Scorpion Neurotoxin BeM9 Derivative Uncovers Unique Interaction Mode with Nav1.5 Sodium Channel Isoform

Full Text

Сокращения: МД – молекулярная динамика; ПД – поровый домен; ПЧД – потенциал-чувствительный домен; ВеМ9 – α-подобный нейротоксин М9 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus; BeM9^GG – производное нейротоксина с двумя заменами аминокислотных остатков в соответствующих позициях на глицин (A4G и Y17G); Naᵥ – потенциал-чувствительные натриевые каналы; BgNaᵥ1 – Naᵥ таракана; α-NaTx – α-нейротоксины скорпионов; Trx – тиоредоксин.

ВВЕДЕНИЕ

Изучение потенциал-чувствительных натриевых каналов (Naᵥ) важно как для фундаментальной биологии, так и для фармакологии, поскольку они отвечают за формирование потенциала действия и тем самым обеспечивают работу электровозбудимых клеток: нейронов и миоцитов. Главная α-субъединица Naᵥ – это трансмембранный псевдотетрамер из четырех гомологичных, но различающихся повторов (D I–IV) в составе единой полипептидной цепи длиной ~2000 а.о. В каждом повторе можно выделить потенциал-чувствительный домен (ПЧД, трансмембранные спирали S1–S4), запускающий конформационные перестройки в ответ на сдвиг мембранного потенциала. При этом непосредственным сенсором потенциала служит сегмент S4, содержащий регулярно расположенные положительно заряженные остатки и переходящий при деполяризации мембраны из положения “вниз”, соответствующего неактивированному каналу, в положение “вверх” при активации. Спирали S5 и S6 из всех четырех повторов формируют единый пóровый домен (ПД), способный селективно пропускать ионы натрия. Активация ПЧД I–III приводит к открытию ПД, а ПЧД IV отвечает за быструю инактивацию канала, во время которой ПД снова перестает пропускать Na⁺ [1, 2].

В то время как у большинства насекомых имеется лишь один ген, кодирующий Naᵥ, у млекопитающих их несколько, а соответствующие изоформы белка называются Naᵥ1.1–1.9. Поскольку Naᵥ крайне важны для работы нервной системы и мышц, они служат мишенью для множества нейротоксинов, связывающихся с Naᵥ и имеющими изоформ-зависимую активность. Так, один из важнейших компонентов яда скорпионов – так называемые “α-токсины” (α-NaTx) – селективно связываются с ПЧД IV и ингибируют инактивацию канала. Это небольшие белки, состоящие из ~65 а.о., их укладка представлена β-листом из трех β-тяжей, короткой α-спиралью и стабилизирована четырьмя S–S-мостиками. Некоторые α-NaTx действуют преимущественно на каналы насекомых (инсектотоксины), другие активны на разных изоформах каналов млекопитающих (млекотоксины), а третьи характеризуются широким профилем активности (α-подобные токсины). На рис. 1 приведены аминокислотные последовательности нескольких α-NaTx, относящихся к трем группам (а), и общая укладка этих токсинов (б). Некоторые млекотоксины селективны в отношении отдельных изоформ Naᵥ: к примеру, MeuNaTxα-2 селективен к Naᵥ1.4 [3], а OD1 – к Naᵥ1.7 [4].

Несмотря на большой массив данных, до сих пор не ясно, как управлять селективностью α-NaTx, получая с помощью рационального дизайна производные токсинов с заданными свойствами – молекулярные зонды для исследований нервной системы и прототипы лекарств. Ранее мы показали наличие у α-NaTx модульной структуры, в которой к жесткой основе – так называемому “сердцевинному” модулю – прикрепляется “модуль специфичности”, отвечающий за селективное узнавание конкретной изоформы Naᵥ и состоящий из N-концевой RT-петли, β₂–β₃-петли и C-концевой области, соединенной с RT-петлей дисульфидной связью (рис. 1б) [5]. Последовавшее определение структуры комплексов Naᵥ с α-NaTx (рис. 1в) подтвердило, что взаимодействует с каналом именно модуль специфичности [6, 7].

 

Рис. 1. Структурные особенности α-NaTx. (а) – Сравнение аминокислотных последовательностей представителей разных групп α-NaTx. Розовым обозначена α-спираль, голубым – β-тяжи, оттенками зеленого – различные участки модуля специфичности: светлый – RT-петля, темнее – β₂–β₃-петля, темный – C-концевая область. Малиновым выделены “шарнирные” глицины (остатки 4 и 17 по нумерации Aah2); (б) – пространственная организация α-NaTx на примере млекотоксина Aah2. Цветовые обозначения аналогичны панели (а). Желтым показаны дисульфидные мостики; (в) – общий вид взаимодействия α-NaTx с натриевыми каналами на примере комплекса Lqh3–hNaᵥ1.5 [7]. Naᵥ изображен цветной поверхностью с индивидуально раскрашенными гомологичными повторами D I–IV (ПД более блеклый, ПЧД – яркий). Бордовым показан Lqh3.

 

Расчеты молекулярной динамики (МД) и анализ гидрофобных свойств выявили, что модуль специфичности млекотоксинов более подвижный и гидрофильный в сравнении с токсинами, активными в отношении Naᵥ насекомых. В той же работе мы указали, что более высокая подвижность всего модуля может быть обусловлена парой консервативных для млекотоксинов остатков глицина (G4 и G17, нумерация по Aah2, отмечены малиновым цветом на рис. 1), выступающих для RT-петли подобно шарниру. In silico мутагенез этой пары остатков показал снижение подвижности, а встречная замена на глицин в структуре инсектотоксина, напротив, ее повышала, позволив предложить направление дизайна специфических вариантов α-NaTx.

На основе представления о модульном строении α-NaTx мы продолжаем серию работ по мутагенезу одного из наиболее изученных α-подобных токсинов M9 (BeM9) из яда скорпиона Mesobuthus eupeus [8]. Ранее специфичность BeM9 удалось изменить, получив селективный инсектотоксин [9]. С целью получения селективных млекотоксинов мы синтезировали производное BeM9 с введением указанных выше “шарнирных” глицинов: A4G и Y17G (BeM9^GG) и изучили его активность. Неожиданная специфическая утрата активности BeM9^GG в отношении Naᵥ1.5 и нюансы строения комплекса α-NaTx с этой изоформой позволили нам предположить особую роль мембраны.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн и получение BeM9^GG. Анализ аминокислотных последовательностей α-NaTx (рис. 1) показывает, что у млекотоксинов RT-петля чаще всего ограничена двумя консервативными остатками глицина, предположительно придающими ей более высокую подвижность. Это G4 в β₁-тяже и G17 сразу после второго остатка цистеина и перед α-спиралью. У α-подобного токсина BeM9 в аналогичных позициях расположены остатки A4 и Y17. Мы предположили, что замена обоих этих остатков на глицин увеличит подвижность RT-петли и всего модуля специфичности, уменьшив сродство к Naᵥ насекомых и сдвинув профиль специфичности в сторону млекотоксинов [5].

ДНК, кодирующую BeM9 с заменами A4G и Y17G (BeM9^GG), синтезировали с помощью ПЦР из перекрывающихся олигонуклеотидов, после чего клонировали в составе бактериального экспрессионного вектора с целью получения рекомбинантного продукта. Мы использовали традиционный подход к получению дисульфид-богатых полипептидов: BeM9^GG был наработан в составе гибридного белка с тиоредоксином (Trx), необходимым для корректного формирования дисульфидных связей. Trx-BeM9^GG получили в бактериальной системе и выделили с помощью аффинной хроматографии, после чего целевой продукт отделили от Trx с использованием бромциана. Хроматографической чистоты > 95% достигали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход составил 2 мг с 1 л среды LB. Очищенный образец характеризовали с помощью MALDI масс-спектрометрии: измеренная средняя молекулярная масса BeM9^GG составила 7215.2 Да (расчетное значение 7215.1 Да).

Активность BeM9^GG в отношении Naᵥ. Эффекты BeM9^GG были изучены в сравнении с исходным токсином в концентрации 1 мкМ в отношении ряда Naᵥ. Мы применили стандартный подход, подразумевающий экспрессию генов каналов (α-субъединиц и соответствующих вспомогательных β-субъединиц) в ооцитах Xenopus laevis. Мы оценили активность BeM9^GG на четырех изоформах Naᵥ млекопитающих (rNaᵥ1.2, rNaᵥ1.4, hNaᵥ1.5 и mNaᵥ1.6) и в отношении канала таракана BgNaᵥ1 (табл. 1). Активность BeM9^GG оказалась снижена по сравнению с исходным токсином, при этом в отношении Naᵥ1.5 в концентрации 1 мкМ активность не наблюдалась вовсе.

 

Таблица 1. Активность BeM9 и BeM9^GG в отношении Naᵥ

Токсин	rNaᵥ1.2	rNaᵥ1.4	hNaᵥ1.5	mNaᵥ1.6	BgNaᵥ1
BeM9	Н/а (3)	0.23 ± 0.03 (4)	0.46 ± 0.03 (3)	0.60 ± 0.04 (8)	1.93 ± 0.05 (7)
BeM9GG	Н/а (4)	0.07 ± 0.01 (3)	Н/а (2)	0.17 ± 0.04 (4)	0.52 ± 0.01 (2)

 

Модель комплекса α-NaTx–Naᵥ подсказывает причину утраты активности BeM9^GG на Naᵥ1.5. Для того чтобы объяснить наблюдаемый эффект, мы обратились к известным структурам комплексов Naᵥ с токсинами, построили модели комплексов с BeM9 и провели МД. В 2019 г. методом криоэлектронной микроскопии была получена первая структура комплекса химерного Naᵥ (ПЧД IV от hNaᵥ1.7, каркас от канала таракана NaᵥPas) с млекотоксином Aah2 (PDB ID: 6NT4) [6]. Эта структура наглядно подтвердила нашу гипотезу модульного строения α-NaTx: модуль специфичности токсина и оказался той частью, которая связывается с Naᵥ: RT-петля направлена в сторону ПД I, β₂–β₃-петля – в сторону спиралей S2 и S3 ПЧД IV, а С-конец – в сторону ПД I и петли S3–S4 ПЧД IV; остальная часть токсина (сердцевинный модуль) с каналом не взаимодействует (рис. 1в, 2а).

В 2021 г. была получена еще одна структура – комплекса α-подобного токсина Lqh3 с Naᵥ1.5 человека (PDB ID: 7K18; рис. 2б) [7]. В общем похожая, в деталях она заметно отличается от комплекса Aah2–Naᵥ1.7: в ней модуль специфичности не дотягивается до ПД I и S4 ПЧД IV, а сам токсин глубже погружается в “ложбину” между спиралями S2 и S3 ПЧД IV, вероятно активно взаимодействуя при этом с мембраной сердцевинным модулем (а именно N-концевой частью α-спирали). Возможно, это связано с тем, что в спирали S2 ПЧД IV у Naᵥ1.5 остаток, формирующий “опору” для петли β₂–β₃, намного меньше (аланин), чем в ряде других каналов (обычно тирозин; рис. 2в). В результате токсин садится глубже между S2 и S3 (рис. 2г, д), предположительно более интенсивно при этом взаимодействуя с мембраной. Мы предполагаем, что различия в структуре комплексов Aah2–Naᵥ1.7 и Lqh3–Naᵥ1.5 смогут указать причину потери активности BeM9^GG в отношении hNaᵥ1.5.

 

Рис. 2. Различие структуры комплексов Naᵥ с α-NaTx. (a, б) – Сайт связывания α-NaTx с Naᵥ в мембране. Голубым выделен ПЧД IV канала, зеленым – ПД I (виден гликан), розовым и малиновым показаны токсины; (в) – сравнение фрагментов аминокислотных последовательностей S2 и S3 ПЧД IV. Желтым выделены так называемые “опорные” остатки, определяющие характер посадки β₂–β₃-петли α-NaTx; (г, д) – посадка β₂–β₃-петли α-NaTx на “опорные” остатки S2–S3 ПЧД IV. Цветовые обозначения аналогичны панелям (а, б), желтым показаны “опорные” остатки.

 

Lqh3, активный в отношении Naᵥ1.5, имеет G4, как и BeM9^GG, однако при этом в 17-м положении у него расположен ароматический остаток, как у нативного BeМ9 (рис. 1а). Согласно структуре комплекса Lqh3–Naᵥ1.5 (PDB ID: 7K18), F17 у Lqh3 глубоко погружен в мембрану (рис. 2б). Сродство этого остатка к мембране может быть важно именно в случае hNaᵥ1.5 ввиду особой посадки токсина в ложбине между S2 и S3. В этом случае потеря гидрофобного остатка (замена Y17G) снижает сродство к мембране и не позволяет сформировать высокоаффинный комплекс (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние мутации Y17G на связывание BeM9 с Naᵥ. Голубым выделен ПЧД IV канала, зеленым – ПД I, розовым – токсин BeM9, темно-красным показан остаток Y17, направленный в сторону мембраны у BeM9 и замещенный на глицин у BeM9GG. (a) – Модель комплекса BeM9–hNaᵥ1.5, полученная пространственным совмещением с Lqh3 из комплекса 7K18. Видно, что остаток Y17 у BeM9 заглублен в мембрану; (б) – модель комплекса BeM9–mNaᵥ1.6 (построение модели см. в “Эксперим. части”).

 

Мы собрали данные по активности различных токсинов в отношении Naᵥ1.5, чтобы проиллюстрировать нашу гипотезу о важности их взаимодействия с мембраной (табл. 2). В большинстве случаев выраженная активность в отношении Naᵥ1.5 у α-NaTx коррелирует с наличием в 17-й позиции гидрофобного остатка.

 

Таблица 2. Активность α-NaTx в отношении Naᵥ1.5

Токсин	Активность	Остаток 17	Комментарии
BeM9	Активен при 1 мкМ [5]	Y	–
BeM9GG	Не активен при 1 мкМ	G	–
BeM9E	Активен при 1 мкМ [9]	Y	Активность слабая, но в отношении других каналов млекопитающих упала сильнее
BeM9EG	Не активен при 1 мкМ [9]	G	–
msBeM9	Не активен при 1 мкМ [10]	G	–
Lqh2	EC50 = 11.5 нМ [11]	G	На порядок более активен в отношении других каналов [12]
Lqh3	EC50 = 2.5 нМ [11]	F	–
Lqh6	Активен при 1 мкМ [13]	I	–
Lqh7	Активен при 1 мкМ [13]	F	–
LqhαIT	EC50 = 32.9 нМ [11]	F	Инсектотоксин
MeuNaTxα-1	Не активен при 1 мкМ [3]	G	–
MeuNaTxα-2	Не активен при 1 мкМ [3]	A	–
MeuNaTxα-4	Не активен при 2 мкМ [3]	F	Инсектотоксин
MeuNaTxα-5	Активен при 2 мкМ [3]	F	–
MeuNaTxα-12	Не активен при 10 мкМ [14]	A	–
MeuNaTxα-13	Не активен при 10 мкМ [14]	F	Отличается последовательность β₂–β₃
BmK M1	EC50 = 195 нМ [15]	A	–
OD1	Активен при 4 мкМ [4]	A	–
Ts2	Активен при 1 мкМ [16]	F	Короткая β₂–β₃-петля, вероятно, другой паттерн связывания
Ts3	Не активен при 500 нМ [17]	F
Ts4	Не активен при 500 нМ [18]	F
Ts5	Активен при 1 мкМ [19]	F

Примечание: EC₅₀ – полумаксимальная эффективная концентрация, означает концентрацию лиганда, которая вызывает эффект, равный половине максимального возможного для этого лиганда. В данном случае подразумевается ингибирование инактивации.

 

Примечание: для каналов млекопитающих первая буква означает организм: r – крыса, h – человек, m – мышь. Н/а – нет активности. Указаны значения I_{30 мс}/I_peak или I_{5 мс}/I_peak (для Naᵥ1.5; см. пояснения в “Эксперим. части”). Приведены средние значения ± стандартные отклонения, в скобках указано число независимых экспериментов (n).

К наиболее важным контрпримерам отнесем Lqh2, MeuNaTxα-4 и токсины из рода скорпионов Tityus. Lqh2, несмотря на сравнительно высокую активность, все же более активен на каналах Naᵥ1.2 и 1.4 [12]. MeuNaTxα-4 вообще не активен на каналах млекопитающих, что, вероятно, связано с другими отличиями его структуры. Токсины Ts2–5 сильно отличаются от классических α-NaTx из-за короткой β₂–β₃-петли, поэтому к ним общая модель связывания не применима.

Для более основательной проверки гипотезы роли взаимодействия α-NaTx с мембраной (посредством остатков в позициях 17, 41 и, возможно, других) в связывании с Naᵥ1.5 потребуются дополнительные эксперименты. Среди таких экспериментов можно назвать получение следующих производных: 1) BeM9^Y17G с единичной заменой (должен потерять аффинность к Naᵥ1.5); 2) Lqh2^G17F/Y (взаимодействие должно усилиться); 3) Lqh3^F17G (взаимодействие должно ослабнуть). Кроме того, необходимо проведение МД моделей комплексов α-NaTx–Naᵥ1.5 в явно заданной липидной мембране для детальной характеристики взаимодействий токсина с каналом и мембраной.

Помимо этого выявленное отличие в строении “ложбины” между S2 и S3 в ПЧД IV различных Naᵥ (рис. 2в–д) позволяет предсказать различный способ взаимодействия токсинов с каналами млекопитающих: с Naᵥ1.7, а также Naᵥ1.2, 1.4 и 1.6 (тирозин в “ложбине”) токсин будет располагаться “выше” (как на рис. 2б), слабее взаимодействуя – с мембраной; а с Naᵥ1.5, а также Naᵥ1.1, 1.3, 1.8 и 1.9 (“ложбина” образована остатками S, A, G или D) токсин получает возможность опуститься “ниже” в ПЧД, одновременно слабее взаимодействуя с ним и сильнее – с мембраной. Наличие заряженного остатка аспарагиновой кислоты у Naᵥ1.9 открывает дополнительные перспективы по созданию действующих на эту изоформу полипептидов, несущих положительный заряд.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение рекомбинантных производных BeM9. Синтез нуклеотидной последовательности, кодирующей BeM9^GG, проведен с помощью лигирования олигонуклеотидных фрагментов (табл. 3) и ПЦР аналогично описанной ранее процедуре [5, 20]. Полученную полноразмерную последовательность клонировали в составе экспрессионного вектора pET-32b (Novagen, США; вставка по сайтам рестрикции KpnI и BamHI). В результате в составе вектора pET-32b-BeM9^GG имеется химерный ген гибридного белка Trx-BeM9^GG.

 

Таблица 3. Олигонуклеотиды для синтеза гена BeM9^GG

Название	Последовательность
M9GGf1	ATATGGTACCATGGCTCGTGACGGTTACATCGCA
M9GGf2	AACCGCACAACTGCGTTTACGAATGCGGCAACCCGAAAGGTTCTT
M9f3	ACTGCAACGACCTGTGCACCGAAAACGGTGCTGAATCTGGTTACT
M9f4	GCCAGATCCTGGGTAAATACGGTAACGCTTGCTGGTGCATCCA
M9f5	GCTGCCGGACAACGTTCCGATCCGTATCCCGGGTAAATGCC
M9GGr1/2	AAACGCAGTTGTGCGGTTTAGCGATGTAACCGTCAC
M9GGr2/3	TGCACAGGTCGTTGCAGTAAGAACCTTTCGGGTTGC
M9r3/4	ATTTACCCAGGATCTGGCAGTAACCAGATTCAGCAC
M9r4/5	GAACGTTGTCCGGCAGCTGGATGCACCAGCAAGC
M9r	GCATGGATCCCTAGTGGCATTTACCCGGGATAС

Примечание: полужирным шрифтом выделены старт- и стоп-кодоны, подчеркнуты сайты рестрикции для последующей вставки в плазмиду.

 

Экспрессию химерных генов проводили в штамме Escherichia coli BL21(DE3) [21]. Культуру бактерий, трансформированных с использованием экспрессионного вектора, выращивали на среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивном перемешивании до достижения средней логарифмической фазы. Индукцию экспрессии целевого гена осуществляли добавлением в среду 0.2 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида, после чего культуру инкубировали еще 4 ч. По истечении этого времени бактерии осаждали, ресуспендировали в стартовом буфере для аффинной хроматографии (300 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5) и лизировали с помощью ультразвука.

Слитные белки имели в своем составе гексагистидиновую последовательность, которая позволяла проводить их очистку с помощью металл-хелатной хроматографии [22] на сорбенте TALON Superflow Metal Affinity Resin (Clontech, США). Элюцию сорбированных белков проводили буфером, содержащим имидазол (150 мМ имидазол, 300 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5). BeM9^GG не содержит остатков метионина, поэтому целевой полипептид отщепляли от Trx с помощью бромциана по описанной методике [23]. Для этого в последовательность химерного гена был специально введен метиониновый кодон непосредственно перед геном токсина. Очистку от нецелевых продуктов реакции проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, как описано для BeM9 [5].

Масс-спектрометрия. Полипептиды анализировали с помощью времяпролетной MALDI масс-спектрометрии. Использовали спектрометр Ultraflex TOF-TOF (Bruker Daltonik, Германия), анализ проводили как описано ранее [24]. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (Sigma-Aldrich, США). Измерения проводили в линейном режиме. Масс-спектры анализировали с помощью программного обеспечения Data Analysis 4.3 (Bruker, Германия).

Электрофизиология. Активность полученного производного сравнивали с исходным токсином BeM9 по эффекту в отношении Naᵥ, экспрессированных в ооцитах лягушки X. laevis. Выделение ооцитов, получение РНК, а также сбор и анализ данных проводили, как описано ранее [5, 10]. Использовали гены ряда изоформ Naᵥ млекопитающих (Naᵥ1.2 и 1.4 крысы (r), Naᵥ1.5 человека (h), Naᵥ1.6 мыши (m), вспомогательных субъединиц rβ1 и hβ1), а также α-субъединицы BgNaᵥ1 и вспомогательной субъединицы TipE таракана Blattella germanica и дрозофилы соответственно. Для оценки эффективности токсинов мы использовали величину, равную отношению регистрируемого тока через мембрану ооцита спустя 30 мс после подачи тестового импульса к пиковому току (I_{30 мс}/I_peak). В случае канала Naᵥ1.5 из-за особой кинетики его работы использовали отношение тока через 5 мс после тестового импульса к пиковому току (I_{5 мс}/I_peak). Все данные анализировали с помощью программного обеспечения pClamp Clampfit версии 10.4 (Molecular Devices, CША) и Origin Pro версии 8.0 (OriginLab, США).

Молекулярное моделирование. Внутримолекулярные эффекты от замен в структуре BeM9 оценивали с помощью сравнительного моделирования токсина дикого типа (PDB ID: 5MOU) и его производного. Модель BeM9^GG была получена с помощью моделирования по гомологии в программе MODELLER v. 9.19 [25]. Три лучшие модели из 20, по внутренней оценке программы, использовали как стартовые конформации для проведения трех реплик МД, а для нативного BeM9 – первую из ЯМР-ансамбля конформаций также в трех независимых запусках МД.

Для МД использовали программу GROMACS 5.1.2 [26] и силовое поле Amber99sb-ildn.ff [27]. Радиус отсечки ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий составил 10 и 12 Å соответственно. Для МД построили кубические ячейки (55 × 55 × 55 ų для токсинов и 120 × 120 × × 120 ų для комплексов) c моделью воды SPC [28], содержащие противоионы для электронейтральности и уравновешенные по энергии путем нагревания до 300 К в течение 100 пс. МД проводили в периодических граничных условиях при Т = 300 К, P = 1 бар, поддерживаемых при помощи термостата V-rescale [29] и баростата Берендсена [30] соответственно. Длина и шаг траектории составили 100 нс и 2 фс соответственно. Для каждой изучаемой молекулы было проведено по три расчета для накопления статистических данных. Для сравнения объектов между собой использовали t-критерий Стьюдента.

Для объяснения эффекта мутации Y17G в BeM9 строили модели комплексов токсина с Naᵥ, использованными для измерения токов – hNaᵥ1.5 и mNaᵥ1.6. Комплекс BeM9–hNaᵥ1.5 получали прямой заменой токсина Lqh3 на BeM9 после пространственного совмещения в структуре 7K18. Модель BeM9–mNaᵥ1.6 строили следующим образом: сначала с использованием метода гомологии и программы MODELLER строили полную модель mNaᵥ1.6 по структуре канала hNaᵥ1.6 (PDB ID: 8FHD). Однако, поскольку для Naᵥ1.6 пока не была определена структура комплекса ни с одним α-NaTx, его ПЧД IV находится в активированном состоянии ввиду отсутствия потенциала (положение S4-сенсора “вверх”). Далее неактивированное состояние ПЧД IV mNaᵥ1.6 было смоделировано отдельно по гомологии со структурой комплекса Aah2 с химерой hNaᵥ1.7– NaᵥPas, S4-сенсор которой в связи с ингибированием токсином Aah2 находится в нужном нам положении “вниз”. На последнем шаге активированный ПЧД IV из первой модели заменяли на неактивированный из второй, после чего структуру релаксировали. Полученная таким образом модель mNaᵥ1.6 имеет неактивированный S4-сенсор в ПЧД IV, пригодный для моделирования комплексов с α-NaTx. BeM9 в этот комплекс помещали путем пространственного совмещения с Aah2 в оригинальной структуре 6NT4, оставляя вместо структуры “химерного” канала полученную модель mNaᵥ1.6 с неактивированным ПЧД IV.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для проверки гипотезы о важности “шарнирных” глицинов в воздействии α-NaTx на Naᵥ млекопитающих мы получили производное α-подобного токсина BeM9 с заменами A4G и Y17G. Для этого мы использовали бактериальную систему экспрессии и белок-помощник Trx. Мы оценили активность BeM9^GG в отношении каналов млекопитающих и насекомого по сравнению с исходным токсином. Вопреки нашим ожиданиям, BeM9^GG оказался менее активным на каналах млекопитающих и вовсе утратил активность по отношению к изоформе Naᵥ1.5. Для объяснения такого эффекта мы обратились к компьютерному моделированию. Анализ структуры комплексов Naᵥ с токсинами позволил предположить вероятный механизм, учитывающий роль мембранного окружения каналов. Наша работа открывает дополнительные возможности рационального дизайна селективных лигандов Naᵥ, которые могут быть использованы для разработки фармацевтических препаратов и инструментов для изучения нейронов на молекулярном уровне.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 22-14-00395).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все манипуляции с лягушками проводили в соответствии с принципами ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) и Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS123, Страсбург, 18.III.1986).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

M. A. Chernykh

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

M. A. Duzheva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; D.I. Mendeleev Russian University of Chemical Technology

Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; Miusskaya pl. 9, Moscow, 125047

N. A. Kuldyushev

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

S. Peigneur

KU Leuven, ON II

Email: avas@ibch.ru
Belgium, Herestraat 49, box 922, 3000, Leuven, Belgium

A. A. Berkut

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

J. Tytgat

KU Leuven, ON II

Email: avas@ibch.ru
Belgium, Herestraat 49, box 922, 3000, Leuven

A. A. Vassilevski

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. O. Chugunov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: avas@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

References

Supplementary files