Determination of the content of FAD cofactor and NAD(P)H-oxidase complexes in mouse splenocytes and Lewis carcinoma cells under conditions of apoptosis by confocal microscopy method

E. M. Mil; Миль Е. М.; A. A. Albantova; Албантова А. А.; L. I. Matienko; Матиенко Л. И.; A. N. Goloshchapov; Голощапов А. Н.; M. A. Korovin; Коровин М. А.; V. V. Kuvyrkova; Кувыркова В. В.

doi:10.31857/S0207401X24110061

Определение содержания кофактора FAD и NAD(P)H-оксидазных комплексов в спленоцитах мышей и клетках карциномы Льюис при апоптозе методом конфокальной микроскопии

Авторы: Миль Е.М.¹, Албантова А.А.¹, Матиенко Л.И.¹, Голощапов А.Н.¹, Коровин М.А.¹, Кувыркова В.В.¹
Учреждения:
1. Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Выпуск: Том 43, № 11 (2024)
Страницы: 47-53
Раздел: Химическая физика биологических процессов
URL: https://journal-vniispk.ru/0207-401X/article/view/281873
DOI: https://doi.org/10.31857/S0207401X24110061
ID: 281873

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

В настоящей работе исследовано содержание кофактора FAD и ферментных NAD(P)H-оксидазных комплексов методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии (с флуорофорами Annexin V–FITC, 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), EtBr) при апоптозе, вызванном анфеном натрия в сочетании с пероксидом водорода в спленоцитах здоровых мышей и в опухолевых клетках карциномы Льюис. Применение этих методов дает возможность наблюдать и количественно оценить апоптотический эффект анфена натрия и пероксида водорода, а также позволяет визуализировать метаболитические изменения в клетке, усиление флуоросценции FAD в опухолевых клетках и NAD(P)H-оксидазных комплексов в спленоцитах. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения анфена натрия в сочетании с пероксидом водорода в качестве противоопухолевого препарата, действующего на определенные типы клеток.

Ключевые слова

анфен натрия, клетки карциномы Льюис, NAD(P)H-оксидазный комплекс, кофактор FAD

Полный текст

1. ВВЕДЕНИЕ

Одной из основных окислительно-восстановительных пар в клетке является пара кофакторов, FAD и NAD(P)H, между которыми постоянно осуществляется обмен электронами в NAD(P)H-оксидазном комплексе. Никотинамидадениндинуклеотид (NAD(P)H) – эндогенный тканевый флуорофор, который поглощает свет в области длины волны λ = 330 нм, а флавинадениннуклеотид – (FAD) в области λ= 450 нм. Поскольку они участвуют во многих клеточных процессах, таких как клеточный метаболизм, работа дыхательной цепи митохондрий, появляется возможность использовать их в качестве маркеров клеточного метаболизма в процессах, происходящих в клетке.

Комплекс NAD(P)H способен флуоресцировать только в восстановленной форме, а флавиновые нуклеотиды и FAD – только в окисленной [1]. Кроме того, NAD(P)H-оксидазный комплекс с белками присутствует практически во всех клетках на поверхности мембраны и имеет обозначение NOX (1–7).

В данный момент хорошо разработанным методом исследования является лазерно-индуцированная флуоресцентная спектроскопия, которая активно используется в диагностике тканевой гипоксии [1]. Важные особенности методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии – наблюдение и исследование живых клеток при развитии апоптоза. Это дает возможность получать дополнительную информацию о протекании метаболических процессов по сравнению с методами атомно-силовой микроскопии [2, 3] и электронной микроскопии [4, 5].

Комплексы NAD(P)H-оксидазы семейства NOX на данный момент являются единственной группой ферментов, у которых главная функция – это выработка активных форм кислорода (АФК). Они представляют собой связанные мембраной ферменты, способные выполнять перенос электрона от NAD(P)H на молекулярный кислород, образуя при этом супероксид [6]. При этом все NAD(P)H-оксидазы семейства NOX представляют собой интегральные белки мембран, которые содержат шесть трансмембранных спиралей и пять петель, локализованных в водной фазе. В активном центре NAD(P)H-оксидазы на C-концевом участке цепи находится редокс-пара кофакторов FAD и NAD(P)H, близко расположенных друг к другу (расстояние между ними составляет 7.8 Å.

Цель настоящего исследования – оценка содержания клеток с кофактором FAD методом флуоресцентной микроскопии и клеток с NADPH-оксидазными комлексами методом конфокальной микроскопии при воздействии анфена натрия (ANa) в сочетании с пероксидом водорода при развитии апоптоза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методическая часть

В работе в качестве антиоксиданта использовали ANa, (2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3′,5′-ди-трет-бутил-4′-гидроксифенил)-пропионат натрия) – один из антиоксидантных препаратов [7–9], некоторые из которых были синтезированы в Институте химической физики и нашли применение в практике. Препарат растворяли в физиологическом растворе и вводили в суспензию клеток в концентрации 10^-4М. В исследовании были использованы белые беспородные мыши, а также мыши-гибриды первого поколения F1 (C57BL/6 × DBA/2), (возраст 3–4 мес., масса 22–25 г) из питомника “Столбовая”, у которых из селезенки выделяли спленоциты. Мышей умертвляли методом декапитации под эфирным наркозом.

Клетки карциномы Льюис мышей выделяли из опухоли на 14-е сутки после трансплантации опухолевых клеток (по методике, изложенной в работе [10]). Для получения суспензии клеток, в том числе клеток опухоли и селезенки спленоцитов, готовили согласно методике из работы [11], измельчали в физиологическом растворе, диспергировали многократно и фильтровали через нейлоновую (100 мкм) сетку. Взвесь клеток осаждали при 150g и ресуспендировали осадок для получения суспензии клеток. Затем вводили реципиентам в объеме 0.2 мл в мышцу бедра задней лапы (7 ∙ 10⁶клеток/мышь), либо использовали в экспериментах in vitro. Число клеток определяли в камере Горяева. Клетки в присутствии исследуемых соединений инкубировали в течение 2 ч при 37 °С в среде 199 в растворе Хенкса (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАН) для различных условий: в контрольных образцах, при совместном введении анфена натрия (10^-4М) и пероксида водорода (5 мкМ), а также при последовательном введении пероксида водорода (5 мкМ) и анфена натрия (10^-4М).

Микрофотографии клеток карциномы Льюис получали с помощью метода флуоресцентной микроскопии (объективы с увеличением 40х и 100х) при возбуждении на длине волны λ = 450 с фильтром λ = 530 нм, отсекающим возбуждающий свет. В работе использовали микроскоп, производства компании Carl Zeiss (Germany), Jena, оснащенный системой оптического возбуждения на диодных лазерах и фильтрации, после чего происходила фиксация на камеру (HDCCD). Основным используемым флуорофором является Annexin V-FITC, способный связываться с фосфадитилсерином в апоптотической клетке, создавая при этом зеленое свечение. Известно, что NAD(P)H-оксидазный комплекс содержит в структуре NOX(1–7) и FAD, и находится на внешней стороне мембраны клетки. Благодаря данному явлению количество клеток, подвергнувшихся запрограммированной гибели, определяли на конфокальном микроскопе как отношение окрашенных флуорофором Annexin V-FITC клеток к их общему числу на микрофотографии.

Конфокальные изображения были получены с использованием микроскопа Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Jena, Germany), оснащенного конфокальным устройством модели CSU-X1 (производства Yokogawa Corporation of America). Расчеты проводились с помощью программы ImageJ. Обнаружено, что в контрольных образцах число нежизнеспособных, мертвых клеток (определяемое по образованию комплекcа EtBr с ДНК, красное свечение) составляло около 2–3%. Число клеток с апоптозом (определяемое по флуоресценции Annexin AV–FITC, зеленое свечение) в суспензии спленоцитов составило 1–4%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее методом Western Blotting было установлено, что ANa вызывает апоптоз клеток карциномы Льюис и прекращает размножение клеток при трансплантации опухоли. Усиление апоптоза наблюдалось при совместном действии {ANa + + H₂O₂} [12]. В качестве удобной модели здоровых клеток использовали спленоциты мышей.

При регистрации спленоцитов с использованием флуоресцентного микроскопа (описание см. выше) наблюдались яркие структуры, обладающие автофлуоресценцией (рис. 1). Они присутствовали в контрольных образцах и при апоптозе. Их число центров варьировало от 1–2 до 8–10 в разных клетках. Количество клеток с автофлуоресценцией увеличивалось с развитием апоптоза, вызванном действием анфена натрия и пероксида водорода. Ряд клеток (менее 1%) имели увеличенные размеры и размытые флуоресцирующие объекты, возможно, липофусциновые образования. Это точечное свечение, наблюдаемое в зеленой области, как показано в работах [13, 14], обусловлено в основном кофактором FAD в окисленном состоянии. Он присутствует в том числе в NAD(P)H-оксидазном комплексе. В работах [13, 14] также показано, что кофактор FAD участвует в ряде других окислительно-восстановительных систем, например в митохондриях и связан с флавопротеинами, но его флуоресценция в этих комплексах тушится белками электрон-транспортной цепи.

Рис. 1. Флуоресценция FAD в спленоцитах мышей: единичное (слева) и множественное свечение (справа) в клетках при апоптозе.

С другой стороны, при апоптозе спленоцитов, наряду со свечением мембраны в условиях добавления Annexin АV-FITC в конфокальном микроскопе на внешней стороне мембраны видны округлые гранулы (рис. 2). Эти гранулы подобны структурам, описанным для многих других клеток [10, 13–15], в частности для нейтрофилов. Наблюдаемые объекты можно отнести к сложным NAD(P)H-оксидазным ферментативным комплексам, называемым NOX(1–7), которые содержатся практически во всех клетках млекопитающих. Основная функция NOX состоит в образовании супероксид-аниона или пероксида водорода. При этом происходит перенос электрона с внутриклеточного NAD(P)H на внеклеточный кислород. Эта система используется клеткой для защиты от бактериального и микробного заражений [14]. Недавно было обнаружено, что комплексы NAD(P)H-оксидазы играют важную роль в ряде патологий, таких как болезнь Альцгеймера и нейродегенеративные заболевания [15, 16]. Оказалось, что экспрессия NOX связана также с канцерогенезом. Например, экспрессия NOX в желудочно-кишечном тракте повышается в аденомах и высоко дифференцированных аденокарциномах [17].

Рис. 2. Микрофотографии спленоцитов при апоптозе, вызванном действием анфена натрия (10^-4М), и увеличенное в 6 раз изображение клетки (на мембране видны гранулы NAD(P)H-оксидазных ферментных комплексов NOX). Конфокальный микроскоп с увеличением 100х (флуорофор – Annexin V-FITC).

В настоящей работе было определено число апоптотических клеток, а также число нежизнеспособных клеток при апоптозе спленоцитов, вызванном препаратами. Из рис. 3 видно, что при введении антиоксиданта ANa вместе с пероксидом водорода увеличивается число апоптозных клеток в спленоцитах мышей. Содержание нежизнеспособных клеток остается на невысоком уровне. Это означает, что клетки находятся на начальной стадии апоптоза, и апоптоз в спленоцитах составляет 15% от общего количества клеток. В этих же условиях апоптоз может составлять более 70% в опухолевых клетках (см. табл. 1).

Рис. 3. Диаграмма содержания апоптозных клеток в культуре спленоцитов (флуорофор – AnnexinV-FITC) – 1, количество нежизнеспособных клеток (флуорофор EtBr) – 2. Изменение содержания клеток под действием пероксида водорода (5 мкМ), анфена натрия (10^-4М), и при их совместном воздействии.

Таблица 1. Процентное содержание апоптотических клеток и клеток с FAD в спленоцитах здоровых животных и опухолевых клеток мышей с карциномой Льюис

Образцы	Клетки в апоптозе, %		Клетки с FAD, %
Образцы	норма	опухоль	норма	опухоль
Контрольный	8	14.8	17	65
Анфен Na	10	31.7	25	60
Анфен Na+H₂O₂	15	73.5	29	73

Далее было определено процентное содержание клеток с NAD(P)H-оксидазным комплексом и сопоставлено с содержанием клеток с флуоресценцией FAD. На рис. 4 можно видеть корреляцию между исследуемыми объектами. Это означает, что FAD действительно является частью NAD(P)H-оксидазного комплекса.

Рис. 4. Процент клеток с флуоресценцией FAD – 1 и иммунофлуоресцией гранул NAD(P)H-оксидазных комплексов – 2 в культуре спленоцитов под действием пероксида водорода (5 мкМ), анфена натрия (10^-4М) и при их совместном воздействии.

Как видно из табл. 1, содержание FAD и число апоптотических клеток при апоптозе, вызванном ANa и {ANa + H₂O₂} в несколько раз больше, чем в спленоцитах здоровых мышей. То есть окислительно-восстановительная функция комплекса NADPH увеличивается. В то же время ANa в сочетании с H₂O₂ может рассматриваться в качестве потенциального противоопухолевого препарата, вызывающего быстрый апоптоз ( >70%) опухолевых клеток. Ранее было показано, что ANa снижает антиапоптотические белки семейства Bcl-2, воздействуя на митохондриальные пути апоптоза клеток.

В суспензии спленоцитов мышей были обнаружены нейтрофилы, которые находились в стадии нетоза (net – сеть), т.е. связаны с выбросом NAD(P)H-оксидазного комплекса (рис. 5), совместно с обволакиванием микроорганизмов и бактерий сетью ДНК. При этом бактерии, как известно, разрушаются с помощью супероксида или пероксида водорода.

Рис. 5. Микрофотографии нейтрофила в культуре спленоцитов, который находится в стадии нетоза – выброса сети ДНК, окруженной NAD(P)H-оксидазными комплексами – (флуорофор – AnnexinV-FITC(а) и 7AAD (б)). Конфокальный микроскоп с увеличением 100x.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод флуоресценции в клетках спленоцитов позволил проследить за развитием апоптоза и оценить изменение числа флуоресцирующих клеток с кофактором FAD и клеток с ферментными NAD(P)H-оксидазными комплексами под действием анфена Na и пероксида водорода. Следует отметить, что в клетках мышей с карциномой Льюис было обнаружено многократное увеличение автофлуоресценции FAD как в контрольных образцах, так и при усилении апопоза, что может быть характерным для животных опухоленосителей. Ранее в работе [18] было показано, что соотношение эндогенных кофакторов FAD и NAD(P)H может рассматриваться в качестве метаболитической характеристики раковых заболеваний, а также позволяет оценить воздействие противоопухолевых препаратов. Мы предполагаем, что сложный NAD(P)H-оксидазный комплекс NOX [19–21], может менять локализацию при развитии апоптоза. Так, при начальной стадии апоптоза в ряде клеток наблюдается ровная граница мембраны спленоцита, а при воздействии анфена натрия и пероксида водорода число апоптотических клеток, содержащих гранулы NOX, возрастает. Возможно, что следом за экспозицией фосфадитилсерина, происходит экспозиция NAD(P)H-оксидазного комплекса, вследствие чего наблюдаются выступающие на поверхность мембраны гранулы, окрашенные зеленым цветом (флуорофор Annexin V-FITC).

Наше исследование выполнено по теме, утвержденной Минобрнауки и высшего образования Российской Федерации (minobrnauki.gov.ru), 44.4. “Комплексное изучение механизмов и эффектов действия природных и синтетических антиоксидантов, противоопухолевых препаратов (химические и физических факторы). Изучение биологических механизмов старения”.