Determination of the content of FAD cofactor and NAD(P)H-oxidase complexes in mouse splenocytes and Lewis carcinoma cells under conditions of apoptosis by confocal microscopy method

E. M. Mil; Миль Е. М.; A. A. Albantova; Албантова А. А.; L. I. Matienko; Матиенко Л. И.; A. N. Goloshchapov; Голощапов А. Н.; M. A. Korovin; Коровин М. А.; V. V. Kuvyrkova; Кувыркова В. В.

doi:10.31857/S0207401X24110061

Determination of the content of FAD cofactor and NAD(P)H-oxidase complexes in mouse splenocytes and Lewis carcinoma cells under conditions of apoptosis by confocal microscopy method

Авторлар: Mil E.M.¹, Albantova A.A.¹, Matienko L.I.¹, Goloshchapov A.N.¹, Korovin M.A.¹, Kuvyrkova V.V.¹
Мекемелер:
1. Emanuel Institute of Biochemical Physics Russian Academy of Sciences
Шығарылым: Том 43, № 11 (2024)
Беттер: 47-53
Бөлім: Chemical physics of biological processes
URL: https://journal-vniispk.ru/0207-401X/article/view/281873
DOI: https://doi.org/10.31857/S0207401X24110061
ID: 281873

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация
Толық мәтін
Авторлар туралы
Әдебиет тізімі
Қосымша файлдар
Статистика

Аннотация

In this work, using fluorescence and confocal microscopy, we studied the content of the cofactor FAD and enzymatic NAD(P)H-oxidase complexes (with fluorophores AnnexinV-FITC, 7-AAD (7-aminoactinomycin D), EtBr) under conditions of apoptosis caused by sodium anphene with hydrogen peroxide in healthy mouse splenocytes and Lewis carcinoma tumor cells. The use of fluorescence microscopy allows observing and quantifying the apoptotic effect of sodium anphen and hydrogen peroxide, and visualization of metabolic changes in the cell, including increased fluorescence of FAD in tumor cells and NAD(P)H-oxidase complexes in splenocytes. The data obtained indicate the possibility of using sodium anphen in combination with hydrogen peroxide as an antitumor drug acting on certain types of cells.

Негізгі сөздер

sodium anphen, Lewis Carcinoma cells, NAD(P)H, FAD

Толық мәтін

1. ВВЕДЕНИЕ

Одной из основных окислительно-восстановительных пар в клетке является пара кофакторов, FAD и NAD(P)H, между которыми постоянно осуществляется обмен электронами в NAD(P)H-оксидазном комплексе. Никотинамидадениндинуклеотид (NAD(P)H) – эндогенный тканевый флуорофор, который поглощает свет в области длины волны λ = 330 нм, а флавинадениннуклеотид – (FAD) в области λ= 450 нм. Поскольку они участвуют во многих клеточных процессах, таких как клеточный метаболизм, работа дыхательной цепи митохондрий, появляется возможность использовать их в качестве маркеров клеточного метаболизма в процессах, происходящих в клетке.

Комплекс NAD(P)H способен флуоресцировать только в восстановленной форме, а флавиновые нуклеотиды и FAD – только в окисленной [1]. Кроме того, NAD(P)H-оксидазный комплекс с белками присутствует практически во всех клетках на поверхности мембраны и имеет обозначение NOX (1–7).

В данный момент хорошо разработанным методом исследования является лазерно-индуцированная флуоресцентная спектроскопия, которая активно используется в диагностике тканевой гипоксии [1]. Важные особенности методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии – наблюдение и исследование живых клеток при развитии апоптоза. Это дает возможность получать дополнительную информацию о протекании метаболических процессов по сравнению с методами атомно-силовой микроскопии [2, 3] и электронной микроскопии [4, 5].

Комплексы NAD(P)H-оксидазы семейства NOX на данный момент являются единственной группой ферментов, у которых главная функция – это выработка активных форм кислорода (АФК). Они представляют собой связанные мембраной ферменты, способные выполнять перенос электрона от NAD(P)H на молекулярный кислород, образуя при этом супероксид [6]. При этом все NAD(P)H-оксидазы семейства NOX представляют собой интегральные белки мембран, которые содержат шесть трансмембранных спиралей и пять петель, локализованных в водной фазе. В активном центре NAD(P)H-оксидазы на C-концевом участке цепи находится редокс-пара кофакторов FAD и NAD(P)H, близко расположенных друг к другу (расстояние между ними составляет 7.8 Å.

Цель настоящего исследования – оценка содержания клеток с кофактором FAD методом флуоресцентной микроскопии и клеток с NADPH-оксидазными комлексами методом конфокальной микроскопии при воздействии анфена натрия (ANa) в сочетании с пероксидом водорода при развитии апоптоза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методическая часть

В работе в качестве антиоксиданта использовали ANa, (2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3′,5′-ди-трет-бутил-4′-гидроксифенил)-пропионат натрия) – один из антиоксидантных препаратов [7–9], некоторые из которых были синтезированы в Институте химической физики и нашли применение в практике. Препарат растворяли в физиологическом растворе и вводили в суспензию клеток в концентрации 10^-4М. В исследовании были использованы белые беспородные мыши, а также мыши-гибриды первого поколения F1 (C57BL/6 × DBA/2), (возраст 3–4 мес., масса 22–25 г) из питомника “Столбовая”, у которых из селезенки выделяли спленоциты. Мышей умертвляли методом декапитации под эфирным наркозом.

Клетки карциномы Льюис мышей выделяли из опухоли на 14-е сутки после трансплантации опухолевых клеток (по методике, изложенной в работе [10]). Для получения суспензии клеток, в том числе клеток опухоли и селезенки спленоцитов, готовили согласно методике из работы [11], измельчали в физиологическом растворе, диспергировали многократно и фильтровали через нейлоновую (100 мкм) сетку. Взвесь клеток осаждали при 150g и ресуспендировали осадок для получения суспензии клеток. Затем вводили реципиентам в объеме 0.2 мл в мышцу бедра задней лапы (7 ∙ 10⁶клеток/мышь), либо использовали в экспериментах in vitro. Число клеток определяли в камере Горяева. Клетки в присутствии исследуемых соединений инкубировали в течение 2 ч при 37 °С в среде 199 в растворе Хенкса (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАН) для различных условий: в контрольных образцах, при совместном введении анфена натрия (10^-4М) и пероксида водорода (5 мкМ), а также при последовательном введении пероксида водорода (5 мкМ) и анфена натрия (10^-4М).

Микрофотографии клеток карциномы Льюис получали с помощью метода флуоресцентной микроскопии (объективы с увеличением 40х и 100х) при возбуждении на длине волны λ = 450 с фильтром λ = 530 нм, отсекающим возбуждающий свет. В работе использовали микроскоп, производства компании Carl Zeiss (Germany), Jena, оснащенный системой оптического возбуждения на диодных лазерах и фильтрации, после чего происходила фиксация на камеру (HDCCD). Основным используемым флуорофором является Annexin V-FITC, способный связываться с фосфадитилсерином в апоптотической клетке, создавая при этом зеленое свечение. Известно, что NAD(P)H-оксидазный комплекс содержит в структуре NOX(1–7) и FAD, и находится на внешней стороне мембраны клетки. Благодаря данному явлению количество клеток, подвергнувшихся запрограммированной гибели, определяли на конфокальном микроскопе как отношение окрашенных флуорофором Annexin V-FITC клеток к их общему числу на микрофотографии.

Конфокальные изображения были получены с использованием микроскопа Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Jena, Germany), оснащенного конфокальным устройством модели CSU-X1 (производства Yokogawa Corporation of America). Расчеты проводились с помощью программы ImageJ. Обнаружено, что в контрольных образцах число нежизнеспособных, мертвых клеток (определяемое по образованию комплекcа EtBr с ДНК, красное свечение) составляло около 2–3%. Число клеток с апоптозом (определяемое по флуоресценции Annexin AV–FITC, зеленое свечение) в суспензии спленоцитов составило 1–4%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее методом Western Blotting было установлено, что ANa вызывает апоптоз клеток карциномы Льюис и прекращает размножение клеток при трансплантации опухоли. Усиление апоптоза наблюдалось при совместном действии {ANa + + H₂O₂} [12]. В качестве удобной модели здоровых клеток использовали спленоциты мышей.

При регистрации спленоцитов с использованием флуоресцентного микроскопа (описание см. выше) наблюдались яркие структуры, обладающие автофлуоресценцией (рис. 1). Они присутствовали в контрольных образцах и при апоптозе. Их число центров варьировало от 1–2 до 8–10 в разных клетках. Количество клеток с автофлуоресценцией увеличивалось с развитием апоптоза, вызванном действием анфена натрия и пероксида водорода. Ряд клеток (менее 1%) имели увеличенные размеры и размытые флуоресцирующие объекты, возможно, липофусциновые образования. Это точечное свечение, наблюдаемое в зеленой области, как показано в работах [13, 14], обусловлено в основном кофактором FAD в окисленном состоянии. Он присутствует в том числе в NAD(P)H-оксидазном комплексе. В работах [13, 14] также показано, что кофактор FAD участвует в ряде других окислительно-восстановительных систем, например в митохондриях и связан с флавопротеинами, но его флуоресценция в этих комплексах тушится белками электрон-транспортной цепи.

Рис. 1. Флуоресценция FAD в спленоцитах мышей: единичное (слева) и множественное свечение (справа) в клетках при апоптозе.

С другой стороны, при апоптозе спленоцитов, наряду со свечением мембраны в условиях добавления Annexin АV-FITC в конфокальном микроскопе на внешней стороне мембраны видны округлые гранулы (рис. 2). Эти гранулы подобны структурам, описанным для многих других клеток [10, 13–15], в частности для нейтрофилов. Наблюдаемые объекты можно отнести к сложным NAD(P)H-оксидазным ферментативным комплексам, называемым NOX(1–7), которые содержатся практически во всех клетках млекопитающих. Основная функция NOX состоит в образовании супероксид-аниона или пероксида водорода. При этом происходит перенос электрона с внутриклеточного NAD(P)H на внеклеточный кислород. Эта система используется клеткой для защиты от бактериального и микробного заражений [14]. Недавно было обнаружено, что комплексы NAD(P)H-оксидазы играют важную роль в ряде патологий, таких как болезнь Альцгеймера и нейродегенеративные заболевания [15, 16]. Оказалось, что экспрессия NOX связана также с канцерогенезом. Например, экспрессия NOX в желудочно-кишечном тракте повышается в аденомах и высоко дифференцированных аденокарциномах [17].

Рис. 2. Микрофотографии спленоцитов при апоптозе, вызванном действием анфена натрия (10^-4М), и увеличенное в 6 раз изображение клетки (на мембране видны гранулы NAD(P)H-оксидазных ферментных комплексов NOX). Конфокальный микроскоп с увеличением 100х (флуорофор – Annexin V-FITC).

В настоящей работе было определено число апоптотических клеток, а также число нежизнеспособных клеток при апоптозе спленоцитов, вызванном препаратами. Из рис. 3 видно, что при введении антиоксиданта ANa вместе с пероксидом водорода увеличивается число апоптозных клеток в спленоцитах мышей. Содержание нежизнеспособных клеток остается на невысоком уровне. Это означает, что клетки находятся на начальной стадии апоптоза, и апоптоз в спленоцитах составляет 15% от общего количества клеток. В этих же условиях апоптоз может составлять более 70% в опухолевых клетках (см. табл. 1).

Рис. 3. Диаграмма содержания апоптозных клеток в культуре спленоцитов (флуорофор – AnnexinV-FITC) – 1, количество нежизнеспособных клеток (флуорофор EtBr) – 2. Изменение содержания клеток под действием пероксида водорода (5 мкМ), анфена натрия (10^-4М), и при их совместном воздействии.

Таблица 1. Процентное содержание апоптотических клеток и клеток с FAD в спленоцитах здоровых животных и опухолевых клеток мышей с карциномой Льюис

Образцы	Клетки в апоптозе, %		Клетки с FAD, %
Образцы	норма	опухоль	норма	опухоль
Контрольный	8	14.8	17	65
Анфен Na	10	31.7	25	60
Анфен Na+H₂O₂	15	73.5	29	73

Далее было определено процентное содержание клеток с NAD(P)H-оксидазным комплексом и сопоставлено с содержанием клеток с флуоресценцией FAD. На рис. 4 можно видеть корреляцию между исследуемыми объектами. Это означает, что FAD действительно является частью NAD(P)H-оксидазного комплекса.

Рис. 4. Процент клеток с флуоресценцией FAD – 1 и иммунофлуоресцией гранул NAD(P)H-оксидазных комплексов – 2 в культуре спленоцитов под действием пероксида водорода (5 мкМ), анфена натрия (10^-4М) и при их совместном воздействии.

Как видно из табл. 1, содержание FAD и число апоптотических клеток при апоптозе, вызванном ANa и {ANa + H₂O₂} в несколько раз больше, чем в спленоцитах здоровых мышей. То есть окислительно-восстановительная функция комплекса NADPH увеличивается. В то же время ANa в сочетании с H₂O₂ может рассматриваться в качестве потенциального противоопухолевого препарата, вызывающего быстрый апоптоз ( >70%) опухолевых клеток. Ранее было показано, что ANa снижает антиапоптотические белки семейства Bcl-2, воздействуя на митохондриальные пути апоптоза клеток.

В суспензии спленоцитов мышей были обнаружены нейтрофилы, которые находились в стадии нетоза (net – сеть), т.е. связаны с выбросом NAD(P)H-оксидазного комплекса (рис. 5), совместно с обволакиванием микроорганизмов и бактерий сетью ДНК. При этом бактерии, как известно, разрушаются с помощью супероксида или пероксида водорода.

Рис. 5. Микрофотографии нейтрофила в культуре спленоцитов, который находится в стадии нетоза – выброса сети ДНК, окруженной NAD(P)H-оксидазными комплексами – (флуорофор – AnnexinV-FITC(а) и 7AAD (б)). Конфокальный микроскоп с увеличением 100x.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод флуоресценции в клетках спленоцитов позволил проследить за развитием апоптоза и оценить изменение числа флуоресцирующих клеток с кофактором FAD и клеток с ферментными NAD(P)H-оксидазными комплексами под действием анфена Na и пероксида водорода. Следует отметить, что в клетках мышей с карциномой Льюис было обнаружено многократное увеличение автофлуоресценции FAD как в контрольных образцах, так и при усилении апопоза, что может быть характерным для животных опухоленосителей. Ранее в работе [18] было показано, что соотношение эндогенных кофакторов FAD и NAD(P)H может рассматриваться в качестве метаболитической характеристики раковых заболеваний, а также позволяет оценить воздействие противоопухолевых препаратов. Мы предполагаем, что сложный NAD(P)H-оксидазный комплекс NOX [19–21], может менять локализацию при развитии апоптоза. Так, при начальной стадии апоптоза в ряде клеток наблюдается ровная граница мембраны спленоцита, а при воздействии анфена натрия и пероксида водорода число апоптотических клеток, содержащих гранулы NOX, возрастает. Возможно, что следом за экспозицией фосфадитилсерина, происходит экспозиция NAD(P)H-оксидазного комплекса, вследствие чего наблюдаются выступающие на поверхность мембраны гранулы, окрашенные зеленым цветом (флуорофор Annexin V-FITC).

Наше исследование выполнено по теме, утвержденной Минобрнауки и высшего образования Российской Федерации (minobrnauki.gov.ru), 44.4. “Комплексное изучение механизмов и эффектов действия природных и синтетических антиоксидантов, противоопухолевых препаратов (химические и физических факторы). Изучение биологических механизмов старения”.