Effect of Phlorethol from the Brown Alga Costaria costata (Turn.) Saund. (Order Laminariales) on Gametes and Embryogenesis of the Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius (A. Agassiz, 1864)

Full Text

Бурые водоросли синтезируют полифенольные соединения, которые проявляют широкий спектр биологической активности и действуют в малых концентрациях (Имбс, Звягинцева, 2018). Флоротаннины – основные полифенольные соединения бурых водорослей. Мономерной единицей флоротаннинов является флороглюцин (1,3,5-тригидроксибензол). По типу связи между мономерами флоротаннины можно разделить на четыре класса: фугалолы и флоретолы (эфирная связь), фуколы (фенильная связь), фукофлоретолы (эфирная и фенильная связи), эколы и кармалолы (дибензодиоксиновая связь). Внутри каждого класса связывание мономеров друг с другом может происходить в разных положениях флороглюцинового кольца, что приводит к образованию и структурных, и конформационных изомеров. Показано, что один вид водорослей может продуцировать флоротаннины разной структуры и разной степени полимеризации (Имбс, Звягинцева, 2018).

Ранее показано, что фракция флоретола, выделенная из бурой водоросли Costaria costata (Turn.) Saund (отряд Laminariales), ингибирует действие ферментов морских бактерий, разрушающих фукоидан (Silchenko et al., 2017; Imbs et al., 2018), снижает биосинтез иммунодепрессивного фермента α-N-ацетилгалактозаминидазы в клеточных линиях аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu 80 и меланомы SK-MEL-28, а также необратимо ингибирует эти ферменты, выделенные из культуры клеток, связываясь в их активном центре (Bakunina et al., 2023).

Морские ежи (тип Echinodermata, класс Echinoidea) широко распространены в Мировом океане. Известно около 900 видов этих беспозвоночных. Обитающий у побережья Приморского края морской еж Strongylocentrotus intermedius – один из 20 видов, известных в морях России. Гаметы и эмбрионы морского ежа – это удобная и чувствительная модель для токсикологических, фармакологических и других биологических исследований. Это обусловлено возможностью проведения искусственного оплодотворения и наличием быстрого синхронного развития эмбрионов, которые обладают оптической прозрачностью и хорошей проницаемостью для многих соединений (Бузников, Подмарев, 1975; Анисимов и др., 1995; Киселева и др., 2015; Kobayashi, 1984).

Целью настоящей работы стало изучение влияния полифенольного соединения флоретола бурой водоросли C. costata на гаметы и эмбриогенез морского ежа S. intermedius.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

В эксперименте использовали фракцию полифенольных соединений, выделенную ранее (Imbs et al., 2018) из водно-этанольного экстракта бурой водоросли Costaria costata, собранной в б. Троицы, зал. Петра Великого Японского моря. Фракция полифенолов была очищена с использованием жидкостной экстракции органическими растворителями и хроматографией на носителях: силикагель 100, полихром 1 и силикагель С-18, и охарактеризована методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения как флоретол (CcPh) с молекулярной массой 1490–3102 Dа.

Биологические эксперименты проводили на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН (Хасанский район, Приморский край, Россия). Морских ежей собирали в сентябре-октябре в б. Троицы, зал. Петра Великого Японского моря.

Выделение половых продуктов и оплодотворение морского ежа

Нерест особей морского ежа Strongylocentrotus intermedius провоцировали механическим встряхиванием. Сперму и яйцеклетки собирали в разные емкости с фильтрованной морской водой. Яйцеклетки пропускали через мельничный газ (размер ячеи 100×100 мкм) и дважды промывали морской водой. Оплодотворение проводили в соответствии с известными методиками (Бузников, Подмарев, 1975; Киселева и др., 2015, 2021) с некоторыми модификациями. В экспериментах использовали яйцеклетки со степенью оплодотворения не менее 98%. Время от получения яйцеклеток до их оплодотворения не превышало 1 ч. Все опыты проводили одновременно в 12-луночных планшетах компании ООО “БиолоТ” (Россия) при температуре 20.0±0.5°C на одних и тех же партиях эмбрионов в каждом эксперименте, используя стандартный протокол OCC-биотеста (Диннел, 1995; Lera et al., 2006).

Влияние флоретола на эмбриогенез морского ежа

Для изучения эмбриотоксической активности флоретола использовали оплодотворенные яйцеклетки (зиготы) морского ежа S. intermedius. Флоретол добавляли в инкубационную смесь через 3–5 мин после оплодотворения яйцеклеток. Инкубационная смесь содержала: 0.1 мл флоретола и 0.9 мл суспензии оплодотворенных яйцеклеток (2.5×10³/мл) в морской воде. Конечная концентрация флоретола в инкубационной смеси составляла 10, 50, 100, 500 и 700 мкг/мл. В качестве контроля использовали эмбрионы в морской воде, которые инкубировали в течение 84 ч до стадий среднего плутеуса 1 и 2 (стадии 25 и 26 – здесь и далее в скобках курсивом обозначены стадии развития по: Бузников, Подмарев, 1975). В инкубационной смеси с разной концентрацией флоретола эмбрионы выдерживали до их гибели. За влиянием флоретола на развивающиеся эмбрионы наблюдали в микроскоп “Motic AE 21” (КНР) и визуально определяли основные признаки и стадии (Бузников, Подмарев, 1975). Стандартными критериями для положительной оценки действия флоретола были синхронность деления бластомеров, нормальное функционирование и жизнеспособность эмбрионов. При этом регистрировали такие нарушения, как лизис бластомеров, аномалии и отставание в развитии эмбрионов (Kobayashi, 1984; Kobayashi, Okamura, 2002), а также определяли интервал концентраций, вызывающий гибель 50% эмбрионов (ИК₅₀). Жизнеспособность эмбрионов оценивали как отношение времени их жизни под действием разных концентраций флоретола (ч) ко времени жизни в контрольном эксперименте (ч). Эксперименты действия флоретола в разных концентрациях выполняли одновременно, в одинаковых условиях с использованием одной партии эмбрионов в каждом из 3–5 параллельных опытов с тремя повторами для каждой концентрации вещества.

Влияние флоретола на гаметы морского ежа

Для определения способности гамет морского ежа к оплодотворению после действия на них флоретолом CcPh сперматозоиды (1.5×10⁷/мл) или зрелые яйцеклетки (2.5×10³ мл) выдерживали в фильтрованной морской воде в течение 30 мин с разными концентрациями CcPh (0.5–15.0 мкг/мл). Затем к 0.9 мл суспензии спермиев с флоретолом добавляли 0.1 мл интактных яйцеклеток (2.5×10⁴/мл), к 0.9 мл суспензии неоплодотворенных яйцеклеток с флоретолом добавляли 0.1 мл спермиев (1.5×10⁸/мл). Обе суспензии инкубировали 30 мин. В каждом варианте эксперимента количество оплодотворенных яйцеклеток считали с помощью инвертированного микроскопа “Motic AE 21” (КНР) в камере Горяева в пяти полях зрения, затем определяли долю оплодотворенных яйцеклеток от их общего числа. Концентрацию соединений, при которой наблюдали 50% (ИК₅₀) и 100% (ИК₁₀₀) ингибирование оплодотворения, определяли из графика зависимости доли оплодотворенных яйцеклеток от концентрации CcPh. В работе представлены результаты, полученные из трех независимых экспериментов с тремя повторами для каждой концентрации флоретола (Киселева и др., 2015).

Достоверность результатов оценивали с помощью статистических программ дисперсионного анализа ANOVA к необработанным данным в пакете прикладных программ Origin 8.1 (“OriginLab”, США). Уровень значимости в каждом случае составлял p ≤0.05; медианные эффективные концентрации (ИК₅₀) со стандартным отклонением рассчитывали путем аппроксимации кривых “доз-зависимости” по методу нелинейной регрессии в том же пакете программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цито- и эмбриотоксическое действие флоретола

Согласно результатам экспериментов (табл. 1), на ранних стадиях развития (от зиготы до стадии 16 бластомеров) флоретол CcPh во всех испытанных концентрациях не оказывал цитотоксического действия. Присутствие в инкубационной среде CcPh в концентрациях 10–100 мкг/мл не влияло на развитие эмбрионов в течение 8 ч, до стадии ранней бластулы (стадии 8–9) (табл. 1). Увеличение концентрации CcPh до 500 мкг/мл уже через 2 ч инкубации вызывало асинхронное деление бластомеров, через 8 ч возникали аномалии, а перед вылуплением, на стадии ранней бластулы, наблюдалась 50% гибель эмбрионов. Эмбриотоксическое действие флоретола в концентрациях 10–100 мкг/мл появлялось только через 24 ч инкубации, на стадии бластулы, когда в зависимости от концентрации отмечалось заметное отставание в развитии и гибель 30–50% эмбрионов (табл. 1). Оставшиеся в живых эмбрионы после инкубации с флоретолом в концентрациях ≥100 мкг/мл, дальше не развивались и через 36 ч инкубации погибали, оставаясь на стадии бластулы. В контроле эмбрионы через 36 ч инкубации достигали стадии раннего плутеуса (стадии 22–24) (табл. 1). Через 48 ч инкубации при концентрации флоретола 50 мкг/мл наблюдали заметное отставание в развитии (стадия 15), появление множества аномалий и 50% гибель эмбрионов. Изменение времени жизни развивающихся эмбрионов морского ежа в зависимости от исследуемых концентраций флоретола по сравнению с контролем представлено на рис. 1. Продолжительность жизни эмбрионов в контроле, которую принимали за 100%, составила 84 ч (табл. 1, рис. 1).

 

Таблица 1. Влияние флоретола бурой водоросли Costaria costata (CcPh) на развивающиеся эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedius

Доза CcPh, мкг/мл	Время инкубации после оплодотворения, ч
	2.0	8.0	12.0	24.0	36.0	48.0	84.0
Стадии развития
00, контроль	3–4	9	10 < 11, вылупление	15–16	22–24	23–24	25–26
10	3–4	8–9	10 < 11	15–16, Г 30%	22–24, Г 30%	22–24, ан., Г 30%	Г
50	3–4	8–9	9–10	9–10, Г 30%	10–12, ан., Г 30%	15, ан., Г 50%, Л 10%	Г
100	3–4	8–9	9–10	9–10, Г 50%	Г, Л	–	–
500–700*	1–4	1–9, ан.	8–9, ан., Г 50%	9–10, ан., Г 50%	Г, Л	–	–

*В этом диапазоне концентраций результаты влияния флоретола были одинаковыми.

Примечание. Действие флоретола в концентрации выше 700 мкг/мл не исследовали. Контроль – развитие эмбрионов в морской воде. Стадии развития: 1 и 2 – появляется оболочка оплодотворения; 3 и 4 – 2 и 4 бластомера соответственно; 5, 6 и 7 – 8, 16 и 32 бластомера соответственно; 8 и 9 – ранняя бластула 1 и 2 соответственно; 10 и 11 – средняя бластула 1 и 2 (вылупление) соответственно; 12 и 13 – поздняя бластула 1 и 2 соответственно; 14 и 15 – ранняя гаструла 1 и 2 соответственно; 16 – средняя гаструла 1; 22, 23 и 24 – ранний плутеус 1, 2 и 3 соответственно; 25 и 26 – средний плутеус 1 и 2 соответственно (по: Бузников, Подмарев, 1975); плотность клеток в инкубационной среде 2500 кл/мл. Условные обозначения: Г – гибель эмбрионов; Л – лизис эмбрионов; ан. – аномальное развитие эмбрионов; “–“ – эксперимент завершен, все эмбрионы погибли. В таблице приведены данные трех экспериментов, доверительный интервал р ≤0.05.

 

Рис. 1. Влияние разных концентраций флоретола бурой водоросли Costaria costata на жизнеспособность эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius: средние значения времени жизни эмбрионов ± среднеквадратичная ошибка (вертикальные линии) при доверительной вероятности p ≤0.05.

 

В течение эксперимента установлено, что эмбриотоксическое действие флоретола в зависимости от его концентрации проявлялось в разное время, при этом концентрация флоретола, снижающая продолжительность жизни эмбрионов на 50% (ИК₅₀) была 50 < I ≤ 100 мкг/мл (рис. 1). Присутствие в инкубационной среде флоретола в концентрации 50 мкг/мл также приводило к появлению аномальных эмбрионов и гибели, но на стадии гаструлы, после 36–48 ч инкубации. В контроле за это время эмбрионы достигли стадии плутеуса. Самая низкая из испытанных концентраций флоретола – 10 мкг/мл не оказывала влияния на стадии развития, но вызывала гибель 30% эмбрионов через 24 ч инкубации и более раннюю гибель всех эмбрионов по сравнению с контролем (табл. 1, рис. 1).

Влияние флоретола на гаметы морского ежа

На основе экспериментов по влиянию флоретола на гаметы морского ежа построены графики эффективности оплодотворения S. intermedius в (рис. 2) зависимости от концентрации флоретола при действии на сперматозоиды (1) и яйцеклетки (2). Анализ сигмоидальных кривых с помощью уравнения Хилла позволил определить значения констант ингибирования оплодотворения (ИК₅₀), которые после действия флоретола на спермии оказались в 3 раза ниже, чем после действия этого вещества на яйцеклетки, и составили 1.28±0.38 и 3.83±0.82 мкг/мл соответственно. Минимально эффективные дозы CcPh, вызывающие 100% ингибирование оплодотворения (ИК₁₀₀), при действии на спермии составили 7.8±0.2 мкг/мл, а на яйцеклетки – 12.7±0.2 мкг/мл (рис. 2).

 

Рис. 2. Эффективность оплодотворения морского ежа Strongylocentrotus intermedius в зависимости от концентраций флоретола бурой водоросли Costaria costata, использованных при обработке сперматозоидов (1) и яйцеклеток (2).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрического анализа флоротаннины бурой водоросли Costaria costata представляют собой высокомолекулярную фракцию флоретолов (CcPh) со степенью полимеризации (СП), равной 11–25 единиц флороглюцина. Ранее было показано, что CcPh ингибировал действие фукоидан-гидролаз морских организмов (Imbs et al., 2018); в нетоксичных концентрациях ингибировал образование колоний в клетках рака толстой кишки человека HCT 116 и HT-29 и значительно повышал их чувствительность к низкотоксичному рентгеновскому облучению (Malyarenko et al., 2020).

Цитотоксические и ингибирующие свойства фракции CcPh исследованы на гаметах и развивающихся эмбрионах морского ежа Strongylocentrotus intermedius. В отличие от низкомолекулярной фракции фукофлоретола FePh (СП = 3) из бурой водоросли Fucus evanescens, которая в концентрациях ≥50 мкг/мл проявляла ярко выраженное цитотоксическое действие на ранних стадиях, ингибируя деление яйцеклеток (Kиселева и др., 2021), флоретол CcPh, добавленный на стадии зиготы, во всех исследованных концентрациях не оказывал цитотоксического действия на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа. На развитие эмбрионов CcPh в концентрациях 10–100 мкг/мл, добавленный к оплодотворенным яйцеклеткам, не влиял в течение 8 ч инкубации, до стадии ранней бластулы (стадии 8–9). Его действие проявлялось только на стадии бластулы, через 24 ч инкубации. Эмбриотоксическое действие флоретола CcPh развивалось постепенно, в течение всего инкубационного периода, вызывая отставание в развитии, аномалии и гибель эмбрионов. Это отличает флоретол от обладающих ярко выраженным цитотоксическим действием тритерпеновых и стероидных гликозидов, которые блокировали дробление и вызывали лизис зигот (Анисимов и др., 1995; Прокофьева и др., 2002; Prokof’eva et al., 2003).

Эмбриотоксическое действие флоретола CcPh зависело от концентрации и времени инкубации оплодотворенных яйцеклеток, чем выше была концентрация вещества, тем раньше наступала гибель эмбрионов. В концентрациях ≤100 мкг/мл действие CcPh проявлялось только через 36 ч инкубации, после вылупления эмбрионов на стадии бластулы. В контроле за это время эмбрионы развивались до стадии среднего плутеуса (табл. 1). Подобным образом влияли на эмбриогенез такие фенольные соединения, как эхинохром – пигмент морского ежа Echinothrix diadema и производные нафтазарина (Похило и др., 2008, 2011; Pokhilo et al., 2015).

Было исследовано действие флоретола CcPh на гаметы морского ежа и их способность к оплодотворению. Известно, что яйцеклетки морского ежа не чувствительны к большинству токсинов (Диннел, 1995). Флоретол CcPh, как и ранее изученный фукофлоретол FePh (Киселева и др., 2021), подавлял способность гамет морского ежа к оплодотворению, при этом спермии были более чувствительны, чем яйцеклетки. ИК₅₀ CcPh после обработки спермиев составила 1.28±0.38 мкг/мл, а после действия на яйцеклетки в три раза больше – 3.83±0.82 мкг/мл (рис. 2). Следует отметить, что ИК₅₀ CcPh при воздействии на гаметы морского ежа была значительно ниже, чем его концентрации, влияющие на жизнеспособность эмбрионов (50 < I ≤ 100 мкг/мл).

Таким образом, флоретол из C. costata не только эффективно подавляет ферменты из раковых клеток, но и ингибирует оплодотворение яйцеклеток морского ежа, демонстрируя при этом низкое цитотоксическое действие. Соединение, блокирующее взаимодействие сперматозоидов и яйцеклеток в дозах, которые намного ниже цитотоксических, возможно, имеет потенциал практического применения в составе новых контрацептивных препаратов для млекопитающих и человека.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с морским ежом проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

M. I. Kiseleva

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: mikiseleva@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-5816-5500
Russian Federation, Vladivostok, 690022

T. I. Imbs

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: mikiseleva@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

I. Y. Bakunina

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: mikiseleva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4039-5927
Russian Federation, Vladivostok, 690022

References

Supplementary files