Photocleavable Guide RNA for Photocontrolable CRISPR/Cas9 System

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

The development of gene editing systems on the base of CRISPR/Cas having higher efficacy, specificity, and possibility of their activity regulation by light irradiation is actually problem. Modification of CRISPR/Cas components, in particular guide RNA, by introduction of photocleavable linkers is the prospective approach for the solution of this problem. We developed the approach for the synthesis of photocleavable guide sgRNA for the CRISPR/Cas9 system containing the linkers on the base of 1-(2-nitrophenyl)-1,2-ethanediol. Such photomodified guide RNAs degrade upon UV-irradiation and CRISPR/Cas9 system is inactivated. We obtained three variants of photomodified sgRNA with different photolinker positions. It was demonstrated that sgRNA variant with photolinker introduced in the Cas9 protein binding and hairpins formation region is able to effectively guide Cas9 nuclease for DNA-target cleavage before UV-irradiation and lose its activity after irradiation. The conditions of controllable 40%-cleavage of model DNA-target were chosen. Developed approach provide specific inactivation of CRISPR/Cas9 gene editing system in specific time moment in definite place. Photoregulation of gene editing system permits not only reduce the undesirable off-target effects, but also becomes the basis of genetic disease therapy.

Full Text

Restricted Access

About the authors

E. A. Akhmetova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090

I. P. Vokhtancev

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

M. I. Meschaninova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090

M. A. Vorobyeva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090

D. O. Zharvov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

D. S. Novopashina

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Author for correspondence.
Email: danov@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

References

  1. Wang J.Y., Pausch P., Doudna J.A. // Nat. Rev. Microbiol. 2022. V. 20. P. 641–656. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4
  2. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas Č., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. // Nat. Rev. Microbiol. 2020. V. 18. P. 67–83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
  3. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. // Science. 2012. V. 337. P. 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829
  4. Wang J.Y., Doudna J.A. // Science. 2023. V. 379. P. 8643. https://doi.org/10.1126/science.add8643
  5. Li T., Yang Y., Qi H., Cui W., Zhang L., Fu X., He X., Liu M., Li P.-F., Yu T. // Sig. Transduct. Target. Ther. 2023. V. 8. P. 36. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01309-7
  6. Filippova J., Matveeva A., Zhuravlev E., Stepanov G. // Biochimie. 2019. V. 167. P. 49–60. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.09.003
  7. Liu Y., Zou R.S., He S., Nihongaki Y., Li X., Razavi S., Wu B., Ha T. // Science. 2020. V. 368. P. 1265–1269. https://doi.org/10.1126/science.aay8204
  8. Jain P.K, Ramanan V., Schepers A.G., Dalvie N.S., Panda A., Fleming H.E., Bhatia S.N. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016. V. 55. P. 12440–12444. https://doi.org/10.1002/anie.2016061
  9. Zhou W., Brown W., Bardhan A., Delaney M., Ilk A.S., Rauen R.R., Kahn S.I., Tsang M., Deiters A. // Angew. Chem. Int. Ed. 2020. V. 59. P. 8998–9003. https://doi.org/10.1002/anie.201914575
  10. Sun Y.-J., Chen W.-D., Liu J., Li J.-J., Zhang Y., Cai W.-Q., Liu L., Tang X.-J., Hou J., Wang M., Cheng. L. // Angew. Chem. Int. Ed. 2023. V. 2. P. e202212413. https://doi.org/10.1002/anie.202212413
  11. Zetsche B., Volz S.E., Zhang F. // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. P. 139–142. https://doi.org/10.1038/nbt.3149
  12. Nihongaki Y., Kawano F., Nakajima T., Sato M. // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. P. 755–760. https://doi.org/10.1038/nbt.3245
  13. Chen Y., Liu X., Zhang Y., Wang H., Ying H., Liu M., Li D., Lui K.O., Ding Q. // Mol. Ther. 2016. V. 24. P. 1508–1510. https://doi.org/10.1038/mt.2016.172
  14. Petris G., Casini A., Montagna C., Lorenzin F., Prandi D., Romanel A., Zasso J., Conti L., Demichelis F., Cereseto A. // Nat. Commun. 2017. V. 8. P. 15334. https://doi.org/10.1038/ncomms15334
  15. Akhmetova E.A., Golyshev V.M., Vokhtantsev I.P., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Novopashina D.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 496–504. https://doi.org/10.1134/S1068162021020023
  16. Nishimasu H., Ran F.A., Hsu P.D., Konermann S., Shehata S.I., Dohmae N., Ishitani R., Zhang F., Nureki O. // Cell. 2014. V. 156. P. 935–949. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001
  17. Jiang F., Doudna J.A. // Ann. Rev. Biophysics. 2017. V. 46. P. 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
  18. Anders C., Jinek M. // Methods Enzymol. 2014. V. 546. P. 1–20. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5
  19. Shubsda M.F., Goodisman J., Dabrowiak J.C. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1997. V. 34. P. 73–79. https://doi.org/10.1016/S0165-022X(96)01204-3
  20. Setlow R.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 3363–3366. https://doi.org/10.1073/pnas.71.9.3363
  21. Mullenders L.H.F. // Photochem. Photobiol. Sci. 2018. V. 17. P. 1842–1852. https://doi.org/10.1039/c8pp00182k

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Cleavage of pBluescriptII SK(−) plasmid by the CRISPR/Cas9 system. (a) Schematic representation of the complex of target DNA and unmodified sgRNA with the Cas9 protein and the sequence of photolabile guide RNAs sgRNA-PL1, sgRNA-PL2, and sgRNA-PL3; (b) electrophoretic analysis of the cleavage products in 1% agarose gel. M is a DNA length marker, K⁻ is the original circular supercoiled plasmid target DNA containing a small amount of DNA in the relaxed form; K⁺ are the products of target DNA cleavage in the presence of unmodified chemically synthesized 102-nt sgRNA; other lanes – analysis of the products of target DNA cleavage in the presence of irradiated (+UV) and non-irradiated (–UV) photolabile guide RNAs (sgRNA-PL1, sgRNA-PL2 or sgRNA-PL3). Reaction time 60 min, temperature 37°C. See the “Experimental section” for reaction conditions.

Download (463KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Analysis of the efficiency of cleavage of the dsDNA target by the CRISPR/Cas9 system containing photolabile guide RNAs before and after irradiation. For cleavage conditions, see the “Experimental section.” Data were obtained by averaging the results of at least three independent experiments.

Download (109KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Electrophoretic analysis of the products of pBluescriptII SK(−) plasmid cleavage in the presence of sgRNA fragments in 1% agarose gel. M is a DNA length marker, K⁻ is the original circular supercoiled plasmid target DNA containing an insignificant amount of DNA in the relaxed form; K+ is the product of target DNA cleavage in the presence of unmodified chemically synthesized sgRNA; (a) sgRNA-PL2 is the products of target DNA cleavage in the presence of 5ʹfr_sgRNA-PL2 and 3ʹfr_sgRNA-PL2 (5ʹfr +3ʹfr) or only 5ʹfr_sgRNA-PL2 (5ʹfr); (b) – sgRNA-PL3 (69) – products of target DNA cleavage in the presence of the 69-mer 5ʹ-fragment of sgRNA-PL3; (c) – analysis of the efficiency of plasmid cleavage by Cas9 nuclease in the presence of sgRNA fragments. For cleavage conditions, see the “Experimental section”. The data were obtained by averaging the results of at least two independent experiments.

Download (291KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Kinetic curves of target DNA cleavage by Cas9 complexes with unmodified guide RNAs, obtained by processing the data of electrophoretic analysis of reaction mixtures in agarose gel with visualization by ethidium bromide. For cleavage conditions, see the “Experimental section”. The data were obtained by averaging the results of at least three independent experiments.

Download (111KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Kinetic curves of target DNA cleavage by the Cas9 protein complex with sgRNA-PL2. 1 – control RNA (sgRNA), 2 – photosensitive RNA (sgRNA-PL2), 3 – deactivated photosensitive RNA in complex with Cas9, 4 – reaction stopped by UV irradiation (30 min) from the 5th minute from the start of the reaction, 5 – reaction stopped by UV irradiation (5 min) from the 5th minute from the start of the reaction, 6 – photosensitive RNA deactivated outside the complex with Cas9. For cleavage conditions, see the “Experimental section”. The data were obtained by averaging the results of at least three independent experiments.

Download (132KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».