2007). У близкородственного вида фитосейид N. cucumeris данный вид отмечается, но как малочисленный (Pekas et al., 2017). Напротив, S. kloosii, образующий основу микробиоты N. cucumeris, у N. californicus найден в небольшом количестве и только в линии BioDefence2. Так как S. maltophilia и S. kloosii относятся к одной экологической группе бактерий – почвенные сапрофиты, то, вероятно, они могут замещать друг друга у разных видов фитосейидных клещей. Вполне закономерно, что вторая по массовости группа бактерий микробиоты образована кишечными бактериями E. hormaechei и E. coli. Эти виды бактерий, предпочитающие среду с высокой концентрацией аминокислот, отражают особенности питания N. californicus животной пищей с высокой долей белков.

Интересно наличие в линии BioDefence2 необычной для членистоногих внутриклеточной патогенной бактерии R. salmoninarum, способной инфицировать рыб и распространяться в их популяциях как “горизонтально” путем инфекционной передачи между особями, так и “вертикально” через икру (Rozas-Serri et al., 2020). Также в линии BioDefence2 обнаруживается высокая численность токсин-образующей бактерии Clostridium botulinum (van Ermengem 1896) Bergey et al. 1923. Оптимизация микробиоты в линии BioDefence3 устраняет оба эти вида бактерий.

Сравнение микробиоты линий BioDefence2 и BioDefence3 позволяет выделить группу бактерий, обнаруживаемых в обеих линиях клещей, кроме тех, что были перечислены ранее. К ним относятся почвенные бактерии и оппортунистические патогены человека: Pseudomonas putida (Trevisan 1889), Salmonella enterica (ex Kauffmann & Edwards 1952) Le Minor & Popoff 1987), Pantoea dispersa (Gavini et al. 1989), Acinetobacter baumannii (Bouvet and Grimont 1986). Устойчивость их в микробиоте N. californicus возможно связана с природной устойчивостью некоторых штаммов этих бактерий к большинству антибиотиков (Yang et al., 2023).

Существенные изменения микробиоты линий BioDefence2 и BioDefence3 ставят вопрос о влиянии этих изменений на жизнеспособность и эффективность размножения клещей. Для количественного сравнения эффективности размножения клещей измеренной числом полученных клещей в стандартных опытах, линии клещей BioDefence2 и BioDefence3 культивировали параллельно в одном помещении и в одинаковых условиях, обеспечивающих оптимальную скорость роста на плотах, как описано в разделе “Материалы и методы”. Подсчеты числа клещей проводили на 7-й день эксперимента. Выявлено достоверное увеличение числа полученных клещей линии BioDefence3 по сравнению с контрольной линией BioDefence2 (рис. 3).

 

Рис. 3. Демографическая структура клещей в линиях BioDefence2 и BioDefence3 на 7-й день эксперимента. Синим цветом показана линия BioDefence2, красным цветом – линия BioDefence3. Отрезками указаны 95% доверительные интервалы ошибки доли. По вертикальной оси – доля группы клещей во всей выборке. По горизонтальной оси – группы клещей. Суммированы данные 30 повторностей эксперимента на листовых вырезках для каждой из линий. Всего получено 1576 клещей всех возрастов линии BioDefence2 и 1967 клещей линии BioDefence3.

 

Для характеристики жизнеспособности опытной и контрольной популяций мы оценивали внешний вид самок по двухбалльной шкале. Нормальные активно питающиеся самки имеют вздутое тело, причем степень вздутия увеличивается у самок, несущих яйца (рис. 1б). Помимо нормальных самок в популяции всегда есть некоторое количество вялых самок с плоским телом, которые практически не питаются. Причин этого явления может быть много, но одной из вероятных причин может быть наличие патогенных видов бактерий, вызывающих отравление клещей. На основании визуального наблюдения мы разделили всех самок на плоских и нормальных. Наблюдаются достоверное снижение доли плоских самок с 20% в контрольной группе до 6% в линии BioDefence3 и увеличение числа полученных в эксперименте взрослых клещей, как самцов, так и самок (рис. 3). Результаты количественных подсчетов роста популяции в контролируемых условиях эксперимента свидетельствуют об эффективности двойной последовательной обработки популяции клеща тетрациклином и пробиотиком B. subtilis для стабилизации размножения культуры N. californicus.

Данные геномного секвенирования позволяют провести генетическую идентификацию линий клещей. Для этого мы извлекли из полученных геномов линий BioDefence2 и BioDefence3 последовательности гена18S rRNA и провели их сравнительный анализ. Как и ожидалось, нуклеотидная последовательность гена 18S rRNA длиной 1181 п. о. идентична у линий BioDefence2 и BioDefence3 и отличается от генетически охарактеризованных линий N. californicus уникальными нуклеотидными заменами. Наибольшее сходство полученных нами последовательностей наблюдается с последовательностями гена 18S rRNA N. californicus, опубликованными в работе (Sonoda et al., 2012). Различия ограничены точковыми мутациями. Замены G на A наблюдаются в позициях 134, 302 и 1045 при сравнении с генотипами изолятов 89NcSPN1, 02NcaCI и 87NcFT1 соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данном сообщении мы приводим результаты метабаркодирования микробиоты N. californicus по гену 16S rRNA и сравнительного анализа изменений микробиоты двух полученных нами линий N. californicus BioDefence2 и BioDefence3 в результате обработки тетрациклином и пробиотическими бактериями B. subtilis. Ранее метабаркодирование микробиоты N. californicus было проведено в работе Мерлина с соавторами (Merlin et al., 2023). В ней было показано, что основу микробиоты N. californicus составляют бактерии из родов Stenotrophomonas, Pseudomonas, Flavobacterium, Enterococcus, Bacillus, Paenibacillus. Совпадение c нашими данными наблюдается в случае Stenotrophomonas, Pseudomonas и Bacillus. Эти бактерии наиболее вероятно являются обязательными компонентами микробиоты N. californicus, и среди них можно ожидать наличия пробиотических штаммов, повышающих жизнеспособность популяции клещей и защищающих их от патогенных и условно патогенных микрооганизмов. Аналогичный результат недавно был получен при изучении микробиоты P. persimilis (Sumner-Kalkun et al., 2023). В составе микробиоты P. persimilis была обнаружена бактерия S. odorifera, а затем были показаны пробиотические свойства найденного штамма для клеща P. persimilis.

Наличие в микробиоте N. californicus бактерий, известных образователей токсинов, позволяет предполагать, что в настоящее время состав микробиоты культуры N. californicus не является оптимальным. Для оптимизации микробиоты клещей необходимы удаление патогенных видов бактерий и замена их на пробиотические виды бактерий.

В данной работе мы показали возможность улучшения параметров материнских культур N. californicus, выращенных на паутинном клеще T. urticae. Устранение чувствительной к тетрациклину микрофлоры клещей и модуляция микробиоты N. californicus путем обработки популяции пробиотической бактерией Bacillus subtilis приводят к увеличению скорости роста популяции N. californicus и снижению доли неактивных клещей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ имеющейся литературы показывает, что жизнеспособность и эффективность применения популяций фитосейидных клещей как агентов биоконтроля в значительной степени зависит от состава микробиоты линии. Без необходимого контроля популяция клещей быстро накапливает патогенные виды бактерий в составе своей микробиоты и становится неэффективной как агент биоконтроля. Субклонирование популяции путем получения линии от одной самки является эффективным методом устранения патогенных микроорганизмов. Вторым подходом к повышению эффективности применения фитосейидных клещей является моделирование микробиоты системы: “фитосейидный клещ – кормовой клещ” на стадии лабораторного разведения. В представленной работе мы применили оба подхода для оптимизации микробиоты популяции клещей искусственного разведения N. californicus. Клещи полученной нами линии BioDefence3 очищены от патогенных бактерий R. salmoninarum и C. botulinum. Удаление бактерий, продуцирующих токсины, коррелирует с уменьшением доли “неэффективных” самок, что указывает на перспективность предложенного подхода для поддержания жизнеспособности популяций N. californicus.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ), грант 22-24-00727.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека и животных, соответствующих критериям Директивы 2010/63/EU.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

B. V. Andrianov

Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: andrianovb@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119333

L. A. Uroshlev

Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: leoniduroshlev@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119333

O. V. Vasilenko

All-Russia Collection of Microorganisms, G. K. Skryabin Institute of the Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences

Email: ovvasilenko@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

Y. I. Meshkov

All-Russia Scientific Research Institute of Phytopathology

Email: yimeshkov@rambler.ru
Russian Federation, Moscow Oblast, Odintsovsky District, Bolshiye Vyazyomy, 143050

References

Supplementary files