New cationic carbohydrate-containing amphiphiles and liposomes based on them for effective delivery of short nucleic acids into eukaryotic cells

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Генная терапия – способ устранения причин возникновения и развития различных заболеваний, а не только сопровождающих их симптомов [1]. Для целей генной терапии используются различные терапевтические нуклеиновые кислоты (НК) (синтетические антисенсолигонуклеотиды, аптамеры, siРНК, мРНК, siРНК-мимики, плазмидные векторы и т.д.), которые в большинстве случаев представляют собой полианионы и не могут попасть в клетки без средств, обеспечивающих их доставку и защиту от деградации нуклеазами [2]. В качестве систем доставки НК наиболее широкое распространение получили вирусные векторы, обеспечивающие высокую эффективность трансдукции клеток и внутриклеточную экспрессию НК [3]. Недостатки таких векторов – ограничение размера переносимой НК, иммуногенность и высокая стоимость [4]. Для целей генной терапии разрабатываются разнообразные невирусные системы доставки, такие как катионные липосомы [5–7], полимеросомы [8], дендримеры [9], углеродные нанотрубки, неорганические наночастицы на основе оксида железа, оксида кремния, золота, квантовые точки [10, 11] и экзосомы [12]. Среди невирусных систем доставки широкое распространение получили катионные липосомы и другие липидные наночастицы благодаря их низкой иммуногенности, отсутствию ограничений в размере переносимых терапевтических НК, относительной простоте получения и возможности варьировать состав и модифицировать липидные компоненты в зависимости от природы доставляемой НК и свойств клеток в тканях-мишенях [13, 14].

Для обеспечения направленной доставки НК в состав катионных липосом могут быть включены различные адресные лиганды [15]. Так, модификация поверхности липосом остатками фолиевой кислоты [16, 17] или пептидами с RGD-мотивом [18, 19] используется для адресной доставки НК в опухолевые клетки; модификация остатками D-галактозы, специфически связывающимися с асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток печени, обеспечивает адресную доставку НК в гепатоциты [20–22]; остатки D-маннозы специфически взаимодействуют с лектинами дендритных клеток и макрофагов [23–25], открывая новые возможности для воздействия на иммунную систему организма. Одна из стратегий создания систем направленной доставки НК в клетки-мишени – дизайн катионных амфифилов, ковалентно связанных с адресным лигандом, что одновременно обеспечивает и связывание НК, и ее доставку в клетки-мишени [26, 27]. Ранее нами был синтезирован галактозилсодержащий катионный амфифил D1 (рис. 1), который обладал низкой цитотоксичностью и обеспечивал эффективную доставку коротких и протяженных НК в эукариотические клетки без участия липида-хэлпера – 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE) [26].

 

Рис. 1. Углеводсодержащие катионные амфифилы D1–D3.

 

С целью создания структурных аналогов катионного амфифила D1 в данной работе нами осуществлен синтез углеводсодержащих амфифилов D2 и D3 (рис. 1), содержащих остаток спермина, необходимый для компактизации и связывания НК, диглицерид, участвующий в формировании липидных агрегатов, а в качестве остатка углевода, улучшающего гидрофильно-липофильный баланс молекулы, – остаток лактозы или D-маннозы. Кроме того, остаток лактозы может служить адресным лигандом для доставки НК в гепатоциты печени [28], а остаток маннозы – для специфического взаимодействия с лектиновыми рецепторами дендритных клеток и макрофагов [29]. Для оценки потенциала новых катионных амфифилов были сформированы их водные дисперсии и катионные липосомы, изучена их цитотоксичность и проведена оценка способности доставлять различные НК в эукариотические клетки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез углеводсодержащих катионных амфифилов и получение их водных дисперсий и катионных липосом. Углеводсодержащие катионные амфифилы D2, D3 имеют разветвленную компоновку основных структурных элементов (рис. 1), которая достигалась, как описано ранее [26], путем присоединения углеводной составляющей к гидрофобному домену – 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерину, модифицированному в положении С3 бифункциональным линкером, и последующего введения региоселективно защищенного спермина через сукцинильный спейсер с дальнейшим удалением всех защитных групп (схема 1).

 

Схема 1. Синтез новых катионных амфифилов, содержащих остатки лактозы или D-маннозы. a – 7AcLacBr/4AcManBr, CdCO₃; b – Pd/C, NH₄⁺CHOO^–; c – янтарный ангидрид, DMAP, Et₃N; d – N¹,N⁴,N⁹-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан, HBTU, N,N-диизопропилэтиламин; e – 1) TFA, 2) 0.04 н. MeONa/MeOH, 3) 4 н. HCl в диоксане.

 

Гликозилирование соединения (II) [26] 2,3,6,2',3',4',6'-гепта-О-ацетил-α-лактозил- и 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-маннопиранозилбромидами проводили в условиях модифицированного метода Кенигса–Кнорра в аппарате Сокслета, используя в качестве промотора реакции карбонат кадмия. Реакция протекала с эффектом “соучастия” ацетильной группы при С2-атоме углеводного цикла, что приводило к преимущественному образованию 1,2-транс-гликозидов. В результате гликозилирования были получены β-аномер ((IIIa), 58%) и α-аномер ((IIIb), 45%).

Аномерная конфигурация продуктов реакции гликозилирования (IIIa) и (IIIb) была установлена с помощью ЯМР-спектроскопии. В спектрах ¹H-ЯМР присутствуют сигналы аномерных протонов с химическими сдвигами 4.37 м.д. для соединения (IIIa) и 4.73 м.д. для соединения (IIIb) и константами спин-спинового взаимодействия J_1.2 = 7.8 Гц и J_1.2 = 1.6 Гц соответственно. В спектре ¹³С-ЯМР сигнал аномерного углерода имел химический сдвиг 101.22 м.д. для соединения (IIIa) и 97.68 м.д. для соединения (IIIb).

Для введения спермина в молекулу амфифила предварительно проводили каталитическое восстановление нитрогруппы в соединениях (IIIa) и (IIIb) до аминогруппы в присутствии Pd/C, используя в качестве источника водорода формиат аммония. В результате ацилирования соединений (IVa) и (IVb) янтарным ангидридом в присутствии N,N-диметил-4-аминопиридина (DMAP) были получены карбоксипроизводные (Va) и (Vb), которые конденсировали с региоселективно защищенным спермином – N¹,N⁴,N⁹-три-третбутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодеканом [30] – в присутствии O-(1H-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата (HBTU) при 4°С и получили соединения (VIa) и (VIb) с выходами 69 и 50% соответственно.

На завершающем этапе синтеза осуществляли удаление защитных групп в соединениях (VIa), (VIb), используя опережающее деблокирование аминогрупп, действием трифторуксусной кислоты. Во избежание деструкции ключевых амфифилов D2 и D3 удаление ацетильных групп осуществляли действием 0.04 н. раствора метилата натрия в метаноле с последующей обработкой реакционной смеси раствором 4 н. HCl в диоксане. Выделение углеводсодержащих катионных амфифилов D2 и D3 проводили с использованием обращенно-фазовой хроматографии на силикагеле (LiChroprep^® RP-18 для D2 и YMC-Pack ODS-AQ 12S50 для D3) и дополнительного диализа против воды, что привело к получению амфифилов D2 и D3 с выходами 64 и 55% соответственно. Структура полученных целевых амфифилов D2 и D3 была подтверждена с помощью спектроскопии (¹Н- и ¹³С-ЯМР) и масс-спектрометрии.

Ранее нами было показано, что катионный галактозосодержащий амфифил D1 (рис. 1) эффективно доставлял различные НК в эукариотические клетки [26]. Для изучения влияния структуры синтезированных углеводсодержащих катионных амфифилов на эффективность доставки НК в эукариотические клетки были получены дисперсии катионных амфифилов D2 и D3 в воде с использованием ультразвуковой обработки. Следует отметить, что введение в структуру амфифила углеводных остатков увеличивает гидрофильность молекулы и, как следствие, ее растворимость в воде.

Известно, что введение нейтрального липида-хелпера DOPE в состав катионных липосом может улучшить эффективность трансфекции клеток [31]. На основе углеводсодержащих катионных амфифилов D1–D3 и DOPE (соотношение 1 : 1 мольн.) были получены катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE с использованием метода гидратации липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком, как описано ранее [32].

Цитотоксичность углеводсодержащих катионных амфифилов и катионных липосом. Изучение цитотоксичности катионных амфифилов D2, D3 и катионных липосом D1-DOPE, D3-DOPE проводили с помощью МТТ-теста на клетках линий НЕК 293 и ВНК в отсутствие эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в ростовой среде DMEM (Sigma-Aldrich, США). Значения IC₅₀ для катионных амфифилов D2 и D3 составили, соответственно, 65.5 и 59.2 мкМ для клеток HEK 293, 35.4 и 17.2 мкМ для клеточной линии BHK. Значения IC₅₀ для катионного амфифила D1 с остатком D-галактозы находились в пределах 20 мкМ для клеток линий НЕК 293 и BHK [26].

Катионные липосомы D1-DOPE и D3-DOPE оказались нетоксичными для клеток НЕК 293 вплоть до концентрации 80 мкМ. На рис. 2 в качестве примера приведен анализ цитотоксичности катионных липосом D2-DOPE, содержащих амфифил с остатком лактозы, в отношении клеток НЕК 293. Цитотоксичность липосом оценивали по изменению жизнеспособности клеток в реальном времени на приборе xCELLigence (ACEA Biosciences, США) в присутствии 10% FBS после 4 ч инкубации. Липосомы D2-DOPE не только не оказывали токсического действия на клетки НЕК 293 во всем диапазоне использованных концентраций, но и стимулировали рост клеток (наибольший клеточный индекс наблюдался при концентрации липосом D2-DOPE 32 мкМ, рис. 2, голубая линия). Таким образом, катионные липосомы на основе углеводсодержащих амфифилов D1–D3 и DOPE, а не их водные дисперсии, обладают уникально низкой цитотоксичностью в отношении клеток НЕК 293. Амфифилы D1–D3 – это поверхностно-активные вещества, которые могут воздействовать на клеточную мембрану, дестабилизируя ее и нарушая целостность липидного бислоя, тем самым проявляя большую цитотоксичность по сравнению с катионными липосомами, которые представляют структурно организованные ансамбли, состоящие из смеси амфифилов D1–D3 и фосфолипидов. В то же время цитотоксичность самих амфифилов D2 и D3 достаточно низкая в диапазоне используемых для трансфекции рабочих концентраций, которые обычно не превышают 10 мкМ.

 

Рис. 2. Анализ цитотоксичности липосом D2-DOPE. Выживаемость клеток НЕК 293 оценивали в реальном времени с помощью прибора xCELLigence. Клетки НЕК 293 высаживали в 16-луночные планшеты с плотностью 5 × 10³ кл./лунку. После 24 ч к клеткам добавляли катионные липосомы D2-DOPE в концентрации от 4 до 64 мкМ, после 4 ч инкубации с катионными липосомами в среду добавляли FBS до концентрации 10%.

 

Клетки BHK были более чувствительными к действию катионных липосом: композиция D1-DOPE, содержащая амфифил с остатком D-галактозы, обладала умеренной токсичностью (IC₅₀ = 62.3 мкМ), тогда как липосомы D3-DOPE, содержащие амфифил с остатком D-маннозы, оказались токсичными в отношении этого типа клеток (IC₅₀ = 7.6 мкМ).

Эффективность доставки коротких и протяженных нуклеиновых кислот in vitro. Катионные амфифилы D1–D3 и катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE использовали для доставки короткого 25-звенного олигодезоксирибонуклеотида, меченного по 5'-концу флуоресцеином (FITC-ODN), и плазмидной ДНК pEGFP-C2 (4700 п.н.), кодирующей зеленый флуоресцентный белок (EGFP), в клетки НЕК 293, а также малой интерферирующей РНК (siРНК), направленной против мРНК EGFP трансгенных клеток BHK IR-780. Трансфицирующую активность амфифилов и липосом сравнивали с активностью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (Lf 2000, Invitrogene, США).

Комплексы FITC-ODN с катионными амфифилами или липосомами формировали при различных соотношениях N/P (отношение количества аминогрупп катионного амфифила D1–D3 к количеству фосфатных групп НК). Оценку эффективности трансфекции клеток НЕК 293 в отсутствие (–S, рис. 4а, 4б) и в присутствии (+S, рис. 3а, 3б, 4в, 4г) 10% FBS проводили методом проточной цитометрии путем измерения количества FITC-положительных клеток (рис. 3а, 4а, 4в) и средней интенсивности флуоресценции клеток в популяции (рис. 3б, 4б, 4г).

Катионные амфифилы D1–D3 эффективно доставляли FITC-ODN, трансфицируя ~100% клеток (рис. 3а). Средняя интенсивность флуоресценции (рис. 3б), которая отражает уровень накопления FITC-ODN в клетках, увеличивалась с увеличением соотношения N/P, достигая 57– 61 отн. ед. при N/P = 1.25/1, что превышает в ~7 раз значения Lf 2000.

 

Рис. 3. Накопление комплексов FITC-ODN с катионными амфифилами D1–D3 в клетках НЕК 293 в присутствии 10% FBS. Комплексы FITC-ODN/катионные амфифилы D1–D3 формировали при соотношениях N/P = 1/1.5, 1/1 и 1.25/1. Процент FITC-положительных клеток (а) и уровень средней интенсивности флуоресценции клеток в популяции (б) определяли методом проточной цитометрии через 4 ч инкубации клеток с комплексами. Стандартное отклонение не превышает 8%.

 

Трансфицирующая активность катионных липосом D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE в случае доставки FITC-ODN существенно отличалась от активности амфифилов D1–D3 (рис. 4). Если разница между липосомами D1-DOPE, D2-DOPE и Lf 2000 по проценту трансфицированных клеток была незначительной, то для липосом D3-DOPE, содержащих маннозилированный амфифил, FITC-ODN проникал в ~30% клеток HEK 293 как в отсутствие, так и в присутствии FBS (рис. 4а, 4в). По интенсивности накопления FITC-ODN в клетках наиболее эффективными трансфектантами оказались липосомы D1-DOPE и D2-DOPE, содержащие амфифилы D1 с остатком D-галактозы и D2 с остатком лактозы. Они превосходили Lf 2000 в 7–11 раз по интенсивности флуоресценции при соотношении N/P = 2/1 в отсутствие (рис. 4б) и в 6 раз – в присутствии 10% FBS (рис. 4г). Согласно полученным данным, наличие 10% FBS не влияло на количество трансфицированных клеток (рис. 4а, 4в), однако несколько снижало накопление FITC-ODN (рис. 4б, 4г). Таким образом, катионные липосомы D1-DOPE и D2-DOPE при N/P = 2/1 обеспечивали эффективное накопление короткого FITC-ODN в клетках HEK 293, превосходя в ~2 раза по эффективности сами амфифилы D1 и D2.

 

Рис. 4. Накопление комплексов FITC-ODN с катионными липосомами D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE в клетках НЕК 293. Комплексы FITC-ODN/катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE формировали при соотношениях N/P = 1/2, 1/1 и 2/1. Трансфекцию проводили в отсутствие (а, б) или в присутствии 10% FBS (в, г) в клеточной среде. Процент трансфицированных клеток (а, в) и уровень средней интенсивности флуоресценции клеток в популяции (б, г) измеряли с помощью проточной цитометрии через 4 ч инкубации клеток с комплексами. Стандартное отклонение не превышает 9%.

 

Эффективность доставки плазмидной ДНК pEGFP-C2 в клетки НЕК 293 анализировали через 48 ч после добавления к клеткам комплексов пДНК с катионными амфифилами или липосомами, анализируя количество трансфицированных клеток и уровень экспрессии трансгена (EGFP) с помощью проточной цитометрии. Комплексы pEGFP-C2 с амфифилами D1–D3 и липосомами формировали при соотношениях N/P = 4/1, 6/1, 8/1, 10/1 и вносили к клеткам в отсутствие или в присутствии 10% FBS в среде (рис. 5, 6).

 

Рис. 5. Доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2 с помощью катионных амфифилов D1–D3 в клетки HEK 293 в отсутствие (а, б) или присутствии 10% FBS (в, г) в клеточной среде. Процент EGFP-положительных клеток (а, в) и уровень средней интенсивности флуоресценции (экспрессии EGFP) клеток в популяции (б, г) измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с комплексами. Стандартное отклонение не превышает 8%.

 

Рис. 6. Доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2 в комплексе с катионными липосомами D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE в клетки HEK 293 в отсутствие (а, б) или присутствии 10% FBS (в, г) в клеточной среде. Процент EGFP-экспрессирующих клеток (а, в) и уровень средней интенсивности флуоресценции (экспрессии EGFP) клеток в популяции (б, г) измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с комплексами. Стандартное отклонение не превышает 7%.

 

Для катионных амфифилов D1–D3 в бессывороточной среде с ростом соотношения N/P наблюдалось увеличение как количества EGFP-экспрессирующих клеток, которое достигало 58–71% при N/P = 10/1 (рис. 5а), так и увеличение значений интенсивности флуоресценции, которые превосходили в 1.6–2.5 раз (N/P = 10/1) значения, полученные для Lf 2000 (рис. 5б). Известно, что снижение эффективности доставки НК может быть связано с взаимодействием положительно заряженных липоплексов с отрицательно заряженными белками [33] или с липидами или липид-связанными белками сыворотки крови [34], которое может приводить к уменьшению коллоидной стабильности комплексов, преждевременному высвобождению НК [35]. Присутствие 10% FBS многократно снижало эффективность доставки пДНК: по количеству трансфицированных клеток в 2–4 раза, а по средней интенсивности флуоресценции – в 9– 47 раз (рис. 5в, 5г).

Катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE продемонстрировали низкую эффективность доставки протяженной пДНК в клетки НЕК 293 (рис. 6). Если количество EGFP-экспрессирующих клеток было достаточно высоким, особенно в случае липосом D3-DOPE, которые при соотношении N/P = 10/1 в отсутствие FBS доставляли пДНК в ~70% клеток в популяции, что превосходит значения для Lf 2000 в 2 раза (рис. 6а), то значения средней интенсивности флуоресценции лишь немного превышали фоновые значения (1–3 × 10⁴ отн. ед). (рис. 6б, 6г). Возможно, пДНК, проникая в клетку в комплексе с катионными липосомами D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE, не способна эффективно высвобождаться не только из комплекса из-за сильных электростатических взаимодействий, но и из эндосом, и, следовательно, не достигает своей дальнейшей цели – ядерной мембраны, через которую она должна проникнуть для дальнейшей экспрессии белка.

Среди терапевтических НК все большую популярность набирают молекулы РНК, используемые, например, для лечения хронического миелоидного лейкоза [36], вакцинации против COVID-19 [37], иммунотерапии рака [38]. Нами была изучена возможность доставки малой интерферирующей РНК (siРНК), направленной против мРНК EGFP, с помощью катионных амфифилов D1–D3 и липосом D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE в клетки BHK IR-780, экспрессирующие EGFP (рис. 7). Эффективность трансфекции siРНК определяли по подавлению экспрессии белка EGFP в клетках BHK IR-780 с помощью проточной цитометрии.

 

Рис. 7. Ингибирование экспрессии белка EGFP в трансгенных клетках BHK IR-780 после доставки siРНК с помощью катионных амфифилов D1–D3 (а, б) или катионных липосом D1-DOPE и D2-DOPE (в, г) в отсутствие (а, в) или в присутствии 10% FBS (б, г) в клеточной среде.

 

Катионные амфифилы D1–D3 доставляли siРНК в клетки BHK IR-780 с низкой эффективностью (рис. 7а, 7б): подавление экспрессии EGFP практически не наблюдалось даже при высоких значениях N/P = 16/1. Только лактозосодержащий амфифил D2 в отсутствие FBS (при N/P = 16/1) способствовал переносу siРНК и снижению экспрессии EGFP на 40% (рис. 7а).

Катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE более эффективно доставляли siРНК в клетки BHK IR-780 по сравнению с амфифилами D1–D3 (рис. 7). При соотношениях N/P = 8/1 и 10/1 липосомы D2-DOPE, содержащие амфифил с остатком лактозы, наиболее эффективно способствовали подавлению экспрессии EGFP (на 70%), аналогично коммерческому трансфектанту Lf 2000 (рис. 7в). Однако добавление 10% FBS в клеточную среду снижало эффективность доставки, в этом случае подавление экспрессии белка EGFP не превышало 50%. Ввиду того, что липосомы D3-DOPE были токсичны для клеток BHK, при трансфекции клеток BHK IR-780 также наблюдалась их гибель, что делало невозможным изучение доставки siРНК с помощью этих липосом.

Таким образом, было показано, что состав катионных липосом оказывает большое влияние на эффективность доставки siРНК. Липосомы должны содержать не только катионный амфифил, но и липид-хелпер DOPE, обеспечивающий, с одной стороны, более эффективное проникновение коротких НК внутрь клетки, а с другой – эндосомальное высвобождение в цитоплазму, что критически важно для осуществления биологического действия siРНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали перегнанные растворители отечественного и зарубежного производства, O-(1H-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфат, Pd/C (Aldrich, США), янтарный ангидрид (Fluka, Германия) и DIPEA, Et₃N (Merck, Германия). Бензол кипятили с металлическим натрием и перегоняли непосредственно перед реакцией; CH₂Cl₂ и Et₃N кипятили с CaH₂ и перегоняли непосредственно перед реакцией. Соединениe (II) – катионный амфифил D1 – получали согласно известной методике [26], N¹,N⁴,N⁹-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан – согласно методике [30].

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), RP – 18 F_254S (Merck, Германия). Обнаружение пятен на хроматограммах осуществляли раствором фосформолибденовая кислота–сульфат церия(IV) с последующим прогреванием, реактивом Драгендорфа, раствором перманганата калия и с помощью УФ-лампы (254 нм). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле Kieselgel 60 (0.040–0.063 мм), Kieselgel 60 (0.063– 0.200 мм), LiChroprep^® RP-18 (0.040–0.063 мм, Merck, Германия), YMC-Pack ODS-AQ 12S50 (3 мкM, YMC, Япония).

Спектры ¹Н- и ¹³C-ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометрах DPX-300 и AMX-400 (Bruker, Германия) в CDCl₃, смеси CDCl₃–CD₃OD и Py-d5 (внутренний стандарт – тетраметилсилан). Значения химических сдвигов (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), константы спин-спинового взаимодействия (J) – в герцах (Гц). Масс-спектры регистрировали на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации на матрице с использованием в качестве матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты.

N-[6-(2,3,6,2^',3^',4',6'-гепта-О-Ацетил-β-лактозилокси)гексил)-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-нитробензолсульфокислоты (IIIa). К раствору 0.797 г (1.036 ммоль) соединения (II) в 50 мл безводного бензола добавляли 0.613 г (3.448 ммоль) прокаленного CdCO₃. Реакционную смесь выдерживали при 110°С в аппарате Сокслета, после 4-кратного обращения паров бензола через прокаленный гранулированный силикагель к реакционной массе в течение 1.5 ч добавляли по каплям раствор 2.219 г (3.188 ммоль) 2,3,6,2',3',4',6'-гепта-О-ацетил-α-лактозилбромида в 25 мл безводного бензола и кипятили 8 ч. Реакционную смесь охлаждали до 24°С, фильтровали через Celite® 545, промывали CНCl₃, удаляли растворители в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя системой толуол–этилацетат (10 : 1). Выход соединения (IIIa) составил 0.795 г (58%). ¹Н-ЯМР: 0.84 (т, 6 Н, J 6.8, 2 СН₂СН₃), 1.12–1.37 (м, 48 Н, 2 (СН₂)₁₁, (CH₂)₂), 1.37–1.41 (м, 2 H, СН₂СН₂N), 1.41–1.55 (м, 6 H, 2 ОСН₂СН₂, OСН₂СН₂), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 1.98 (с, 3 H), 1.99 (с, 3 H), 2.06 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H), 2.1 (с, 3 H, 7 СН₃СО), 3.05–3.57 (м, 12 Н, 2 NСН₂, 4 СН₂О, СН₂CHСН₂), 3.65–3.85 (м, 3 Н, H5'-Lac, H_ab6'-Lac), 3.95–4.12 (м, 4 Н, Н5-Lac, Н_ab6-Lac), 4.37 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1' Lac), 4.39–4.45 (м, 1 Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1 Lac), 4.79 (дд, 1 Н, J 7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1 Н, J 3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1 H, J 7.8, 10.3, H-2' Lac), 5.12 (т, 1 Н, J 9.4, Н-3 Lac), 5.26–5.29 (м, 1 Н, Н-4' Lac), 7.89–8.02 (м, 2 Н, Ar), 8.21–8.35 (м, 2 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.27, 20.66, 20.78, 20.96, 21.02, 22.83, 25.56, 26.20, 26.26, 26.43, 28.11, 29.50, 29.62, 29.81, 30.19, 32.05, 49.54, 49.72, 60.91, 62.12, 66.72, 69.21, 70.02, 70.25, 70.56, 70.77, 71.12, 71.82, 71.91, 72.74, 72.93, 76.43, 77.75, 100.71, 101.22, 124.35, 128.54, 146.27, 149.92, 169.22, 169.70, 169.95, 170.21. Масс-спектр MALDI, m/z: 1412.031 [M + Na + 2H]⁺, вычислено для C₆₉H₁₁₆N₂NaO₂₄S: 1411.754.

N-[6-O-(2,3,4,6-тетра-О-Ацетил-α-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-нитробензолсульфокислоты (IIIb). Соединение (IIIb) получали аналогично соединению (IIIa), исходя из 0.569 г (0.739 ммоль) соединения (II) в 13 мл безводного бензола, 0.383 г (2.219 ммоль) прокаленного CdCO₃, раствора 0.912 г (2.219 ммоль) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-маннопиранозилбромида в 15 мл безводного бензола. Время кипячения 3 ч. Система для колоночной хроматографии толуол–этилацетат (12 : 1). Выход соединения (IIIb) составил 0.370 г (45%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 H, J 6.7, 2 CH₂CH₃), 1.11–1.30 (м, 48 H, 2 (CH₂)₁₁, CH₂CH₂), 1.31–1.41 (м, 2 H, CH₂CH₂N), 1.42–1.57 (м, 6 H, 3 CH₂CH₂O), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 2.02 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H, 4 CH₃CO), 3.07–3.28 (м, 4 H, CH₂NCH₂), 3.29–3.53 (м, 8 H, 2 CH₂CH₂O, CH₂CH, CHH_aO), 3.61 (дт, J 9.6, 6.4, 1 H, CHH_bO), 3.87–3.93 (м, 1 H, H5-Man), 4.04 (дд, 1 H, J 2.4, 12.2, H_a6-Man), 4.23 (дд, 1 H, J 5.2, 12.2, H_b6-Man), 4.73 (д, 1 H, J 1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1 H, J 1.6, 3.1, H2-Man), 5.19 (дд, 1 H, J 9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1 H, J 3.1, 9.8, H3-Man), 7.93–7.98 (м, 2 H, Ar), 8.25–8.31 (м, 2 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.26, 20.84, 20.90, 22.82, 25.91, 26.21, 26.27, 26.56, 28.16, 29.33, 29.49, 29.60, 29.64, 29.80, 29.83, 30.21, 32.05, 49.57, 49.75, 62.61, 66.33, 68.35, 68.54, 69.25, 69.80, 70.28, 70.57, 71.91, 97.68, 124.36, 128.56, 146.27, 149.94, 169.88, 170.05, 170.08, 170.09. Масс-спектр MALDI, m/z: 1123.384 [M + Na + H]⁺, вычислено для C₅₇H₉₉N₂NaO₁₆S: 1122.661.

N-[6-O-(2,3,6,2',3',4',6'-гепта-О-Ацетил-βлактозилокси)гексил]-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-аминобензолсульфокислоты (IVa). К раствору 0.685 г (0.449 ммоль) соединения (IIIa) в 14 мл смеси метанол : ТГФ (2.5 : 1, v/v) добавляли 0.126 г (1.796 ммоль) формиата аммония и нагревали при перемешивании до 60°С, после чего вносили 5% мольн. Pd/C. Через 1 ч реакционную смесь фильтровали через Celite® 545, промывали метанолом, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя системой толуол–этилацетат (4 : 1). Выход соединения (IVa) составил 0.464 г (77%). ¹Н-ЯМР: 0.87 (т, 6 Н, J 6.8, 2 СН₂СН₃), 1.07–1.30 (м, 48 H, 2 (CH₂)₁₁, CH₂CH₂), 1.31–1.55 (м, 8 H, СН₂СН₂N, 2 ОСН₂СН₂, OСН₂СН₂), 1.89 (с, 3 H), 1.91 (с, 3 H), 1.97 (с, 6 H), 2.03 (с, 3 H), 2.07 (с, 3 H), 2.10 (с, 3 H, 7 CH₃CO), 2.87–3.18 (м, 4 H, 2NCH₂), 3.18–3.62 (м, 9 H, 4 CH₂O, CH₂CHCH₂), 3.63–3.87 (м, 3 Н, H5'-Lac, H_ab6'-Lac), 3.97–4.12 (м, 3 Н, Н5-Lac, Н_ab6-Lac), 4.37 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1' Lac), 4.39–4.42 (м, 1 Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1 Lac), 4.80 (дд, 1 Н, J 7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1 Н, J 3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1 H, J 7.8, 10.3, H-2' Lac), 5.12 (т, 1 Н, J 9.4, Н-3 Lac), 5.29 (м, 1 Н, Н-4' Lac), 6.59–6.71 (м, 2 H) и 7.45–7.55 (м, 2 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.25, 20.84, 20.94, 22.84, 25.56, 26.31, 26.63, 28.15, 29.52, 29.69, 29.82, 30.30, 32.07, 49.75, 49.89, 61.44, 67.26, 69.16, 70.24, 70.80, 71.14, 71.70, 71.88, 78.41, 101.52, 116.27, 129.46, 145.01, 150.33, 169.42, 169.95, 170.25, 170.34, 170.36 170.44, 170.56, 170.58. Масс-спектр MALDI, m/z: 1380.253 [M + Na + H]⁺, вычислено для C₆₉H₁₁₇N₂NaO₂₂S: 1380.772.

N-[6-O-(2,3,4,6-тетра-О-Ацетил-α-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-аминобензолсульфокислоты (IVb). Соединение (IVb) получали аналогично соединению (IVa), исходя из 0.327 г (0.298 ммоль) соединения (IIIb) в 7 мл смеси метанол : ТГФ (2.5 : 2, v/v), 0.080 г (1.274 ммоль) формиата аммония. Время реакции 2.5 ч. Система для колоночной хроматографии толуол–этилацетат (6 : 1). Выход соединения (IVb) составил 0.280 г (82%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 H, J 6.7, 2 CH₂CH₃), 1.17–1.30 (м, 48 H, 2 (CH₂)₁₁, CH₂CH₂), 1.31–1.57 (м, 8 H, СН₂СН₂N, 2 ОСН₂СН₂, OСН₂СН₂), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 2.02 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H, 4 CH₃CO), 3.07–3.28 (м, 4 H, CH₂NCH₂), 3.29–3.39 (м, 6 H, 2 CH₂CH₂O, CH₂O), 3.41–3.53 (м, 2 H, CHH_aO, CH₂CHCH₂), 3.61 (дт, J 9.6, 6.4, 1 H, CHH_bO), 3.87–3.93 (м, 1 H, H5-Man), 4.04 (дд, 1 H, J 2.4, 12.2, H_a6-Man), 4.23 (дд, 1 H, J 5.2, 12.2, H_b6-Man), 4.73 (д, 1 H, J 1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1 H, J 1.6, 3.1, H2-Man), 5.19 (дд, 1 H, J 9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1 H, J 3.1, 9.8, H3-Man), 6.59–6.62 (м, 2 H, Ar), 7.48 - 7.55 (м, 2 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.45, 21.07, 21.09, 21.26, 23.01, 25.99, 26.44, 26.47, 26.80, 28.00, 29.51, 29.69, 29.85, 29.99, 30.03, 30.46, 32.24, 49.75, 49.96, 62.82, 66.52, 68.66, 68.69, 69.55, 69.99, 70.96, 72.01, 76.93, 77.36, 77.78, 78.61, 78.64, 114.67, 125.61, 129.35, 129.59, 142.27, 170.09, 170.37, 170.48, 171.01. Масс-спектр MALDI, m/z: 1091.950 [M + Na]⁺, вычислено для C₅₇H₁₀₀N₂NaO₁₄S: 1091.679.

N-[6-O-(2,3,6,2',3',4',6'-гепта-О-ацетил-βлактозилокси)гексил]-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-(3-карбоксипропионамидо)бензолсульфокислоты (Va). К раствору 0.393 г (0.293 ммоль) соединения (IVa) в 5 мл безводного CH₂Cl₂ при перемешивании добавляли 0.2936 г (2.930 ммоль) янтарного ангидрида, 7.4 мг N,N-диметил-4-аминопиридина и 83 мкл Et₃N. Через 96 ч реакционную смесь промывали 0.3%-ным водным раствором HCl. Органическую фазу сушили (Na₂SO₄), фильтровали, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя системой толуол–этилацетат (1 : 1). Выход соединения (Va) составил 0.382 г (78%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 Н, J 6.8, 2 СН₂СН₃), 0.95–1.31 (м, 48 Н, 2 (СН₂)₁₁, (CH₂)₂), 1.32–1.53 (м, 8 H, СН₂СН₂N, 2 ОСН₂СН₂, OСН₂СН₂), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 1.98 (с, 3 H), 1.99 (с, 3 H), 2.06 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H), 2.1 (с, 3 H, 7 СН₃СО), 2.58–2.74 (м, 4 H, NCOCH₂CH₂COO), 2.95–3.57 (м, 13 Н, 2 NСН₂, 4 СН₂О, СН₂CHСН₂), 3.66–3.78 (м, 2 Н, H_ab6'-Lac), 3.78–3.86 (м, 1 Н, H5'-Lac), 3.91–4.12 (м, 3 Н, Н5-Lac, Н_ab6'-Lac), 4.37 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1' Lac), 4.39–4.41 (м, 1 Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1 Lac), 4.79 (дд, 1 Н, J 7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1 Н, J 3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1 H, J 7.8, 10.3, H-2' Lac), 5.12 (т, 1 Н, J 9.4, Н-3 Lac), 5.29–5.31 (м, 1 Н, Н-4' Lac), 7.45–7.55 (м, 4 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.19, 20.58, 20.69, 20.78, 20.92, 22.79, 25.46, 26.24, 26.48, 27.70, 29.10, 29.39, 29.47, 29.62, 29.78, 29.81, 30.25, 32.05, 49.54, 49.68, 49.88, 61.00, 62.28, 66.88, 69.38, 70.11, 70.78, 71.20, 71.90, 72.00, 72.78, 73.09, 76.41, 78.50, 100.68, 101.15, 119.37, 123.56, 128.46, 142.20, 169.41, 169.57, 169.84, 170.08, 170.18, 170.20, 170.25. Масс-спектр, m/z: 1496.028 [M + K]⁺, вычислено для C₇₃H₁₂₀KN₂O₂₅S: 1495.754.

N-[6-O-(2,3,4,6-тетра-О-Ацетил-α-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид 4-(3-карбоксипропионамидо)бензолсульфокислоты (Vb). Соединение (Vb) получали аналогично соединению (Va), исходя из 0.245 г (0.223 ммоль) соединения (IVb) в 4 мл безводного CH₂Cl₂, 0.223 г (2.230 ммоль) янтарного ангидрида, 5.4 мг N,N-диметил-4-аминопиридина и 45 мкл Et₃N. Система для колоночной хроматографии толуол–этилацетат (4 : 1). Выход соединения (Vb) составил 0.205 г (78%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 H, J 6.7, 2 CH₂CH₃), 1.07–1.30 (м, 48 H, 2 (CH₂)₁₁, CH₂CH₂), 1.31–1.57 (м, 8 H, СН₂СН₂N, 2 ОСН₂СН₂, OСН₂СН₂), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 2.02 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H, 4 CH₃CO), 2.58–2.74 (м, 4 H, NCOCH₂CH₂COO), 2.96–3.28 (м, 4 H, CH₂NCH₂), 3.29–3.39 (м, 6 H, 2 CH₂CH₂O, CH₂O), 3.41–3.53 (м, 2 H, CHH_aO, CH₂CHCH₂), 3.60 (дт, J 9.6, 6.4, 1 H, CHH_bO), 3.88–3.93 (м, 1 H, H5-Man), 4.05 (дд, 1 H, J 2.4, 12.2, H_a6-Man), 4.22 (дд, 1 H, J 5.2, 12.2, H_b6-Man), 4.73 (д, 1 H, J 1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1 H, J 1.6, 3.1, H2-Man), 5.19 (дд, 1 H, J 9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1 H, J 3.1, 9.8, H3-Man), 7.58–7.72 (м, 4 H, Ar), 8.22 (уш с, 1 H, NH). ¹³C-ЯМР: 14.25, 20.90, 20.95, 22.80, 25.71, 26.23, 26.45, 27.31, 28.81, 29.00, 29.22, 29.48, 29.63, 29.72, 30.24, 32.04, 49.25, 49.35, 49.51, 52.07, 62.64, 66.22, 68.37, 68.49, 69.63, 69.72, 70.62, 70.67, 70.77, 70.80, 71.87, 76.73, 77.16, 77.36, 77.58 ,78.49, 78.61, 97.60, 119.31, 128.46, 134.89, 134.94, 142.07, 169.92, 170.47, 170.64, 170.70, 170.72. Масс-спектр MALDI, m/z: 1191.423 [M + Na]⁺, вычислено для C₆₁H₁₀₄N₂NaO₁₇S: 1191.695.

(N-{6-O-(2,3,6,2',3',4',6'-тетра-О-Ацетилβ-лактозилокси)гексил}-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид) 4-{3-[(N⁴,N⁹,N¹²-трис-(трет-бутоксикарбонил))-12-амино-4,9-диазадодециламинокарбонил]пропионамидо}бензолсульфокислоты (VIa). К охлажденному до 4°С раствору 0.080 г (0.0535 ммоль) соединения (Va) и 0.017 г (0.0342 ммоль) N¹,N⁴,N⁹-тритрет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекана в 6 мл ДМФА добавляли последовательно 20 мкл (0.120 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, а через 10 мин по каплям вносили раствор 0.045 г (0.120 ммоль) HBTU в 2 мл ДМФА в течение 1 ч. Через 2 ч к реакционной смеси добавляли 8 мл CНCl₃ и экстрагировали 3%-ным водным раствором HCl (3 × 5 мл). Органическую фазу сушили (Na₂SO₄), фильтровали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя системой CНCl₃–СH₃OH (50 : 1). Выход соединения (VIa) составил 0.072 г (69%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 Н, J 6.8, 2 СН₂СН₃), 1.11–1.28 (м, 48 Н, 2 (СН₂)₁₁, (CH₂)₂), 1.28–1.66 (м, 47 H, 3 CH₂CH₂O, 4 CH₂CH₂N, 2 CH₂CH₂NH, 9 CH₃), 1.89 (с, 3 H ), 1.91 (с, 3 H), 1.97 (с, 6 H), 2.03 (с, 3 H), 2.07 (с, 3 H), 2.10 (с, 3 H, 7 CH₃CO), 2.56–2.75 (м, 4 H, NC(O)CH₂CH₂C(O)N), 2.92–3.65 (м, 25 H, 6 CH₂N, 2 CH₂NH, 3 CH₂O, CH₂CH), 3.68–3.75 (м, 2 Н, Н_ab6'-Lac), 3.78–3.86 (м, 1 Н, Н5'-Lac), 3.91–4.12 (м, 3 Н, H5-Lac, H_ab6-Lac,), 4.37 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1' Lac), 4.41 (м, 1 Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1 Н, J 7.8, Н-1 Lac), 4.79 (дд, 1 Н, J 7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1 Н, J 3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1 H, J 7.8, 10.3, H-2' Lac), 5.12 (т, 1 Н, J 9.4, Н-3 Lac), 5.29 (м, 1 Н, Н-4' Lac), 7.55–7.71 (м, 4 H, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.19, 20.58, 20.70, 22.76, 25.50, 25.87, 25.96, 26.21, 26.51, 28.21, 28.54, 29.18, 29.43, 29.59, 29.74, 30.21, 32.00, 49.75, 49.86, 50.03, 60.93, 62.21, 62.49, 63.94, 64.58, 66.79, 69.28, 70.05, 70.68, 70.78, 71.13, 71.82, 72.73, 73.00, 76.45, 78.29, 100.67, 101.15, 110.84, 119.38, 128.43, 142.20, 169.25, 170.18, 170.22, 170.44, 170.51, 171.22, 171.95, 172.95. Масс-спектр MALDI, m/z: 1964.790 [M + Na]⁺, вычислено для C₉₈H₁₆₈N₆NaO₃₀S: 1964.142.

(N-{6-O-(2,3,4,6-тетра-О-Ацетил-α-D-маннопиранозилокси)гексил}-N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид) 4-{3-[(N⁴,N⁹,N¹²-триc-(трет-бутоксикарбонил))-12-амино-4,9-диазадодециламинокарбонил]пропионамидо}бензолсульфокислоты (VIb). Соединение (VIb) получали аналогично соединению (VIa), исходя из 0.177 г (0.151 ммоль) соединения (Vb) и 0.161 г (0.32 ммоль) N¹,N⁴,N⁹-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекана в 9.5 мл ДМФА, 37 мкл (0.32 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, раствора 161 мг (0.32 ммоль) HBTU в 2 мл ДМФА. Время реакции 5 ч. Система для колоночной хроматографии толуол–ацетон (20 : 1). Выход соединения (VIb) составил 0.126 г (50%). ¹Н-ЯМР: 0.81 (т, 6 H, J 6.7, 2 CH₂CH₃), 1.15–1.30 (м, 48 H, 2 (CH₂)₁₁, CH₂CH₂), 1.30–1.66 (м, 47 H, 3 CH₂CH₂O, 4 CH₂CH₂N, 2 CH₂CH₂NH, 9 CH₃), 1.91 (с, 3 H), 1.96 (с, 3 H), 2.02 (с, 3 H), 2.08 (с, 3 H, 4 CH₃CO), 2.58–2.74 (м, 4 H, NCOCH₂CH₂COO), 2.96–3.28 (м, 4 H, CH₂NCH₂), 3.29–3.39 (м, 6 H, 2 CH₂CH₂O, CH₂O), 3.41–3.53 (м, 2 H, CHH_aO, CH₂CHCH₂), 3.61 (дт, J 9.6, 6.4, 1 H, CHH_bO), 3.87–3.93 (м, 1 H, H5-Man), 4.04 (дд, 1 H, J 2.4, 12.2, H_a6-Man), 4.22 (дд, 1 H, J 5.2, 12.2, H_b6-Man), 4.73 (д, 1 H, J 1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1 H, J 1.6, 3.1, H2-Man), 5.19 (дд, 1 H, J 9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1 H, J 3.1, 9.8, H3-Man), 7.62–7.66 (м, 4 H, Ar), 8.22 (уш с, 1 H, NH). ¹³C-ЯМР: 14.25, 20.88, 22.80, 25.80, 26.58, 27.45, 27.71, 28.05, 29.13, 29.33, 30.24, 31.62, 33.43, 36.02, 37.57, 38.73, 43.37, 43.99, 44.42, 46.40, 46.95, 49.77, 49.99, 62.62, 66.30, 68.44, 68.48, 69.39, 69.76, 70.73, 71.84, 76.77, 77.58, 78.33, 78.58, 80.15, 97.66, 111.05, 117.72, 119.26, 126.16, 126.97, 128.45, 134.12, 142.52, 145.46, 156.22, 170.25, 170.82. Масс-спектр, m/z: 1675.528 [M + Na]⁺, вычислено для C₈₆H₁₅₂N₆NaO₂₂S: 1676.058.

(N-{6-O-Лактозилокси)гексил}-N-(rac-2,3дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид)-4-{3-(12-амино-4,9-диазадодециламинокарбонил)пропионамидо}бензолсульфокислоты тригидрохлорид (D2). К раствору 0.053 г (0.0272 ммоль) соединения (VIa) в 1.7 мл CH₂Cl₂ добавляли 0.162 мл (2.181 ммоль) трифторуксусной кислоты. Через 3 ч к реакционной смеси добавляли диэтиловый эфир, растворители удаляли в вакууме. К остатку добавляли 11.7 мл 0.04 н. раствора метилата натрия в метаноле и выдерживали 4 ч. К реакционной смеси добавляли раствор 4 н. HCl в диоксане, пока значение pH смеси не достигнет 5. Растворители удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с обращенно-фазовым силикагелем LiChroprer^®RP-18 (Merck), элюируя системой метанол–0.1% водн. НСl (100 : 1). Выход соединения составил 0.103 г (64 %). ¹Н-ЯМР (Py-d5): 0.79 (т, 6 Н, J 6.8, 2 СН₂СН₃), 1.02–1.41 (м, 48 Н, 2 (СН₂)₁₁, (CH₂)₂), 1.41–1.61 (м, 16 H, 3 CH₂CH₂O, CH₂CH₂N, 4 CH₂CH₂NH), 1.81–2.31 (м, 4 H, NC(O)CH₂CH₂C(O)N), 2.51–3.61 (м, 25 Н, 3 ОСН₂, 2 NСН₂, 5 NHСН₂, NH₂СН₂, CH₂CH), 3.61–4.44 (м, 12 Н, H5-Lac, Н5'-Lac, H_ab6-Lac, Н_ab6'-Lac, Н-1' Lac, Н-4 Lac, Н-1 Lac, Н-2 Lac, Н-3' Lac, Н-3 Lac), 4.55–4.67 (м, 1 H, H-2' Lac), 4.81–4.99 (м, 1 Н, Н-4' Lac), 7.75–7.82 и 8.10–8.21 (м, 4 Н, Ar). ¹³C-ЯМР: 14.84, 23.48, 24.28, 25.50, 26.40, 27.29, 28.54, 30.16, 30.55, 30.72, 30.72, 31.23, 33.63, 38.47, 46.04, 46.47, 48.05, 50.46, 62.32, 62.49, 70.27, 70.40, 71.24, 72.28, 72.88, 75.25, 76.79, 77.49, 78.72, 79.52, 82.04, 104.51, 105.80, 120.28, 129.27, 134.58, 144.82, 172.96, 174.35. Масс-спектр MALDI, m/z: 1348.117 [M + H – 3HCl]⁺ вычислено для C₆₉H₁₃₁N₆O₁₇S: 1347.929.

(N-{6-O-α-D-Маннопиранозилокси)гексил}N-(rac-2,3-дитетрадецилоксипроп-1-ил)амид)4-{3-(12-амино-4,9-диазадодециламинокарбонил)пропионамидо}бензолсульфокислоты тригидрохлорид (D3). Соединение (D3) получали аналогично соединению (D2), исходя из 0.110 г (0.0666 ммоль) соединения (VIb) в 3.5 мл CH₂Cl₂, 0.400 мл (7.270 ммоль) трифторуксусной кислоты, времени реакции 4.5 ч, 23 мл 0.04 н. раствора метилата натрия в метаноле, времени реакции 5.5 ч. Растворители удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с обращенно-фазовым силикагелем YMC-Gel ODS-AQ 12S50 (YMC), элюируя системой метанол– вода (1 : 1 → 5 : 1). Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 5 мл дистиллированной воды и проводили диализ против воды с использованием диализной мембраны Spectra/Por® 6 (Repligen, США). Выход соединения составил 0.041 г (55%). ¹Н-ЯМР (Py-d5): 0.67 (т, 6 H, J 6.7, 2 CH₂CH₃), 1.10 (с, 44 H, 2 (CH₂)₁₁), 1.15–1.25 (м, 4 H, CH₂CH₂), 1.34–1.61 (м, 16 H, 3 CH₂CH₂O, CH₂CH₂N, 4 CH₂CH₂NH), 1.81–2.31 (м, 4 H, NC(O)CH₂CH₂C(O)N), 2.51–3.61 (м, 25 Н, 3 ОСН₂, 2 NСН₂, 5 NHСН₂, NH₂СН₂, CH₂CH), 3.61–4.57 (м, 1 H, H5-Man, H6-Man, H2-Man, H4-Man, H3-Man), 5.22 (д, 1 H, H(1) Man, J 1.2), 7.75–7.91 (м, 2 H) и 8.05–8.15 (м, 2 H, Ar), 8.95–9.02 (м, 1 H, NH), 11.05–11.45 (м, 1 H, NH). ¹³C-ЯМР: 24.67, 25.75, 26.33, 27.65, 29.39, 29.62, 29.71, 29.77, 30.46, 31.24, 31.89, 45.32, 46.75, 47.19, 61.93, 66.91, 67.11, 67.99, 70.46, 71.50, 71.78, 72.32, 78.81, 100.77, 119.43, 122.56, 123.92, 128.50, 134.00, 135.98, 143.97, 148.84, 172.21, 173.78. Масс-спектр MALDI, m/z: 1185.499 [M + H– 3HCl]⁺, вычислено для C₆₃H₁₂₁N₆O₁₂S: 1185.876.

Водные дисперсии катионных амфифилов. Водные дисперсии углеводсодержащих катионных амфифилов D1–D3 были получены в деионизированной воде (MilliQ) с концентрацией 1 мМ путем озвучивания на ультразвуковой бане (Bandelin Sonorex Digitec DT 52H, Германия) в течение 5 мин при 24°С.

Катионные липосомы. Катионные липосомы D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE получали методом гидратации липидной пленки и последующей обработки ультразвуком [32]. Навески соединений D1–D3 и липида-хелпера DOPE (Avanti Polar Lipids, США) растворяли в CНCl₃. Полученные растворы смешивали в соотношении 1 : 1 (мольн.). Растворитель удаляли в вакууме водоструйного насоса, образовавшуюся липидную пленку сушили 4 ч в вакууме масляного насоса (0.01 Торр). К сухой пленке добавляли необходимое количество деионизированной воды (MilliQ) (концентрация по амфифилам D1–D3 1 мM) и диспергировали при 60°С до полного отслоения пленки со стенок колбы. Образовавшуюся дисперсию обрабатывали на ультразвуковой бане (Bandelin Sonorex Digitec DT 52H, Германия) в течение 15 мин при 70°С для получения катионных липосом D1-DOPE, D2-DOPE и D3-DOPE, которые фильтровали через стерильный фильтр Chromafil CA-45/25 (S) (Macherey-Nagel, Германия) с размером пор 450 нм и хранили при 4°С.

Нуклеиновые кислоты. 25-Звенный олигодезоксирибонуклеотид 5'-TACAGTGGAATTGTATGCCTATTAT-3', содержащий на 5'-конце остаток FITC, синтезировали твердофазным фосфитамидным методом и выделяли с помощью ВЭЖХ (ИХБФМ СО РАН). Чистота олигонуклеотида, проанализированная электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях, составляла 95–98%. Концентрацию олигонуклеотида определяли на спектрофотометре BioMate 3 (Termo Electron Corporation, США). В экспериментах использовали пДНК pEGFP-C2 (Clontech, Германия), кодирующую зеленый флуоресцентный белок, и siРНК, направленную на мРНК EGFP, с последовательностью: 5′-GAACGGCAUCAAGGUGAACTT-3′ (смысловая цепь) и 5′-GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT-3′ (антисмысловая цепь), полученную в ИХБФМ СО РАН.

Комплексы нуклеиновых кислот с катионными амфифилами и катионными липосомами. Для трансфекции клеток НЕК 293 и BHK IR-780 растворы водных дисперсий D1–D3 или катионных липосом (25 мкл) и нуклеиновых кислот (25 мкл) в концентрациях, соответствующих необходимым соотношениям N/P, смешивали в среде Opti-MEM® (TermoFisher Scientific, США) и инкубировали в течение 20 мин при 24°С.

Клеточные культуры. Клетки почки эмбриона человека HEK 293, фибробласты почки хомячка BHK были получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Генетически модифицированные клетки BHK IR-780, экспрессирующие EGFP, любезно предоставлены проф. В.С. Прасоловым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва).

Клетки HEK 293, BHK и BHK IR-780 культивировали в среде DMEM в присутствии 10% FBS, 1%-ного раствора антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина) в атмосфере 5% СО₂ при 37°С и регулярно пассировали для поддержания экспоненциального роста.

Цитотоксичность. Относительное количество живых клеток после инкубации с катионными амфифилами или липосомами определяли с помощью МТТ-теста [39]. Клетки НЕК 293 и ВНК высаживали в 96-луночные планшеты (при плотности посадки 7.5 × 10³ кл./лунку для НЕК 293 и 3 × 10³ кл./лунку для ВНК), инкубировали с катионными амфифилами или липосомами (конечная концентрация в лунке 1–80 мкМ) в течение 4 ч в бессывороточных условиях. Затем добавляли FBS (до 10%) и инкубировали еще 20 ч, добавляли раствор МТТ (бромид 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) до конечной концентрации 0.5 мг/мл и дополнительно инкубировали клетки 3 ч. Культуральную среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО на лунку и измеряли разницу оптической плотности раствора при 570 и 620 нм на планшетном спектрофотометре Multiscan RC (Labsystems, Финляндия).

Жизнеспособность клеток НЕК 293 (при плотности посадки 5 × 10³ клеток на лунку) в присутствии 4, 8, 16, 32 и 64 мкМ липосом D2-DOPE контролировали в режиме реального времени на приборе xCELLigence (ACEA Biosciences, США) в течение 90 ч.

Трансфекция клеток. Клетки HEK 293 и BHK IR-780 высаживали в 24-луночные планшеты (при плотности посадки 2 × 10⁵ кл./лунку HEK 293 для доставки FITC-ODN, 1.2 × 10⁵ кл./лунку HEK 293 для доставки пДНК и 0.1 × 10⁵ кл./лунку для BHK IR-780 для доставки siРНК) и инкубировали в течение 24 ч. В день трансфекции культуральную среду заменяли на среду DMEM (200 мкл) с 10% FBS (без антибиотиков). К клеткам добавляли комплексы FITC-ODN (1 мкМ в лунке), пДНК (2 мкг/мл в лунке) или siРНК (50 нМ в лунке) с амфифилами или катионными липосомами, сформированные при различных соотношениях N/P, и инкубировали в стандартных условиях 4 ч. В случае доставки FITC-ODN клетки анализировали сразу после инкубации. В случае пДНК и siРНК культуральную среду заменяли на свежую DMEM с 10% FBS (500 мкл) и дополнительно инкубировали клетки при 37°С в течение 44 или 68 ч соответственно.

Проточная цитометрия. Для оценки эффективности доставки FITC-ODN, пДНК и siРНК клетки HEK 293 и BHK IR-780 дважды промывали PBS, обрабатывали раствором трипсина в PBS (0.5 мг/мл) в течение 2 мин при 37°С для открепления клеток с поверхности лунки. Открепившиеся клетки суспендировали в среде DMEM с 10% FBS для ингибирования дальнейшего действия трипсина, переносили в пробирки и осаждали центрифугированием (Eppendorf MiniSpin, Eppendorf, Германия) при 200 g в течение 10 мин. Супернатант убирали, клетки дважды промывали PBS и фиксировали 2%-ным раствором формальдегида в PBS (600 мкл). Количество трансфицированных клеток и среднее значение интенсивности флуоресценции в клеточной популяции измеряли на цитофлуориметре NovoCyte 3000 (ACEA Biosciences, США) и Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировали не менее 20 тыс. клеток. Все экспериментальные точки были получены в результате трех независимых экспериментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированы новые катионные амфифилы, содержащие остатки лактозы или D-маннозы. На основе полученных соединений и липида-хелпера DOPE были сформированы катионные липосомы, изучена их цитотоксичность и проведена оценка способности доставлять различные нуклеиновые кислоты в эукариотические клетки.

Углеводсодержащие катионные амфифилы D1–D3 независимо от структуры углеводного фрагмента эффективно доставляли короткий флуоресцеин-меченный олигонуклеотид (FITC-ODN) в клетки HEK 293 в присутствии сыворотки крови (рис. 3), в то время как эффективная доставка плазмидной ДНК достигалась только в бессывороточных условиях (рис. 5а, 5б). Доставка короткой siРНК амфифилами D1–D3 также была малоэффективной, снижение уровня экспрессии белка на 40% наблюдалось только для лактозилсодержащего амфифила D2 в отсутствие сыворотки в клеточной среде (рис. 7а). Добавление 10% FBS приводило к резкому снижению эффективности доставки плазмидной ДНК и siРНК (рис. 5 и 7). Известно, что некоторые липосомальные системы доставки неэффективны при проведении трансфекции клеток в присутствии сыворотки крови, что связано с взаимодействием липоплексов с ее компонентами [33, 34], увеличением их размера [40], перезарядкой поверхностного потенциала и, как следствие, снижением взаимодействия с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Белковая “корона” [41] может по-разному влиять на эффективность трансфекции. Так, было показано, что она не изменяет эффективность наночастиц на основе ионизируемых липидов, но увеличивает время трансфекции Lipofectamine 2000 и снижает его эффективность [42].

Среди катионных липосом, полученных на основе углеводсодержащих катионных амфифилов, наиболее перспективной следует считать композицию D2-DOPE, содержащую амфифил D2 с остатком лактозы, которая оказалась нетоксичной для клеток НЕК 293 и BHK. При этом данные липосомы не подходят для трансфекции клеток плазмидной ДНК (рис. 6), однако эффективно доставляют короткие НК (FITCODN и siРНК) как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки в культуральной среде (рис. 4, 7в, 7г).

Таким образом, полученные углевод-содержащие катионные амфифилы, как в индивидуальном состоянии, так и в составе катионных липосом, являются перспективными средствами доставки коротких нуклеиновых кислот для дальнейшей разработки генно-терапевтических препаратов.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках научного проекта № 23-73-10168 с использованием оборудования ЦКП РТУ МИРЭА при поддержке Минобрнауки России (cоглашение № 075-15-2021-689 от 01.09.2021), работа О.В. Маркова и М.А. Зенковой поддержана за счет бюджета Российской Федерации (проект № 121031300044-5).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Авторы ЕВШ и АОБ – подготовка и характеристика соединений. Авторы ЕВШ и ОВМ провели биологические исследования. Авторы ЕВШ, ОВМ, НГМ, МАЗ и МАМ – подготовка текста статьи. Авторы ЕВШ, МАЗ и МАМ – подготовка финального варианта текста статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

About the authors

E. V. Shmendel

MIREA – Russian Technological University

Author for correspondence.
Email: elena_shmendel@mail.ru

Lomonosov Institute of Fine Chemical Technologies

Russian Federation, prosp. Vernadskogo 86, Moscow, 119571

A. O. Buyanova

MIREA – Russian Technological University

Email: elena_shmendel@mail.ru

Lomonosov Institute of Fine Chemical Technologies

Russian Federation, prosp. Vernadskogo 86, Moscow, 119571

O. V. Markov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: elena_shmendel@mail.ru
Russian Federation, prosp. ak. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

N. G. Morozova

MIREA – Russian Technological University

Email: elena_shmendel@mail.ru

Lomonosov Institute of Fine Chemical Technologies

Russian Federation, prosp. Vernadskogo 86, Moscow, 119571

M. A. Zenkova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: elena_shmendel@mail.ru
Russian Federation, prosp. ak. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

M. A. Maslov

MIREA – Russian Technological University

Email: elena_shmendel@mail.ru

Lomonosov Institute of Fine Chemical Technologies

Russian Federation, prosp. Vernadskogo 86, Moscow, 119571

References

Supplementary files