Оценка острой токсичности пиридиновых производных 3,4-дигидрохиноксалин-2-она и 3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

У соединений, содержащих ядро хиноксалина и оксазина, выявлен разнообразный спектр биологической активности, в частности показаны их антибактериальные [1–4], противовирусные [5], противоопухолевые [6], противотуберкулезные [7–9], противовоспалительные [10] и другие свойства [11, 12].

Усилить биохимическую активность и метаболическую стабильность лекарственного средства, повысить проницаемость клеток, устранить проблемы со связыванием с белками и тем самым в значительной степени улучшить фармакокинетические и фармакодинамические свойства молекул позволяет пиридиновая составляющая, присутствующая в соединении [13]. В этой связи заслуживают внимания структурные модификации производных 3,5-диацетил-2,6-диметилпиридина до соединений (I–IV) (рис. 1), приведенные нами в работах [14–18].

 

Рис. 1. Структуры производных пиридина.

 

У ряда производных (соединения (I), (II)) в опытах in vitro были выявлены выраженные и умеренные противотуберкулезные, антибактериальные и противогрибковые свойства [14, 15]. Одно из производных с линкерным 3,4-дигидрохиноксалин-2-оновым заместителем (II) в тестах in vitro проявило выраженную противовирусную активность, подавляя рост микобактерий и репликацию вируса SARS-CoV-2 [16]. Кроме того, синтезированные на основе 3,5-диацетил-2,6-диметилпиридина (IIIa) производные бис(3,4-дигидрохиноксалин-2-она) (IVa) и бис(3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она) (IVb) (схема 1) в результате биоскрининга in vivo на модели уксусных корчей показали анальгетическую активность, превосходящую активность препарата сравнения – анальгина [17, 18]. Для дальнейшего исследования биологической активности наиболее перспективных биспроизводных (IVa) и (IVb) необходимо изучить их токсичность.

 

Схема 1. Синтез производных бис(3,4-дигидрохиноксалин-2-она) (IVa) и бис(3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она) (IVb).

 

Цель данной работы состояла в оценке острой токсичности биспроизводных (IVa) и (IVb) при внутрибрюшинном введении морским свинкам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка острой токсичности. Для оценки острой токсичности 42 морские свинки были разделены на 7 равных групп (n = 6). Животным 1–3-й групп вводили однократно внутрибрюшинно соединение (IVa) соответственно в дозах 100, 200 и 400 мг/кг, 4–6-й групп – соединение (IVb) тем же способом в тех же дозах, 7-й группы – однократно внутрибрюшинно физиологический раствор в объеме 1 мл. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 сут.

Непосредственно после внутрибрюшинного введения соединения (IVa) независимо от дозы отмечались судорожные подергивания задних конечностей, снижение подвижности, замедленная реакция на окружающие раздражители. В единичных случаях регистрировали снижение температуры тела до 36.6°С и диарею. Эти симптомы в течение первых суток исчезали, в последующие дни общее состояние восстанавливалось и не отличалось от контрольных особей. Гибели животных не наблюдалось.

Результаты исследования острой токсичности соединений (IVa) и (IVb) представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Острая токсичность производных бис(3,4-дигидрохиноксалин-2-она) (IVa) и бис(3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она) (IVb) при однократном внутрибрюшинном введении морским свинкам линии агути

Группа животных	Соединение	Доза препарата, мг/кг	Число погибших/общее число животных	Сроки гибели, сут
Контроль	–	–	0/6	–
1-я группа	(IVa)	100	0/6	–
2-я группа		200	0/6	–
3-я группа		400	0/6	–
4-я группа	(IVb)	100	2/6	3, 13
5-я группа		200	4/6	13, 13, 14, 14
6-я группа		400	6/6	2, 2, 2, 2, 3, 3

 

После введения морским свинкам соединения (IVb) аналогичные признаки интоксикации обнаруживались более длительное время, которые заканчивались гибелью на 2–3-е сутки 100% животных, которым вводили препарат в дозе 400 мг/кг, а также одной особи – в дозе 100 мг/кг. Отдаленную гибель фиксировали у четырех особей после введения соединения в дозе 200 мг/кг, а также у одной – в дозе 100 мг/кг на 13-е и 14-е сутки после введения препарата. При патологоанатомическом исследовании макроскопических признаков повреждения внутренних органов не наблюдалось, отмечали лишь гиперемию печени, селезенки и почек.

Гематологические и биохимические исследования. На следующем этапе через 15 сут после внутрибрюшинного введения соединений (IVa) и (IVb), а также у морских свинок контрольной группы проводили забор крови для гематологических и биохимических исследований. Результаты представлены в табл. 2 и 3.

 

Таблица 2. Гематологические показатели крови морских свинок через 15 сут после однократного внутрибрюшинного введения соединения (IVa)

Показатель	Норма#	Контроль	Доза, мг/кг
			100	200	400
Эритроциты, × 1012/л	4.5–6.4	6.4 ± 0.4	7.0 ± 0.1	7.4 ± 0.6	6.1 ± 0.1
Лейкоциты, × 109/л	7–13	9.2 ± 1.0	10.7 ± 1.1	12.9 ± 1.9	11.8 ± 1.1
Эозинофилы, %	1–13	3.3 ± 0.3	4.3 ± 0.3	4.3 ± 0.3	3.3 ± 0.3
Базофилы, %	0–2	0.3 ± 0.3	0.3 ± 0.3	1.3 ± 0.3	0.3 ± 0.3
Лимфоциты, %	36–54	53.0 ± 1.5	37.7 ± 1.2**	45.0 ± 2.3*	52.7 ± 2.2
Сегментоядерные нейтрофилы, %	30–45	38.7 ± 1.7	51.3 ± 1.2**	44.3 ± 1.5	37.7 ± 2.9
Палочкоядерные нейтрофилы, %	1–5	1.3 ± 0.3	2.0 ± 0.6	1.7 ± 0.7	1.0 ± 0.0
Моноциты, %	3–8	3.3 ± 0.3	4.3 ± 0.7	3.3 ± 0.3	5.0 ± 0.6

Примечание: данные представлены в виде M ± m.

*р ˂ 0.05; **р ˂ 0.01.

^# Референтные интервалы приведены в соответствии с данными А.А. Кудрявцева и Л.А. Кудрявцевой (1974) [21].

 

Таблица 3. Биохимические показатели крови морских свинок через 15 сут после однократного внутрибрюшинного введения соединения (IVa)

Показатель	Норма#	Контроль	Доза, мг/кг
			100	200	400
ALT, Ед/л	28–103	39.0 ± 4.2	67.1 ± 7.0*	54.4 ± 3.9*	42.6 ± 5.9
AST, Ед/л	38–150	53.7 ± 9.2	50.2 ± 5.4	89.1 ± 31.1	46.6 ± 7.4
ALP, Ед/л	39–162	140.4 ± 19.1	72.0 ± 3.6*	125.4 ± 10.7	136.9 ± 13.6
Общий билирубин, мкмоль/л	0.1–1.8	1.9 ± 0.1	2.0 ± 0.2	1.9 ± 0.2	1.8 ± 0.1
Общий холестерин, ммоль/л	0.8–2.5	1.4 ± 0.2	2.7 ± 0.7	2.4 ± 0.9	1.3 ± 0.1
Креатинин, мкмоль/л	47–87	78.3 ± 8.6	62.1 ± 2.4	72.6 ± 2.4	75.4 ± 3.6
Мочевина, ммоль/л	5–12	10.7 ± 1.1	9.5 ± 0.2	9.9 ± 0.2	10.6 ± 0.7
Общий белок, г/л	45–66	49.6 ± 1.6	49.4 ± 0.9	50.9 ± 0.8	49.7 ± 2.1
Альбумин, г/л	17–30	30.1 ± 1.8	31.5 ± 1.2	34.7 ± 1.0	34.6 ± 1.9

Примечание: данные представлены в виде M ± m. ALT – аланинаминотрансфераза, AST – аспартатаминотрансфераза, ALP – щелочная фосфатаза (alkaline phosphatase).

*р ˂ 0.05.

^# Референтные интервалы приведены в соответствии с данными М.В. Мирошникова с соавт. (2022) [22].

 

У морских свинок на 15-е сутки от начала эксперимента при введении соединения (IVa) в дозах 100 и 200 мг/кг относительно контрольной группы зарегистрировано снижение числа лимфоцитов в 1.4 раза (р ˂ 0.01) и 1.17 раза (р ˂ 0.05) соответственно при одновременном увеличении процентного содержания сегментоядерных нейтрофилов в 1.33 раза (р ˂ 0.01) и 1.14 раза. Изменения остальных гематологических параметров не достигали статистически достоверной разницы по сравнению с показателями контроля и не выходили за пределы нормальных физиологических значений, за исключением умеренного повышения концентрации эритроцитов при инокуляции препарата в дозах 100 и 200 мг/кг.

Анализ данных биохимических исследований, проведенных на 15-е сутки после введения морским свинкам соединения (IVa), показал, что концентрация аланинаминотрансферазы (ALT) достоверно (р < 0.05) возрастала при введении препарата в дозах 100 и 200 мг/кг в 1.72 и в 1.40 раза соответственно относительно контрольной группы, а уровень щелочной фосфатазы, напротив, был достоверно снижен (р < 0.05), но только при инокуляции животным химического соединения в дозе 100 мг/кг. Изменения остальных параметров химического состава сыворотки крови не достигали статистически достоверных отличий от контрольной группы. Следует отметить, что все анализируемые параметры находились в пределах нормальных физиологических колебаний, за исключением альбумина и общего билирубина, концентрация которых была незначительно выше нормы как в опытных, так и контрольной группах.

У морских свинок, выживших после введения соединения (IVb) в дозе 100 мг/кг, гематологические параметры, показатели ферментной активности печени, а также липидного обмена находились в пределах допустимых физиологических колебаний. Отмечено лишь умеренное снижение концентрации общего белка при одновременном увеличении уровня альбумина. В то же время относительно контрольной группы наблюдалось достоверное (р < 0.05) снижение концентрации щелочной фосфатазы в 1.80 раза, общего билирубина в 1.18 раза и общего белка в 1.15 раза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Диэтил-(2Z,2'Z)-4,4'-(2,6-диметилпиридин-3,5-диил)-бис(2-гидрокси-4-оксобут-2-еноат) (IIIb) [17]. К раствору 5.0 г (26 ммоль) 3,5-диацетил-2,6-диметилпиридина (IIIa) в 60 мл бензола приливали 15.3 г (105 ммоль) диэтилоксалата и при перемешивании вносили 1.5 г (65 ммоль) натрия. После растворения натрия перемешивали еще 2 ч. Затем осадок натриевой соли отфильтровывали, промывали бензолом и сушили на воздухе. Далее осадок растворяли в теплой воде, фильтровали через бумажный фильтр и подкисляли разбавленной соляной кислотой до появления хлопьевидного осадка. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили на воздухе. Перекристаллизовывали из смеси гексан–хлороформ (2 : 1). Выход 70%, красно-оранжевые игольчатые кристаллы, т. пл. 105–106°С (гексан–хлороформ, 2 : 1).

Общая методика синтеза исследуемых соединений (IVa) и (IVb) [17]. Смесь 2.5 г (6.5 ммоль) диэтил-(2Z,2'Z)-4,4'-(2,6-диметилпиридин-3,5-диил)-бис(2-гидрокси-4-оксобут-2-еноата) (IIIb) и 1.4 г (13 ммоль) о-фенилендиамина или о-аминофенола в 50 мл 2-пропанола кипятили при перемешивании в течение 3 ч. Раствор с выпавшим осадком охлаждали, отфильтровывали, осадок промывали 2-пропанолом и перекристаллизовывали из смеси 2-пропанол–хлороформ.

(3Z,3'Z)-3,3'-[(2,6-Диметилпиридин-3,5-диил)бис(2-оксоэтан-2-ил-1-илиден)]бис(3,4-дигидрохиноксалин-2(1H)-он) (IVa). Выход 82%, ярко-желтые кристаллы, т. пл. >330°С (2-пропанол–диоксан).

(3Z,3'Z)-3,3'-[(2,6-Диметилпиридин-3,5-диил)бис(2-оксоэтан-2-ил-1-илиден)]бис(3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-он) (IVb). Выход 93%, оранжевые кристаллы, т. пл. 266–268°С (2-пропанол–диоксан).

Физико-химические и спектральные характеристики соединений (IIIb), (IVa) и (IVb) приведены нами в работе [17].

Экспериментальные животные. Исследования проводили на 42 морских свинках линии агути, выращенных и содержавшихся в условиях специализированного вивария отдела ветеринарии Омского аграрного научного центра. Группы экспериментальных животных подбирали по принципу аналогов (масса 400–500 г, возраст 4–5 месяцев). Были сформированы 6 опытных групп по 6 особей в каждой группе, за которыми вели наблюдения в течение 14 сут. Испытуемое соединение (IVa) вводили внутрибрюшинно морским свинкам 1-й, 2-й и 3-й групп в дозах 100, 200 и 300 мг/кг соответственно, соединение (IVb) – морским свинкам 4-й, 5-й и 6-й групп тем же способом и в тех же дозах. Еще 6 особей служили в качестве контроля, им вводили однократно внутрибрюшинно физиологический раствор (1 мл).

Острая токсичность соединений. Оценку острой токсичности проводили в соответствии с руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [19]. Степень токсичности определяли в соответствии с классификацией К.К. Сидорова [20].

Гематологические и биохимические исследования. На 15-е сутки после внутрибрюшинного введения соединений производили отбор проб крови из ретроорбитального венозного сплетения с помощью микропипетки.

Подсчет эритроцитов, лейкоцитов и лейкограммы производили в соответствии с общепринятыми методиками.

Биохимический анализ сыворотки крови осуществляли по показателям ферментной активности печени (ALT, AST, ALP), белкового (общий белок, альбумин, мочевина, креатинин) и липидного (общий холестерин, общий билирубин) обменов. Исследования проведены на полуавтоматическом биохимическом анализаторе EMP-168 Vet (Emperor, Китай) в соответствии с инструкциями по применению наборов реагентов (Hospitex Diagnostics, Италия страна).

Статистический анализ. Математическая обработка полученных данных включала в себя определение средних арифметических (M) и расчет ошибок средних арифметических (m). При оценке достоверности различий (р) между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий Стьюдента. Различия результатов считали статистически достоверными при уровне значимости р ≤ 0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучена острая токсичность производных бис(3,4-дигидрохиноксалин-2-она) и бис(3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она) при однократном внутрибрюшинном введении морским свинкам. Введение морским свинкам препарата (IVa) в диапазоне 100–400 мкг/кг не приводило к летальному исходу, что свидетельствовало о его малой токсичности. Соединение (IVb) проявляло умеренную токсичность, вызывая гибель 33% особей в дозе 100 мг/кг, 66% – в дозе 200 мг/кг и 100% животных в дозе 400 мг/кг. Токсическое действие соединений проявлялось нервными расстройствами (судороги, заторможенность) при отсутствии выраженных изменений гематологических и биохимических показателей относительно физиологической нормы

Cоединения (IVa) и (IVb) могут быть рекомендованы для изучения антибактериальной и противовирусной активности на морских свинках.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки Омского аграрного научного центра по теме: FNUN-2022-0035 “Разработать эффективную систему обеспечения продовольственной и биологической безопасности на основе создания новых биологических препаратов для диагностики и профилактики социально-значимых болезней животных, оптимизации технологии кормопроизводства и анализа селекции племенного дела” (№ государственной регистрации 122070700055-5).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все исследования на морских свинках проведены в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986).

Исследования одобрены локальным независимым этическим комитетом организации по уходу и использованию лабораторных животных (протокол № 2 от 20.02.2023 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Авторы САТ, АНН и НАД провели биологические исследования. Авторы АЛС и ИВК – подготовка и характеристика соединений. Автор ВСВ – подготовка оригинального текста и его финальное редактирование.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

Об авторах

С. А. Терновская

ФГБОУ “Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина”

Автор, ответственный за переписку.
Email: sa.ternovskaya2306@omgau.org
Россия, 644008 Омск, Институтская пл., 1

В. С. Власенко

ФГБНУ “Омский аграрный научный центр”

Email: vvs-76@list.ru
Россия, 644012 Омск, просп. Королева, 26

А. Н. Новиков

ФГБНУ “Омский аграрный научный центр”

Email: sa.ternovskaya2306@omgau.org
Россия, 644012 Омск, просп. Королева, 26

Н. А. Денгис

ФГБНУ “Омский аграрный научный центр”

Email: sa.ternovskaya2306@omgau.org
Россия, 644012 Омск, просп. Королева, 26

А. Л. Сталинская

Тюменский государственный университет

Email: sa.ternovskaya2306@omgau.org

Школа естественных наук

Россия, 625003 Тюмень, ул. Перекопская, 15а

И. В. Кулаков

Тюменский государственный университет

Email: i.v.kulakov@utmn.ru

Школа естественных наук

Россия, 625003 Тюмень, ул. Перекопская, 15а

Список литературы

Дополнительные файлы