Гибридные белки, содержащие протеородопсин Exiguobacterium sibiricum

Полный текст

Сокращения: ESR – ретинальный белок Exiguobacterium sibiricum; BR – бактериородопсин; Caf1M – шаперон капсульного антигена F1; DDM – n-додецил-β-D-мальтопиранозид; MBP – мальтозосвязывающий белок; PR – протеородопсин; wt ESR – ESR дикого типа.

ВВЕДЕНИЕ

Микробные родопсины – мембранные светочувствительные белки, содержащие хромофор ретиналь, который связан через основание Шиффа с остатком лизина [1–3]. В результате поглощения кванта света в их молекулах происходит ряд молекулярных событий, включающих изомеризацию ретиналя и его возвращение в исходное состояние, изменение степени протонирования основания Шиффа и ключевых аминокислотных остатков, трансмембранный перенос протонов или других ионов в случае ион-транспортных родопсинов [4, 5]. Наиболее известный и хорошо изученный представитель семейства – бактериородопсин (BR), обнаруженный в пурпурных мембранах Halobacterium salinarum [6, 7]. Значительный вклад в исследования этого белка внесли Ю.А. Овчинников и его сотрудники [8, 9].

Родопсины выполняют в клетках микроорганизмов разнообразные функции, однако можно утверждать, что наиболее распространенная функция этих белков –энергетическая. В результате трансмембранного переноса протонов BR создает электрохимический градиент (протон-движущую силу), которая используется клетками для синтеза АТФ при участии АТФ-синтазы. Такой способ генерации энергии, основанный на протонтранспортной активности BR, позволяет галобактериям выживать при понижении концентрации кислорода в среде [10]. Позднее у различных морских эубактерий были открыты протеородопсины (PR), которые вносят значительный вклад в утилизацию солнечной энергии и адаптацию микроорганизмов к существованию в олиготрофных условиях [11, 12].

Исследование транспортной активности микробных родопсинов предполагает их встраивание в замкнутый липидный бислой, например, в составе протеолипосом. Эти сферические частицы размером от 100 нм до 1 мкм, образованные липидами различного состава, являются удобной моделью природных мембран и позволяют подобрать подходящие условия для правильного фолдинга и эффективного функционирования мембранных белков [13, 14]. Уже на ранних этапах изучения BR было успешно продемонстрировано его встраивание в протеолипосомы, содержащие АТФ-синтазу различного происхождения, которое сопровождалось светозависимым синтезом АТФ [15–17]. Впоследствии были получены искусственные органеллы большего размера, содержащие PR и использующие накопленную энергию для белкового синтеза или полимеризации актина [18, 19].

Для достижения максимальной эффективности подобных систем большинство молекул светочувствительного белка должно быть ориентировано в одном направлении [20, 21]. Ориентация белков в мембране определяется различными факторами, прежде всего конфигурацией молекулы, размером частиц и свойствами входящих в ее состав липидов [20, 22, 23]. Например, BR преимущественно встраивается С-концом наружу, вследствие чего транспорт протонов осуществляется внутрь протеолипосом [24]. Для PR характерна обратная ориентация, поэтому в ответ на вспышку света происходит закисление среды [25]. В ряде случаев отдельные молекулы белка встраиваются в искусственный бислой в противоположных направлениях, в результате чего снижается эффективность транспорта и усложняется интерпретация полученных данных [21, 26].

Известно несколько подходов, обеспечивающих получение протеолипосом с одинаковой ориентацией молекул ретинального белка. Одним из первых было предложено разделение BR-содержащих протеолипосом с помощью гель-фильтрации [27]. Использование для формирования липосом липидов, содержащих заряженные группировки, позволяет регулировать встраивание в бислой белков, которые имеют различный заряд на N- и C-концах, включая PR [28]. Более универсальным представляется способ, основанный на увеличении размера одного из концов молекулы, например, за счет присоединения частиц никель-содержащей смолы к гексагистидиновой последовательности рекомбинантных белков [29]. Такой довесок препятствует проникновению соответствующего конца белка во внутреннюю полость липосом, что способствует единообразному встраиванию в липидный бислой. Аналогичный механизм обеспечивает однородную ориентацию природных мембранных белков, содержащих крупные растворимые домены [30]. Получение гибридов PR с различными растворимыми белками-партнерами способствовало его направленному встраиванию в протеолипосомы [31].

Объект наших исследований – ESR – ретинальный белок Exiguobacterium sibiricum, относящийся к семейству протеородопсинов [32–34]. От других представителей семейства ESR отличается наличием остатка лизина в положении, соответствующем донору протонов для основания Шиффа [35, 36]. Для изучения его транспортной активности в составе протеолипосом нами было получено несколько вариантов гибридных белков, содержащих ESR и различные растворимые домены. Установлено, что N-концевой гибрид Caf-ESR обеспечивает эффективное встраивание молекул белка в бислой в одном направлении, в то время как C-концевые гибриды склонны к разнонаправленному встраиванию, что приводит к уменьшению наблюдаемого переноса зарядов [37]. Цель данной работы – конструирование и экспрессия генов различных N-концевых гибридов для повышения уровня синтеза ESR в Escherichia coli и направленного включения белка в протеолипосомы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование и экспрессия гибридных генов. Для получения гибридных полипептидов, включающих ESR и N-концевые растворимые домены, мы провели клонирование генов нескольких белков-партнеров, ранее использованных для повышения уровня продукции и растворимости мембранных белков в клетках бактерий и бесклеточных системах экспрессии. Известно большое число работ, в которых с этой целью применяли тиоредоксин и мальтозосвязывающий белок (MBP) E. coli, а также белок Mistic Bacillus subtilis [38–41]. В частности, MBP обладает способностью не только существенно повышать выход рекомбинантных белков, но и облегчает их сворачивание [42, 43]. Описано успешное получение гибридных белков, включающих MBP и рецепторы, сопряженные с G-белком [44, 45], а также бактериородопсин [40]. В некоторых работах были использованы конструкции, кодирующие зрелый MBP [40, 46], в других – кодирующие белок-предшественник, содержащий природный сигнальный пептид [44, 45].

Флуоресцентный белок mCherry на N-конце гибридного белка обеспечивал направленное встраивание PR в протеолипосомы [31]. Ранее нами было показано, что гибридный белок, содержащий периплазматический шаперон Yersinia pestis Caf1M, эффективно экспрессируется в клетках бактерий и способствует единообразному встраиванию ESR в искусственный липидный бислой [37]. Таким образом, использованный нами набор включал пять белков-партнеров (рис. 1), причем три из них содержали сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию в периплазму. Соответствующие гены были объединены с последовательностью, кодирующей ESR, в составе единой рамки считывания. Для независимого фолдинга между доменами был размещен гибкий пептидный линкер, включающий 10 а.о. (GGGGSGGGGS). Схема клонирования обеспечивала добавление к С-концевой части гибридных белков гексагистидиновой последовательности для их очистки с помощью никель-аффинной хроматографии.

 

Рис. 1. Схемы строения гибридных белков. SP – сигнальная последовательность. Темно-серым цветом обозначен глицин-сериновый линкер, черным – гексагистидиновая последовательность.

 

Экспрессию полученных гибридных генов проводили в одинаковых условиях, индукцию транскрипции осуществляли добавлением ИПТГ. В результате выделения и анализа мембранной фракции культур клеток, продуцирующих соответствующие полипептиды, был обнаружен эффективный синтез двух гибридных белков – Caf-ESR, который содержал Caf1M в качестве N-концевого домена, и MBP-ESR, экспрессируемых в виде предшественников с собственными сигнальными последовательностями (рис. 2, дорожки 5, 6).

 

Рис. 2. Экспрессия гибридных белков, содержащих ESR, в клетках E. coli. Белковый электрофорез в 13%-ном SDS-ПААГ (а) и вестерн-блот-анализ (б) с анти-His-конъюгатом образцов мембранной фракции клеток E. coli С43(DE3), экспрессирующих гибридные белки (дорожки 1–7) и ESR дикого типа (дорожка 8). Номера дорожек 1–7 соответствуют нумерации конструкций на рис. 1. М – маркеры молекулярного веса белков (кДа).

 

Локализация в мембране, а также обнаружение единственной формы белков с помощью электрофореза и вестерн-блоттинга позволяют предположить, что в процессе секреции происходит отщепление сигнальных последовательностей у предшественников Caf-ESR и MBP-ESR, в результате чего их N-концевые растворимые домены располагаются в периплазматическом пространстве. Следует отметить, что экспрессия гибридного белка MBP-ESR, лишенного сигнальной последовательности, в данных условиях не была обнаружена. Также не удалось детектировать экспрессию N-концевых гибридов с mCherry (включая вариант с сигнальной последовательностью PelB), тиоредоксином и белком Mistic.

Ранее мы показали, что гибридные белки, содержащие mCherry или тиоредоксин на С-конце ESR, успешно экспрессируются в клетках бактерий [37]. Такое расположение растворимых белков-партнеров совместимо со свойственной ESR и другим микробным родопсинам ориентацией в мембране (N-конец в периплазматическом пространстве, C-конец в цитоплазме). Можно предположить, что N-концевые гибриды ESR с секретируемыми белками Caf1M и MBP ориентированы таким же образом. Расположение mCherry, зрелого MBP или тиоредоксина на N-конце ESR детерминирует противоположную ориентацию ретинального белка в клеточной мембране (N-конец в цитоплазме), что, вероятно, нарушает процесс его фолдинга. Известно, что накопление неправильно свернутых мембранных белков инициирует в клетках развитие стрессового ответа, который в числе прочих механизмов включает повышенный синтез протеолитических ферментов [47–49], что, вероятно, объясняет отсутствие экспрессии соответствующих гибридов.

Свойства гибридного белка MBP-ESR в составе мицелл. Характеристика гибридного белка Caf-ESR была проведена нами ранее [37]. Для оценки влияния N-концевого домена MBPESR на свойства входящего в его состав ретинального белка он был выделен из мембранной фракции клеток штамма-продуцента в результате солюбилизации в n-додецил-β-D-мальтопиранозиде (DDM) и последующей никель-аффинной хроматографии. Необходимо отметить, что эффективность солюбилизации данного гибрида оказалась существенно выше, чем у Caf-ESR (~80% против 25%), что можно объяснить его более высокой растворимостью благодаря использованию MBP в качестве белка-партнера. Значения максимума поглощения для MBP-ESR составили 525 нм при рН 7 и 523 нм при рН 9, что соответствует небольшому “синему” сдвигу по сравнению с диким типом ESR (528 нм при рН 7).

Кинетику светоиндуцированных изменений поглощения MBP-ESR при четырех длинах волн измеряли при двух значениях рН, при этом, как и в случае дикого типа ESR [50], было обнаружено отсутствие интермедиата М (депротонированного основания Шиффа) при рН 7 (рис. 3а). Интермедиаты с максимумом поглощения 590 нм доминируют на протяжении всего фотоцикла. В течение первых 10 мкс после вспышки первый из них частично распадается с появлением других длинноволновых интермедиатов, распад которых с τ ~ 84 мс завершает фотоцикл (рис. 3а).

 

Рис. 3. Фотоцикл MBP-ESR в мицеллах DDM при рН 7 (а) и рН 9 (б).

 

При рН 9 в результате распада интермедиатов K и L, сопровождающегося снижением поглощения при 550 и 590 нм, наблюдается рост поглощения при 410 нм (образование интермедиата М) с характерными временными константами τ ~ 8 и 220 мкс, 2.7 мс. Распад М включает два компонента (11.5 и 386 мс) и приводит к возникновению интермедиата N2/O в результате первой компоненты распада М. Распад интермедиата N2/O c τ ~ 85 и 386 мс завершает фотоцикл и возвращает белок в исходное состояние (рис. 3б). В целом константы указанных преобразований близки к константам, характерным для ESR дикого типа и гибрида CafESR ([37], табл. 1), что указывает на сходные функциональные свойства белков. Небольшое замедление процессов, связанных с медленными стадиями образования и распада интермедиата М (увеличение характерных времен τ2, τ6) может быть обусловлено влиянием крупного растворимого белка-партнера.

 

Таблица 1. Константы фотоцикла (мс) ESR дикого типа и гибридных белков MBP-ESR и Caf-ESR в мицеллах DDM при рН 9.0

Белок	τ1	τ2	τ3	τ4	τ5	τ6
Wt esr*	0.0044 ± 0.0002	0.130 ± 0.008	2.24 ± 0.13	12.10 ± 0.38	82.6 ± 3.6	310 ± 14
Mbp-esr	0.0080 ± 0.0006	0.220 ± 0.018	2.70 ± 0.18	11.50 ± 0.52	85.2 ± 4.5	386 ± 22
Caf-esr*	0.0040 ± 0.0003	0.080 ± 0.010	2.23 ± 0.11	14.20 ± 0.66	60.0 ± 3.9	322 ± 29

* Использованы данные из статьи Petrovskaya et al. [37].

 

Свойства гибридного белка MBP-ESR в составе протеолипосом. Для изучения ориентации гибридного белка MBP-ESR мы получили протеолипосомы на основе азолектина, содержащие данный гибрид, и исследовали их фотоэлектрический ответ и фотоцикл при различных значениях рН. Метод прямой электрометрии основывается на слиянии протеолипосом, содержащих транспортный белок, в данном случае ESR, с искусственной макроскопической мембраной (коллодиевая пленка, пропитанная раствором фосфолипидов в н-декане). В результате переноса протонов под действием света происходит генерация разности потенциалов между ячейками по обе стороны мембраны. Анализ полученных кинетических кривых наряду с результатами изучения фотоцикла позволяет сделать выводы о механизме транспорта протонов через мембрану и об ориентации белка в мембране протеолипосом [51, 52].

Ранее нами было показано, что фотоэлектрический ответ ESR включает микро- и миллисекундные фазы, в основном соответствующие депротонированию основания Шиффа, переносу протона на акцептор Asp85 и его репротонированию от донора Lys96 и высвобождению протона на внеклеточной стороне мембраны [34, 51, 53]. Фотоэлектрический ответ гибридных белков, содержащих ESR на N-конце (ESR-Cherry и ESRTrx), сопровождается существенным уменьшением общей амплитуды ответа, в особенности, электрогенных стадий в миллисекундном временном диапазоне [37] (рис. 4). Полученные данные свидетельствуют о значительной доле неправильно ориентированных молекул ретинального белка в мембране протеолипосом. Напротив, гибридные белки Caf-ESR [37] и MBP-ESR продемонстрировали фотоэлектрический ответ, сопоставимый по амплитуде с ответом ESR дикого типа (рис. 4), что указывает на их гомогенную ориентацию в протеолипосомах. Характерная особенность гибридов Caf-ESR и MBP-ESR – более медленная кинетика микросекундных электрогенных стадий, связанных с образованием интермедиата М. Кроме того, фотоэлектрический ответ MBP-ESR обнаруживает ускоренный спад потенциала в миллисекундной области, предположительно связанный с влиянием крупного растворимого домена. Эти особенности электрогенных реакций гибридного белка требуют более детального кинетического анализа, который будет проведен в последующей работе.

 

Рис. 4. Кинетика образования трансмембранной разницы потенциалов (ΔΨ) протеолипосомами, содержащими ESR дикого типа и гибридные белки, при рН 7.5. Стрелкой отмечен момент лазерной вспышки. Данные для ESR, Caf-ESR, ESR-Cherry и ESR-Trx взяты из статьи Petrovskaya et al. [37].

 

В кинетике светоиндуцированных изменений поглощения гибридного белка MBP-ESR в составе протеолипосом при рН 7.5 образование интермедиата М (увеличение поглощения при 410 нм) не наблюдается (рис. 5а), что также было характерно для других гибридных белков, включающих ESR [37]. При рН 8.5 в течение первых 10 мкс обнаруживается снижение поглощения при 590 нм, что соответствует распаду интермедиатов K и L (рис. 5б). После этого детектируется накопление состояния М (τ ~ 5 и 32 мкс), которое переходит в интермедиат N2/O с характерным временем 2.6 мс. Его распад и возвращение в исходное состояние ESR происходит с константами ~12 и 58 мс. Следует отметить, что протеолипосомы, содержащие ESR дикого типа, демонстрируют выраженное образование интермедиата М при рН 7.5 [50]. Его видимое отсутствие в фотоцикле протеолипосом, содержащих гибридные белки, может быть связано с влиянием растворимых доменов на физико-химические свойства мембранного окружения и, следовательно, на pK_a образования интермедиата М в этих белках [37].

 

Рис. 5. Кинетика светоиндуцированных изменений поглощения при характерных длинах волн протеолипосомами, содержащими MBP-ESR, при рН 7.5 (а) и 8.5 (б).

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали реактивы фирм Merck (США), Panreac (Испания), Sigma (США), нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США), компоненты сред для культивирования бактерий (Amresco, США), наборы для выделения ДНК (Thermo Fisher Scientific, США), органические растворители производства Химмед (Россия). Растворы готовили на деионизированной воде Milli-Q.

Клонирование рекомбинантных ДНК осуществляли стандартными методами в клетках E. coli XL1-Blue (Stratagene, США). Использовали ферменты производства Thermo Fisher Scientific (США). Олигонуклеотиды синтезированы фирмой Евроген (Россия).

Конструирование гибридных генов. Конструирование генов секретируемых гибридных белков mCherry-ESR (с сигнальной последовательностью PelB) и Caf-ESR (с собственной сигнальной последовательностью) подробно описано ранее [37]. Для получения гибридного гена mCherry-ESR, не содержащего сигнальной последовательности, ген ESR амплифицировали из плазмиды pET-ESR [32] с использованием праймеров Bam_ESR и ESR_Xho (табл. 2) и после обработки рестриктазами BamHI и XhoI клонировали в плазмиду pChFn3 [54], обработанную этими же рестриктазами. Плазмиду, кодирующую гибридный белок Trx-ESR, получали клонированием этого же ПЦР-фрагмента в вектор pET32 (Novagen, США). Для объединения с геном Mistic фрагмент плазмиды pET-ESR, полученный обработкой рестриктазами NdeI и XhoI, клонировали в плазмиду pMT32H10 [38]. Ген MBP (с сигнальной последовательностью и без) амплифицировали из клеток E. coli штамма XL1-Blue с использованием праймеров Nde_MBP или Nde_MBP2 соответственно и MBP_Bam (табл. 2), обрабатывали рестриктазами NdeI и BamHI и клонировали в вектор, полученный обработкой ДНК pCaf-ESR [37] этими же рестриктазами. Последовательность вставки в полученных плазмидах подтверждали секвенированием с использованием стандартных праймеров Т7prom и T7term (Евроген, Россия).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров

Название праймера	Последовательность (5'–3')
Bam_ESR	ATAAGGATCCGGTGGAGGTGGCTCTGAAGAAGTCAATTTACTCGTTC
ESR_Xho	ACATCTCGAGGGACGTCAGCGTTTTTCCTT
Nde_MBP	ATTATCATATGAAAATAAAAACAGGTGCACG
Nde_MBP2	ATTATCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGG
MBP_Bam	ATTATGGATCCGCCTCCACCCTTGGTGATACGAGTCTGCG

Примечание: подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции.

 

Выделение мембранной фракции. Культуру штамма E. coli С43(DE3), трансформированную одной из полученных плазмид, выращивали в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до значения OD₅₆₀ 0.5–0.7, индуцировали добавлением 0.2 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG), после чего добавляли 7.5 мкМ all-trans-ретиналь (Sigma, США) и продолжали культивирование в течение 16 ч при 25°С. Клетки осаждали при 7000 g и 5°С в течение 10 мин, затем осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 5 мМ EDTA, 20% сахарозы, лизоцим (0.2 мг/мл), и разрушали ультразвуком. Суспензию центрифугировали 30 мин при 6000 g. Полученный супернатант центрифугировали 1 ч при 100 000 g, осадок мембранной фракции суспендировали в 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0.

Вестерн-блот-анализ. Белки, разделенные гельэлектрофорезом в 13%-ном SDS-ПААГ по методу Лэммли, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США) с помощью прибора для полусухого переноса. После инкубации в растворе 1%-ного BSA в TBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8.0) в течение 1 ч при 37°C мембрану выдерживали 1 ч при комнатной температуре в растворе конъюгата моноклональных антител к His-тагу с пероксидазой (1 мкг/мл; Invitrogen, США) в 1%-ном BSA в TBS. После трехкратной промывки TBS с добавлением 0.1% Tween-20 проводили окрашивание мембраны с использованием преципитирующего 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (Clinical Science Products, США).

Выделение гибридного белка MBP-ESR. Мембраны из клеток E. coli C43(DE3), экспрессирующих MBP-ESR, получали, как описано выше, и солюбилизировали добавлением 1% DDM (Anatrace, США). Рекомбинантные белки очищали на колонке с Ni-сефарозой, как описано ранее [32], затем тщательно отмывали с помощью центрифужных фильтрующих устройств Ultracel YM-30 (Merck Millipore, США) и переводили в комплексный буфер (по 5 мМ цитрата натрия, MES, MOPS и CHES, 100 мМ NaCl, рН 7.4), содержащий 0.05% DDM.

Исследование спектральных и фотоэлектрических характеристик MBP-ESR. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре UV1700 (Shimadzu, Япония). Кинетику светоиндуцированных изменений поглощения измеряли, как описано ранее [35]. При 410 нм регистрировали изменения поглощения, вызванные образованием и распадом М-интермедиата; при 590 нм ‒ изменения поглощения вследствие образования и распада N- и O-интермедиатoв; при 550 нм ‒ вследствие возвращения в исходное состояние, а также образования и распада K-, M- и N-интермедиатов; при 510 нм – изменения, отражающие в основном превращения L-интермедиата. Для активации фотоцикла использовали вторую гармонику Nd-YAG-лазера (532 нм, 7 нс, 10 мДж).

Встраивание в протеолипосомы на основе азолектина, измерения фотоиндуцированных изменений поглощения в суспензии липосом и фотоэлектрические измерения прямым электрометрическим методом протеолипосом, адсорбированных на армированной коллодиевой пленкой макроскопической фосфолипидной мембране, проводили, как описано ранее [36, 53, 55]. Использовали сконструированную для измерений прямым электрометрическим методом установку с временным разрешением до 100 нс в сочетании с импульсным Nd-YAG-лазером (532 нм, 12 нс, 40 МДж). Кинетику образования ΔΨ на макроскопической мембране в ответ на лазерную вспышку, пропорционального генерируемого ESR ΔΨ на мембране протеолипосом, измеряли электродами Ag/AgCl, расположенными по разные стороны макроскопической мембраны.

Данные оптических измерений с временным разрешением были сведены к сумме отдельных компонент с использованием программного обеспечения Mathematica (Wolfram, США), Origin (OriginLab Corporation, США) и MATLAB (The Mathworks, США).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Структурно-функциональные исследования мембранных белков требуют разработки эффективных методов их продукции в гетерологичных системах, позволяющих нарабатывать миллиграммовые количества препаратов в правильно свернутом, функционально активном состоянии. Конструирование гибридных белков способствует успешному решению этих задач, а также обеспечивает условия для гомогенного встраивания в мембрану, что может иметь решающее значение для корректной оценки функциональной активности целевых биомолекул.

В результате анализа экспрессии полученных в данной работе гибридных белковых конструкций, содержащих протеородопсин ESR и различные белки-партнеры, установлено, что высокий уровень синтеза в клетках бактерий достигается только при использовании в качестве N-концевых партнеров природных секретируемых белков, включающих собственный сигнальный пептид (Caf-ESR и MBP-ESR). Изучение свойств выделенных гибридных белков в составе мицелл и протеолипосом показало, что они демонстрируют спектрально-временные параметры фотоцикла и кинетику генерации мембранного потенциала, характерные в общих чертах для исходного белка ESR.

Полученные конструкции могут быть использованы для создания систем бактериальной экспрессии различных мембранных белков в составе гибридов, обеспечивающих их единообразное встраивание в протеолипосомы.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2020-795, уникальный идентификатор проекта RF-190220X0027).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Л. Е. Петровская

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; Московский физико-технический институт

Автор, ответственный за переписку.
Email: lpetr65@yahoo.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 141701 Долгопрудный, Институтский пер., 9

Е. А. Крюкова

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: lpetr65@yahoo.com
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 119334 Москва, ул. Косыгина, 4

В. А. Большаков

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

биологический факультет

Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/11

Е. П. Лукашев

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

биологический факультет

Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1/11

С. А. Силецкий

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Россия, 119992 Москва, Ленинские горы, 1/40

М. Д. Мамедов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Россия, 119992 Москва, Ленинские горы, 1/40

Р. В. Судаков

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Россия, 119992 Москва, Ленинские горы, 1/40

Д. А. Долгих

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 119334 Москва, ул. Косыгина, 4; 119991 Москва, Ленинские горы, 1/11

М. П. Кирпичников

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lpetr65@yahoo.com

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 119991 Москва, Ленинские горы, 1/11

Список литературы

Дополнительные файлы