Comparative Investigation of the Mechanisms of Calcium Response in Human and Murine Spermatozoa

J. D. Korobkina; Коробкина Ю. Д.; M. A. Panteleev; Пантелеев М. А.; A. N. Sveshnikova; Свешникова А. Н.

doi:10.31857/S0233475524030086

Comparative Investigation of the Mechanisms of Calcium Response in Human and Murine Spermatozoa

Авторлар: Korobkina J.D.¹, Panteleev M.A.², Sveshnikova A.N.²
Мекемелер:
1. Center for Theoretical Problems of Physico-Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences
2. Center for Theoretical Problems of Physico-Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, Lomonosov Moscow State University Dmitry Rogachev National Medical Research Centеr of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology
Шығарылым: Том 41, № 3 (2024)
Беттер: 254-274
Бөлім: Articles
URL: https://journal-vniispk.ru/0233-4755/article/view/260761
DOI: https://doi.org/10.31857/S0233475524030086
EDN: https://elibrary.ru/crzabj
ID: 260761

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация
Толық мәтін
Авторлар туралы
Әдебиет тізімі
Қосымша файлдар
Статистика

Аннотация

Calcium signaling is a principal method of signal transduction in cells of non-excitable tissues. In both mouse and human sperm, it can be induced in response to progesterone, manifesting as oscillations or single peaks and followed by the acrosomal reaction. However, the molecular mechanisms of progesterone activation may vary between species. In this study, we aim to compare the calcium signaling mechanisms in human and mouse spermatozoa. We investigated the calcium response in mouse sperm activated by progesterone. We employed spectrofluorometry to quantify the rise in calcium concentration in response to progesterone in Fura-2 loaded mouse sperm cells in suspension. Our experiments demonstrated that mouse sperm cells respond to 50 μM progesterone with a peak 120 ± 35 s wide and 0.8 ± 0.3 μM high. Based on literature data, a scheme for the induction of calcium signaling was constructed, suggesting an intermediate stage with the synthesis of a certain prostanoid (possibly PGE2) and activation of mouse sperm by this prostanoid through a G-protein-coupled receptor. Based on the obtained reaction scheme, two computational models were developed: a point model and a three-dimensional model. As with human sperm, the point model provided only a qualitative description of calcium responses, whereas the three-dimensional model produced the shape of the calcium peak and the frequency of calcium oscillations in response to progesterone that were similar to the experimentally obtained values. Using in silico analysis, it was shown that in mouse sperm, the spatial distribution of signaling enzymes regulates the type and form of the calcium response. We conclude that the presence of time delays due to the diffusion and spatial distribution of calcium signaling enzymes regulates the calcium response in both human and mouse sperm.

Негізгі сөздер

calcium signaling, intracellular signaling, computer modeling, progesterone

Толық мәтін

ВВЕДЕНИЕ

Кальциевая сигнализация – один из ключевых способов трансдукции сигнала в эукариотических клетках. Устройство кальциевой сигнализации в одних и тех же клетках многих организмов сходно [1, 2], поэтому сравнение механизмов кальциевой сигнализации между организмами может помочь определить особенности устройства данной системы.

В сперматозоидах млекопитающих динамика кальция контролирует большинство процессов оплодотворения, например, акросомную реакцию, капацитацию и гиперактивацию [3, 4]. В сперматозоидах мыши и человека кальциевый ответ может быть индуцирован стероидным гормоном прогестероном, присутствующим в женских половых путях [5]. В человеческих сперматозоидах прогестерон опосредованно активирует расположенный в жгутике сперматозоида кальциевый канал CatSper [6], который в покое ингибирован липидом мембраны 2-арахидоноилглицеролом (2-AG). Прогестерон активирует локализованную в жгутике гидролазу ABHD2, катализирующую расщепление 2-AG на арахидоновую кислоту и глицерин [6]. Расщепление 2-AG приводит к активации CatSper и поступлению кальция в клетку. Повышение концентрации кальция способно активировать фермент фосфолипазу Сδ (PLCδ4), имеющуюся в сперматозоидах [7, 8]. Фосфолипаза С катализирует образование инозитол-1,4,5-трифосфата (IP₃) из мембранных фосфоинозитидов. IP₃ активирует канал-рецептор к IP₃ (IP₃R), расположенный на мембране депо кальция в клетке, роль которого в сперматозоиде человека играет производное ядра – избыточная ядерная мембрана (RNE), и, таким образом, индуцирует высвобождение кальция в цитоплазму клетки через эти канал-рецепторы [9, 10]. Как у человека, так и у мыши кальциевые ATP-азы далее удаляют кальций из цитозоля: ATP-аза плазматической мембраны (PMCA), присутствующая в мембране жгутика [11], выкачивает кальций во внеклеточную среду, а ATP-аза секреторного пути (SPCA), присутствующая на мембране кальциевого депо, переносит кальций из цитозоля в кальциевое депо [12]. Дополнительно присутствующие кальциевые буферы, такие как кальмодулин (CaM) [13], расположенный в цитозоле, и кальретикулин (CalRet) [14], расположенный в депо, способны обратимо связывать кальций и модулировать ответ клетки. Данная сигнализация может приводить как к осцилляторному кальциевому ответу, так и к ответу типа “одиночный пик”. Ранее нами было показано [15], что тип кальциевого ответа в сперматозоидах человека на прогестерон зависит от пространственного расположения ферментов и каналов, управляющих кальциевой сигнализацией.

Несмотря на то что кальциевая сигнализация в сперматозоидах мыши обладает теми же свойствами, что и у человека, а именно, кальциевая сигнализация индуцируется в ответ на прогестерон, реализуется в виде осцилляций или одиночных пиков и индуцирует акросомную реакцию, ее молекулярные механизмы существенно отличаются [16]. Описанный выше механизм не работает так же, так как в сперматозоидах мыши содержание 2-AG недостаточно высоко для его реализации, CatSper нечувствителен к прогестерону, а ABHD2 расположена в мембране акросомы (органелла, находящаяся в передней части головки сперматозоида), а не в жгутике [6]. Также известно, что кальциевым депо в сперматозоиде мыши является акросома, а не избыточная ядерная мембрана [17]. Точный механизм прогестероновой активации сперматозоидов мыши не установлен. Известно, что арахидоновая кислота способна индуцировать акросомную реакцию в том же объеме, что и прогестерон [18], в ходе активации генерируется простагландин E2 (PGE2) [19], который способен запускать акросомную реакцию [20], а мышиный канал CatSper, наоборот, нечувствителен к простагландинам и прогестерону [21]. При этом показано, что в индукции акросомной реакции прогестероном участвуют G-белки и некоторая изоформа фосфолипазы С [18], при этом конкретный рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR), не установлен.

В настоящей работе мы предполагаем, что активация сперматозоидов мыши прогестероном происходит по следующему механизму (рис. 1). Прогестерон, свободно проникая через плазматическую мембрану, активирует находящуюся на акросоме ABHD2 (возможен также вклад фосфолипазы А2, но с точки зрения модели это не вносит качественных изменений), что приводит к генерации арахидоновой кислоты и ее трансформации циклооксигеназным путем в PGE2 (или другой простаноид). Хотя у мыши есть активные рецепторы к PGE2, в том числе EP1 [22], данные об их наличии и локализации в сперматозоидах найдены не были. Есть данные, что на акросоме сперматозоидов мыши локализован рецептор к эстрогену (GPER), который относится к тому же классу рецепторов, что и EP1 [23]. В работе мы предполагали, что простаноид (PGE2) активирует GPCR (EP1), находящийся на плазматической мембране в районе акросомы, так как в жгутике сперматозоида мыши нет достаточного количества фосфоинозитидов для работы PLC [24]. Далее с активной αq-субъединицей G-белка ассоциируется PLCβ1 [25], и кальциевая сигнализация индуцируется по пути, описанному выше для сперматозоида человека, c тем отличием, что кальциевым депо является акросома, а не избыточная ядерная мембрана. Также учитывается, что в сперматозоидах мыши кроме PLCβ1 находится PLCδ4 [26].

В настоящей работе мы показываем, что предложенная схема событий внутриклеточной сигнализации позволяет описать наблюдаемые кальциевые ответы сперматозоидов мыши на прогестерон.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Fura-2-AM, Fura-RED-AM (Molecular Probes, США); прогестерон, DMSO, CaCl₂, KCl, MgCl₂, NaH₂PO₄, NaHCO₃, БСА, Triton, EDTA, глюкоза (Sigma-Aldrich, США), аспирин (Bayer, Германия).

Экспериментальное наблюдение кальциевой активации в сперматозоидах мыши. Данное исследование было одобрено комиссией по биоэтике МГУ им. М.В. Ломоносова (номер заявки 109-ж от 06 марта 2022 года), и оно было проведено в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации. У умерщвленных методом цервикальной дислокации мышей вырезался придаток яичка. Производилось несколько глубоких надрезов на придатке яичка, далее в течение 10 мин сперматозоиды выплывали наружу. С краев капли собиралось 10 мкл буфера, содержащего сперматозоиды, далее сперматозоиды разбавлялись буфером Tyrode’s (134 мM NaCl, 2.68 мM KCl, 1.8 мM CaCl₂, 1.05 мM MgCl₂, 417 мкМ NaH₂PO₄, 11.9 мM NaHCO₃, 5.5 мM глюкоза). После добавления Fura-2 в концентрации 2 мкМ производилась инкубация при 37^оC в течение 45 мин. Далее капли буфера объемом 100 мкл наносились на чашку Петри, через 10 мин 10 мкл буфера со сперматозоидами собиралось с краю капли и ресуспендировалось в 90 мкл Tyrode’s без добавления кальция на каплю.

Экспериментальное наблюдение прогестероновой активации окрашенных флуоресцентной меткой на кальций Fura-2 мышиных сперматозоидов производилось с помощью спектрофлуориметра. Возбуждение Fura-2, не связавшейся с кальцием, производилось на длине волны 380 нм, возбуждения Fura-2, связавшейся с кальцием, производилось на длине волны 340 нм. В ходе измерений в суспензию клеток добавлялся CaCl₂ до концентрации 2 мM для определения базового уровня сигнала [27]. Далее в суспензию добавлялся прогестерон в концентрации 50 мкМ. В части экспериментов перед добавлением прогестерона сперматозоиды инкубировались с аспирином в концентрации 100 нг/мл в течение 5 мин. Аспирин в высокой дозе добавлялся для уточнения предложенной схемы активации сперматозоидов мыши прогестероном, так как в данном случае он является ингибитором обеих изоформ циклооксигеназы [28]. Для окрашенных Fura-2 клеток далее проводился пересчет относительного изменения флуоресценции в концентрации кальция по следующей формуле [29]:

$[{Ca}^{2 +}] = K_{d} \frac{F_{380 m a x}^{} - F_{380 b a c k}^{}}{F_{380 m a x}^{} - F_{340 b a c k}^{}} (\frac{R - R_{m i n}^{}}{R_{m a x}^{} - R})$ . (1)

Здесь K_d – константа диссоциации комплекса кальция и Fura-2, R – отношение интенсивности флуоресценции при возбуждении лазером с длиной волны λ=340 нм (связавшейся с кальцием краски) к интенсивности флуоресценции при λ=380 нм (не связавшейся с кальцием краски). F_max и F_min – максимальная и минимальная флуоресценции при возбуждении данной длиной волны, F_back – флуоресценция фона, R_minи R_max – отношения интенсивностей при максимально и минимально возможных концентрациях кальция в клетке. Для определения данных коэффициентов R_minи R_max была проведена следующая калибровка: для измерения максимально возможного отношения флуоресценций R_max к сперматозоидам в конце каждого эксперимента добавлялся детергент Triton. Для того чтобы измерить R_min, после добавления Triton в среду c клетками добавлялся кальциевый хелатор EDTA. После каждого добавления подвижность и морфология сперматозоидов в суспензии проверялась на микроскопе ЛОМО Микмед-6 в режиме темного поля.

Обработка изображений проводилась с помощью Fiji (https://imagej.net/). Визуализация данных производилась с помощью GraphPad Prism 8 (https://www.graphpad.com/).

Построение математической модели. На основе литературных данных о кальциевой сигнализации в сперматозоидах млекопитающих нами построены две вычислительные модели прогестерон-индуцированной кальциевой сигнализации в сперматозоидах мыши, а именно точечная модель и трехмерная модель. Точечная модель представляет собой систему 23 обыкновенных дифференциальных уравнений, управляемую 49 параметрами и интегрируемых методом LSODA [30] с максимальным количеством внутренних шагов 10⁴, абсолютной погрешностью 10⁻¹²^,относительной погрешностью 10⁻⁷^,с помощью програмMного пакета COPASI (https://copasi.org/) [31]. Трехмерная модель представляет собой систему дифференциальных уравнений в частных производных и обыкновенных дифференциальных уравнений, интегрируемую методом конечных объемов с максимальным шагом по времени 0.01 с, пространственным шагом 0.1 мкм, абсолютной погрешностью 10⁻⁹^,относительной погрешностью 10⁻⁷^,реализованным в програмMном пакете VCell (https://vcell.org/) [32].

Уравнения модели, граничные условия и значения параметров приведены в Дополнении 1. Для каждого мобильного буфера рассматривается вклад двух некооперативных сайтов: сайтов C и P для кальретикулина и C и N для кальмодулина [33]. Активацию G-белка мы описываем согласно модели Катанаева и соавт. [34]. Детали построения и валидации моделей для сперматозоида человека даны в работе [15]. Модель была разбита на два модуля. В первом модуле описывается цепочка биохимических реакций от активации ABHD2 прогестероном до активации PLCβ. Второй модуль модели описывает динамику внутриклеточного кальция и IP₃.

В трехмерной модели учитывается диффузия ионов кальция, IP₃, СаМ и других веществ, и пространственная локализация ферментов и каналов. В точечной модели по сравнению с трехмерной были изменен параметр k_PLC= 180 с⁻¹для предотвращения самопроизвольной кальциевой активации фосфолипазы (при высоком значении константы стационарное состояние модели соответствовало опустошенному депо); для исследования режимов использовались также другие значения. С точки зрения сопоставления моделей, физический смысл уменьшения константы связан с уменьшением концентраций ряда веществ (начиная с IP₃) в месте их действия по сравнению с местом производства.

Рис. 1. Предполагаемая схема кальциевой активации сперматозоидов мыши прогестероном. а – Общая схема реакций. ABHD2 активируется прогестероном и расщепляет 2-арахидоноилглицерол (2-AG) до арахидоновой кислоты (AA) и глицерина. Арахидоновая кислота трансформируется присутствующей в сперматозоидах мыши циклооксигеназой-1 (COX-1) в некоторый простаноид (возможно, PGE2), активирующий ассоциированный с G-белком рецептор (GPCR). На рисунке GPCR изображен на плазматической мембране, но в модели он также мог находится на мембране акросомы. Далее происходит активация фосфолипазы Сβ (PLCβ), катализирующей производство инозитол-1,4,5-трифосфата (IP₃), активирующего каналы-рецепторы к IP₃ (IP₃R), расположенные в мембране внутриклеточного хранилища кальция в сперматозоиде (акросомы). б – Схема пространственного распределения компонентов системы. В настоящей работе предполагалось, что ATP-аза плазматической мембраны (PMCA) в сперматозоидах мыши активна в жгутике сперматозоида, производство IP₃ локализовано в шейке и головке сперматозоида, а IP₃R и ATP-аза секреторного пути (SPCA) локализованы в мембране акросомы.

Предполагаемая схема модели показана на рис. 1. Первый модуль модели состоит из 11 уравнений, описывающих активацию фосфолипазы C прогестероном. В модуле были использованы значения для режима № 4 из модели Катанаева [34]. Для оценки адекватности выбора использовались экспериментальные данные [35]. Далее была использована теорема Тихонова [36] для частичной редукции модели (см. Дополнение).

Второй модуль модели состоит из 8 уравнений, описывающих кальциевую сигнализацию в сперматозоиде мыши в ответ на активацию PLCβ. С целью обеспечения независимого исследования модулей на вход модели подавалась активность PLCβ на мембране в головке и шейке, аппроксимированная из первого модуля модели. Несмотря на то, что мы для полноты картины учли в модели фосфолипазу PLCδ4, также способную в принципе давать колебания через наличие положительной обратной связи, период этих колебаний слишком сильно отличается, и такая возможность не является значимой для целей данного исследования. Далее для второго модуля также была использована теорема Тихонова для частичной редукции модели (см. Дополнение).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Кальциевый ответ на активацию прогестероном в сперматозоидах млекопитающих.

В ходе экспериментов было показано, что мышиные сперматозоиды активируются прогестероном в суспензии в концентрации 50 мкМ с шириной кальциевого пика 120 ± 35 с (средние ± SD) и высотой 0.8 ± 0.3 мкМ относительно базового уровня кальция, в то время как одиночные сперматозоиды человека – в концентрации 5 мкМ с шириной 160 ± 44 с и высотой 0.5 ± 0.2 мкМ или кальциевыми осцилляциями с периодом порядка сотен секунд (рис. 2). Характерная ширина определяется как ширина пика на высоте пика 10% от максимальной амплитуды. В силу усреднения ответа по всем клеткам при измерении уровня кальция в суспензии, в наших экспериментах не наблюдался осцилляторный ответ в сперматозоидах мыши, при этом в литературе присутствуют данные об осцилляторных ответах в ответ на прогестерон [35], однако характерные концентрации кальция в сперматозоидах мыши ранее не измерялись. Также произведены эксперименты с добавлением аспирина к сперматозоидам мыши. Показано, что кальциевый ответ на прогестерон отсутствует в сперматозоидах мыши при пятиминутной преинкубации с 100 нг/мл аспирина (рис. 2б). Это подтверждает предложенную схему активации сперматозоида прогестероном.

Трехмерная, но не точечная модель предоставила количественное описание кальциевого ответа, индуцированного прогестероном в сперматозоидах мыши.

Для описания полученных экспериментальных результатов по индуцированной прогестероном кальциевой сигнализации в сперматозоидах мыши, мы использовали сначала точечную, а потом трехмерную модели (см. Материалы и методы).

Рис. 2. Кальциевый ответ на активацию прогестероном в сперматозоидах млекопитающих. а – Типичный кальциевый ответ суспензии сперматозоидов мыши в ответ на активацию 50 мкМ прогестероном с характерным временем активации и ответа 120 ± 35 с (среднее ± SD). Стрелкой указаны времена добавления CaCl₂_, прогестерона (P4). Общее количество экспериментов для P4: N = 3. б – Типичный ответ на прогестерон при преинкубации с 100 нг/мл аспирина. Стрелкой указаны времена добавления CaCl₂, прогестерона (P4) и аспирина (Asp). Общее количество экспериментов для P4 + Asp: N = 3. в, г – Типичные кальциевые ответы, наблюдаемые в одиночных сперматозоидах человека в ответ на активацию 5 мкМ прогестероном, стрелкой указано время добавления прогестерона (P4). в – Типичный одиночный пик с характерным временем 160 ± 44 с. Воспроизведено из работы [15]. Ответило N_клеток= 36 из 64. г– Типичный вид кальциевых осцилляций. Воспроизведено из работы [15]. Ответило N_клеток = 18 из 64.

Для описания экспериментально наблюдаемых откликов кальция (рис. 2) в модуле модели, описывающем кальциевый ответ, варьировалась каталитическая константа фосфолипазы C (k_PLC). Обоснование изменения k_PLCзаключалось в том, что в образце спермы, инкубированном в капацитирующих условиях, присутствуют как минимум две субпопуляции сперматозоидов [37], различающиеся по своему мембранному потенциалу, влияющему на активность потенциал-чувствительной фосфатазы (VSP) [24], регулирующей концентрацию фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата (PIP₂) в сперматозоидах.

Рис. 3. Сравнение результатов моделирования с экспериментальными данными. а – Типичный экспериментально наблюдаемый одиночный пик в сперматозоидах человека в ответ на активацию 5 мкМ прогестерона имеет ширину ~150 с [15]. б – Сперматозоид человека, точечная модель. Одиночный пик в точечной модели имеет ширину ~50 c, что значительно меньше наблюдаемого экспериментально. в – Сперматозоид человека, трехмерная модель. Одиночный пик в распределенной модели имеет ширину ~150 с, что совпадает с наблюдаемым экспериментально. Представленные зависимости концентраций от времени для трехмерной модели являются усредненными по объему. г – Сперматозоид человека. Пример низкочастотных кальциевых осцилляций, наблюдаемых в сперматозоиде человека периодом ~200 с [10]. д – Сперматозоид человека, точечная модель. Осцилляции в точечной модели имеют порядок периода ~50 с, что значительно меньше наблюдаемых экспериментально. е – Сперматозоид человека, трехмерная модель. Осцилляции в распределенной модели совпадают по периоду с экспериментально наблюдаемыми. ж –Типичный кальциевый ответ на активацию 50 мкМ прогестероном в сперматозоидах мыши, ширина пика ~100 с. з – Сперматозоид мыши, точечная модель. Одиночный пик в точечной модели имеет максимальную ширину 40 с, что значительно меньше экспериментально наблюдаемой (k_PLC = 180). и – Сперматозоид мыши, трехмерная модель. Одиночный пик в распределенной модели имеет ширину 150 с, что совпадает с экспериментально наблюдаемой (k_PLC = 5000). к – Сперматозоид мыши, точечная модель, вариант осцилляторного ответа при значении параметра k_PLC= 90. л – Сперматозоид мыши, распределенная модель, вариант осцилляторного ответа при значении параметра k_PLC= 2500.

Точечная модель прогестерон-индуцированной кальциевой сигнализации в сперматозоидах человека была способна качественно описать как осцилляторный ответ (рис. 3д), так и одиночный пик (рис. 3б). Однако в случае сперматозоидов человека, максимальная ширина пика, описываемая одномерной моделью, составляет 40 с, а максимальный период осцилляций – 50 с (максимумы, полученные в серии запусков с варьированием параметров при условии высоты пика не более 1.5 мкМ).

В случае сперматозоидов мыши в точечной модели существует режим одиночного пика (рис. 3з), а также кальциевые осцилляции с периодом порядка сотен секунд, наблюдаемые в других работах [35]. Как и в случае сперматозоидов человека, в случае сперматозоидов мыши максимальная ширина пика, описываемая одномерной моделью, составляет 40 с (рис. 3з), максимальный период осцилляций – 70 с (рис. 3к), что значительно меньше экспериментально наблюдаемых периода осцилляций и ширины пика.

Трехмерная модель и для сперматозоидов человека, и для сперматозоидов мыши была способна количественно описать ширину пика в ~100 с (рис. 3в) и частоту осцилляций (100–300 с) (рис. 3е) при коэффициенте диффузии кальция меньшем, чем 20 мкм²^/с.

Динамика кальция в сперматозоидах мыши определяется коэффициентом диффузии кальция и пространственной конфигурацией системы.

При помощи трехмерной модели кальциевой сигнализации в сперматозоидах мыши нами было проведено теоретическое исследование характера зависимости кальциевого ответа от коэффициента диффузии кальция. Было показано, что система может переключать свой тип ответа с осцилляторного на одиночный пик при изменении коэффициента диффузии кальция (рис. 4а). В сперматозоидах мыши при фиксированном коэффициенте диффузии IP₃, равном 10 мкм²/^с, колебания в системе появлялись при коэффициенте диффузии кальция менее 143 мкм²^/с (рис. 4а). Наблюдалось, что период осцилляций увеличивался при увеличении коэффициента диффузии кальция (рис. 4а, красная линия).

Рис. 4. Теоретическое исследование трехмерной модели кальциевой сигнализации в сперматозоидах мыши. а – Вариация коэффициента диффузии кальция D_с_aприводит к исчезновению кальциевых осцилляций для более высоких D_ca. Сплошная черная линия – минимум амплитуды осцилляций. Сплошная синяя линия – стационарное значение концентрации кальция (Стац. конц.), режим пика. Штриховая линия – максимум амплитуды кальциевых осцилляций. Красная линия – период кальциевых осцилляций (ось справа). б – Наличие осцилляций, их амплитуда и период зависят от V_PMCA – максимальной скорости работы PMCA. Сплошная черная линия – максимум амплитуды осцилляций. Штриховая линия – минимум амплитуды кальциевых осцилляций. Синяя линия – стационарная концентрация кальция, режим пика. Красная линия – период кальциевых осцилляций (ось справа).

При этом ранее было показано, что в сперматозоидах человека при фиксированном коэффициенте диффузии IP₃, равном 10 мкм²^/с, колебания в системе появлялись при коэффициенте диффузии кальция менее 70 мкм²^/с [15].

Также мы исследовали влияние пространственного распределения компонентов системы на тип ответа. Мы показали, что наличие осцилляций возможно только при скорости экструзии кальция кальциевой помпой PMCA большей, чем 0.43 мкМ/с (рис. 4б). Также период осцилляций зависел от V_PMCA почти линейно (на рисунке шкала нелинейна), что аналогично сперматозоидам человека [15].

В полной модели предполагалось, что PMCA в сперматозоидах локализована в жгутике. Несмотря на то что ее присутствие в акросоме нельзя исключить, качественно это не меняет ситуацию в модели в силу того, что она в любом случае дублирует там SPCA, параметры которой подбираются; можно считать, что SPCA в модели отражает суммарную активность SPCA и PMCA в акросоме. При этом в модели для мыши, где PMCA была равномерно распределена, кальциевые колебания исчезли, а ширина одиночного пика уменьшилась до 30 с.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе проводится исследование механизмов кальциевой сигнализации, индуцируемой прогестероном в сперматозоидах мыши. Проводится экспериментальное наблюдение кальциевого ответа суспензии клеток на прогестерон с характерной шириной пика 120 ± 35 с и предотвращение этого ответа ингибитором циклооксигеназы аспирином. Путем компьютерного моделирования доказывается, что в сперматозоидах мыши может работать схема активации прогестероном, включающая синтез промежуточного простаноида и активацию сперматозоида через ассоциированный с G-белком рецептор к данному простаноиду, что существенно отличает схему для сперматозоида мыши от сперматозоида человека. Тем не менее, в рамках данной работы было показано, что возникновение осцилляторного ответа на прогестерон в сперматозоидах мыши также управляется коэффициентом диффузии ионов кальция и распределением управляющих элементов кальциевой сигнализации, как и в сперматозоидах человека.

Наблюдаемая кальциевая сигнализация в сперматозоидах в ответ на прогестерон хорошо соответствует ранее опубликованным данным. Параметры одиночного пика, наблюдаемого в сперматозоидах мыши, также соответствуют параметрам пика, наблюдаемых другими авторами [35], однако в работе из-за того, что микроскопия одиночных клеток мыши не проводилась, кальциевые осцилляции в одиночных клетках не исследовались экспериментально.

В настоящей статье на основе полученных результатов и литературных данных мы предположили, что, хотя у мыши активность прогестерон-чувствительного кальциевого канала CatSper, в отличие от человека, не ингибируется 2-AG, расщепляемым ABHD2, при этом сам ABHD2 так же, как у человека, активируется прогестероном и катализирует производство арахидоновой кислоты [6]. Она конвертируется циклооксигеназой в некоторый простаноид, который активирует G-белковую сигнализацию, что приводит к активации фосфолипазы С и индукции кальциевой сигнализации. Данная схема подтверждается проведенными нами экспериментами с аспирином, а также способностью построенной модели описывать индуцированную прогестероном кальциевую сигнализацию в сперматозоидах мыши. Это позволяет нам проводить исследования особенностей кальциевой сигнализации, основной из которых является показанная зависимость осцилляторного ответа от пространственного расположения ферментов и каналов.

Пространственная конфигурация системы влияет как на форму, но и на тип кальциевого ответа. Для сперматозоидов человека мы показали, что при фиксированном коэффициенте диффузии IP₃, равном 10 мкм²^/с, колебания в системе появлялись при коэффициенте диффузии ионов кальция менее 70 мкм²/^с. В то же время в сперматозоидах мыши колебания в системе появлялись при коэффициенте диффузии ионов кальция менее 143 мкм²/^с. Наблюдаемая разница в пороговых коэффициентах диффузии может быть объяснена разницей длин сперматозоидов мыши и человека: 50 мкм [38] у человека против 130 мкм у мыши [39].

В существующих гомогенных математических моделях кальциевого ответа в сперматозоидах человека [15, 40] также возникал осцилляторный ответ при некоторых комбинациях параметров. Однако соотношение периода осцилляций и высоты пика в этих моделях не согласовывалось с нашими и литературными данными [41].

Зависимость кальциевой сигнализации от пространственной конфигурации систем находится в соответствие с работами [42, 43], где утверждается, что динамика кальциевой сигнализации в ацинарных клетках и яйцеклетках Xenopus laevis может существенно изменяться при учете диффузии кальция или потока жидкости. Геометрия системы также играет важную роль в дендритных клетках при кальциевом ответе [44].

Таким образом, как в сперматозоиде человека, так и в сперматозоидах мыши важную роль в генерации кальциевого ответа играет пространственная удаленность кальциевого депо и кальциевой ATP-азы PMCA.

Следует учитывать ограничения использованного подхода. Закон диффузии Фика является приближением, потому что диффузия кальция в клетках носит нелинейный характер [45]. В модели связывание кальция с буферными системами учитывалось только неявно путем низкого (но постоянного) коэффициента диффузии. Ограничением работы является и то, что концентрации кальция измерены для сперматозоидов мыши усредненно, а не для отдельных клеток.

Дополнение 1. Уравнения и параметры трехмерной компьютерной модели

Д1. Принципы построения модели, выбора начальных и граничных условий и подбор параметров.

Трехмерная модель была создана с использованием програмMного обеспечения VCell (http://www.vcell.org/). Соответствующая модель Virtual Cell, MouseSpermCalcium, представлена в открытом доступе на http://www.vcell.org/ под именем пользователя Juliajessica. Детали геометрии модели представлены в табл. Д1.

Таблица Д1. Геометрия модели

Название

компарт-

мента

Уравнение, задающее границы компартмента

Обозначение,

объем

Обозначение, площадь

мембраны

Источ-ник

Акросома

Полуэллипс, заданный следующим уравнением:

(((((((0.7 × x) – (0.7 × 36.0))²) + (2.0 × ((y – 5.0)²)) +

+(((2.0 × z) – 10.0)²)) < 1.21) × (x > 34.0)) × (z < 5.0))

V_acr, 1.3 мкм³

S_acr, 9.6 мкм²

[17]

Цитозоль

Жгутик сперматозоида: цилиндр, заданный уравнением

((x ≥ –89.0) × (x ≤ 14.0) × ((((y – 5.0)²) +((z – 5.0²)) < (0.3²)))

Головка сперматозоида:

Полуэллипс, заданный уравнением

((((0.4 × x) – (0.4 × 35.0)²) + (((1.3 × y) –

–(1.3 × 5.0))²) + (((2.0 × z) – 10.0)²)) < 3.0))

Шейка сперматозоида:

Цилиндр, заданный уравнением

((x ≥ 14.0) × (x ≤ 34.0) × ((((y – 5.0)²) + ((z – 5.0)²)) < (0.4²)))

V_cyt, 56 мкм³

S_cyt, 283 мкм²

[49]

Рис. Д1. Общий вид геометрии модели. Расположение веществ. Пространственное ограничение некоторых реакций. Синяя область – цитозоль сперматозоида. Красная область – акросома сперматозоида. Желтая область – мембрана сперматозоида.

Геометрия трехмерной модели включает в себя цитозоль сперматозоида (56 мкм³^), разделенный на жгутик сперматозоида (0.4 мкм в диаметре, 115 мкм длиной [46]), шейку (0.8 мкм в диаметре [47], 20 мкм длиной [48]) и головку сперматозоида (8 × 3 × 2.5 мкм [48]), акросому сперматозоида, служащую кальциевым депо (1.3 мкм³)[17], расположенную в головке сперматозоида (рис. Д1, табл. Д1), а также клеточную мембрану и мембрану акросомы. Граничные условия второго рода были использованы для всех веществ. Данные о локализации веществ и учете диффузии даны в табл. Д2. Все вещества, находящиеся в акросоме, считались хорошо перемешанными. Для перевода объемных концентраций и констант диссоциации в поверхностные использовался коэффициент $ω_{q} = N_{a} \frac{V_{q}}{S_{q}}$ , где N_a – число Авогадро, Vq – объем компартмента q, Sq – площадь поверхности компартмента q. ω_Acr и ω_Cyt соответствуют акросоме и цитозолю.

Д2. Уравнения модели.

Обозначения переменных модели указаны в табл. Д2. Обозначения параметров модели указаны в табл. Д4.

Таблица Д2. Начальные значения переменных (поверхностные концентрации для мембранных веществ, объемные концентрации для растворенных веществ; соответствуют базальным для всего, кроме кальция) и коэффициенты диффузии (для трехмерной модели)

Название вещества	Обозначение переменной	Компартмент	Начальные значения		Коэффициент- диффузии в 3D модели, мкм²/с
Название вещества	Обозначение переменной	Компартмент	Значение	Источник	Обозначение	Значение	Источник
Арахидоновая кислота	[AA]	Мембрана акросомы	0 мкм⁻²	–	D_AA	1	[15]
PGE2	[PGE2]	Цитозоль	0 мкМ	–	D_AA	1	[15]
Прогестерон в цитозоли	[Progesterone_in]	Цитозоль	0 мкМ	–	D_Prog	0.1	Подбор
ABHD2, неактивная	[ABHD2 ]	Мембрана акросомы	17 мкм⁻²	[15]	D_prot	2	[15]
ABHD2, активная	[ABHD2*]	>>	0 мкм⁻²	–	D_prot	2	[15]
2-AG*	[AG]	>>	1171 мкм⁻²	См. комM.	D_AA	1	[15]
β γ-субъединица G-белка	[βγ]	Плазматическая мембрана	0 мкм⁻²	–	D_prot	2	[15]
Активированный GPCR	[GPCRact]	>>	0 мкм⁻²	–	D_prot	2	[15]
Неактивный GPCR**	[GPCR]	>>	111 мкм⁻²	Cм. комM.	D_prot	2	[15]
α-субъединица G-белка с GTP	[Gα^GTP]	>>	0 мкМ	–	D_prot	2	[15]
Кальретикулин, свободный медленный сайт***	[CaRetSlow]	Акросома	2.8 мM	Cм. комM.	–	–	–
Кальретикулин, медленный сайт с кальцием	[CaRetSlowCa]	>>	0 мкМ	–	–	–	–
Кальретикулин, свободный быстрый сайт****	[CaRetFast]	>>	311 мкМ		–	–	–
Кальретикулин, быстрый сайт с кальцием	[CaRetFastCa]	>>	0 мкМ	–	–	–	–
Кальмодулин, свободный медленный сайт*****	[CaMSlow]	Цитозоль	4.9 мкМ	См. комM.	D_ca	10–170	Подбор
Кальмодулин, медленный сайт с кальцием	[CaMSlowCa]	>>	0 мкМ	–	D_ca	10–170	Подбор
Кальмодулин, свободный быстрый сайт******	[CaMFast]	>>	4.9 мкМ	См. комM.	D_ca	10–170	Подбор
Кальмодулин, быстрый сайт с кальцием	[CaMFastCa]	Цитозоль	0 мкМ	–	D_ca	10–170	Подбор
IP₃	[IP3]	>>	0 мкМ	[50]	D_IP₃	10.0	Подбор
Кальций в	[ $C_{C y t}^{2 +}$ ]	>>	0.1 мкМ	[51]	D_ca	10–170	Подбор
Кальций в акросоме	[ $C_{A c t}^{2 +}$ ]	Акросома	256 мкМ	[51]	–	–	–
Активированная PLCβ	[PLCβact]	Плазматическая мембрана	0 мкм⁻²	–	D_prot	2	[15]
Неактивная PLCβ*******	[PLCβ]	>>	177 мкм⁻²	См. комM	D_prot	2	[15]

* Рассчитывается как $2 A {G_{V o l 0}}^{x N_{a} V_{a c r} / S_{a c r}}$ . Для $2 A G_{V o l 0}$ см. табл. Д4.

** Рассчитывается как N_GPCR/S_acr. Для N_GPCR см. табл. Д4.

*** Рассчитывается как (N_CaRetSlow)/( $N_{a} x^{V_{a c r}}$ ). Для N_CaRetSlow см. табл. Д4.

**** Рассчитывается как (N_CaRetFast)/( $N_{a} x^{V_{a c r}}$ ). Для N_CaRetFast см. табл. Д4.

***** Рассчитывается как (N_CaMSlow)/( $N_{a} x^{V_{c y t}}$ ). Для N_CaMSlow см. табл. Д4.

****** Рассчитывается как (N_CaMFast)/( $N_{a} x^{V_{c y t}}$ ). Для N_CaMFast см. табл. Д4.

******* Рассчитывается как N_PLC_β /S_acr. Для N_PLC_β. см. табл. Д4.

Рис. Д2. Динамика количества активированной фосфолипазы для различных параметров первого модуля модели. а – Режим 4 из [34]. б – Режим 2 из [34]. в –Сравнение полной модели и модели с примененным квазиравновесным приближением для ABHD2.

Первый модуль состоит из 11 уравнений:

$\frac{\partial [P r o g e s t e r o n e_{i n}]}{\partial t} = D_{p r o g} ([P r o g e s t e r o n e_{}] - [P r o g e s t e r o n e_{i n}]) + D_{p r o g} Δ [P r o g e s t e r o n e_{i n}]$ , (1)

$\frac{\partial [A A]}{\partial t} = \frac{k_{c a t A B H D} [A G] [A B H D 2^{*}]}{ω_{A c r} K_{m A B H D - A G} + [A G]} - k_{A A} [A A] - k_{C O X} N_{C O X} [A A] + D_{A A} Δ [A A]$ , (2)

$\frac{\partial [P G E 2]}{\partial t} = k_{- G P C R} [G P C R a c t] / ω_{C y t} + k_{C O X} N_{C O X} [A A] / ω_{C y t} - k_{- G P C R} [G P C R] [P G E 2] / (ω_{C y t} K_{d G P C R}) - k_{d e g P G E} [P G E 2] + D_{A A} Δ [P G E 2]$ , (3)

$\frac{\partial [A B H D^{*}]}{\partial t} = k_{+ A B H D P r o g} [A B H D 2] [P r o g e s t e r o n e_{i n}] - k_{- A B H D P r o g} [A B H D 2^{*}] + D_{P r o t} Δ [A B H D 2^{*}]$ , (4)

$\frac{\partial [A G]}{\partial t} = - \frac{k_{c a t A B H D} [A G] [A B H D 2^{*}]}{ω_{A c r} K_{m A B H D - A G} + [A G]} + k_{A A} [A A] + D_{A A} Δ [A G]$ , (5)

$\frac{\partial [G P C R a c t]}{\partial t} = k_{- G P C R} [G P C R] [P G E 2] / K_{d G P C R} - k_{- G P C R} [G P C R a c t] - k_{i n t e r n} [G P C R a c t] + D_{P r o t} Δ [G P C R a c t]$ , (6)

$\frac{\partial [G P C R]}{\partial t} = - k_{- G P C R} [G P C R] [P G E 2] / K_{d G P C R} + k_{- G P C R} [G P C R a c t] + D_{P r o t} Δ [G P C R]$ , (7)

$\frac{\partial [β γ]}{\partial t} = k_{d i s s} [G P C R a c t] \frac{ω_{C y t} M - [β γ]}{ω_{C y t} K_{G 2} + (ω_{A c r} M - [β γ])} - k_{G 1} [β γ] ([β γ] - [G α^{G T P}]) + D_{P r o t} Δ [β γ]$ , (8)

$\frac{\partial [G α^{G T P}]}{\partial t} = k_{d i s s} [G P C R a c t] \frac{ω_{C y t} M - [β γ]}{ω_{C y t} K_{G 2} + (ω_{A c r} M - [β γ])} - k_{h y d r} ω_{C y t} [G A P] \frac{[G α^{G T P}]}{ω_{C y t} K_{G 3} + [G α^{G T P}]} + D_{P r o t} Δ [G α^{G T P}]$ , (9)

$\frac{\partial [P L C β a c t]}{\partial t} = - [P L C β a c t] k_{D A c t P L C} + k_{a} [G α^{G T P}] [P L C β] + D_{p r o t} Δ [P L C β a c t]$ , (10)

$\frac{\partial [P L C β]}{\partial t} = [P L C β a c t] k_{D A c t P L C} - k_{a} [G α^{G T P}] [P L C β] + D_{p r o t} Δ [P L C β]$ , (11)

Сумма скоростей в правых частях (10) и (11) дает ноль, поэтому для гомогенной системы одно из уравнений можно отбросить.

Полученная система уравнений была упрощена путем исследования иерархии характерных времен и редукции с применением теоремы Тихонова до 9 уравнений. Cначала было произведено обезразмеривание переменных: $P L C β_{s} = \frac{[P L C β]}{P L C β_{a v g}}$

$P L C β_{A C T s} = \frac{[P L C β a c t]}{P L C β_{A C T a v g}}$ , $β γ_{s} = \frac{[β γ]}{β γ_{a v g}}$ , $G {α^{G T P}}_{s} = \frac{[G α^{G T P}]}{G {α^{G T P}}_{a v g}}$ , $G P C R a c t_{s} = \frac{[G P C R a c t]}{G P C R a c t_{a v g}}$ , $G P C R_{s} = \frac{[G P C R]}{G P C R_{a v g}}$ ,

$A G_{s} = \frac{[A G]}{A G_{a v g}}$ , $A A_{s} = \frac{[A A]}{A A_{a v g}}$ , $P G E 2_{s} = \frac{[P G E 2]}{P G E 2_{a v g}}$ , $A B H D 2_{s} = \frac{[A B H D 2]}{A B H D 2_{a v g}}$ , $A B H D {2^{*}}_{s} = \frac{[A B H D 2^{*}]}{A B H D {2^{*}}_{a v g}}$ .

Значения с индексом _avgсоответствуют средним за период активации значениям переменных. Численные значения даны в табл. Д3.

В обезразмеренную систему были подставлены численные значения для констант, и она была переписана в виде . Полученные значения для коэффициентов A^sсоотносились следующим образом: A^AA≪A^FG =~A^G^α^GTP≪A^CaMSlow≪A^GPCR≪A^ABHD². При применении квазистационарного приближения для ABHD2, модель полностью сохраняла свое поведение (рис. Д3в). В конечных расчетах концентрации ABHD2 и ABHD2* задавались следующими выражениями:

$[A B H D 2^{*}] = {[A B H D 2]}_{0} - [A B H D 2]$ ,

$[A B H D 2] = k_{- A B H D P r o g} ({[A B H D 2]}_{0}) / (k_{+ A B H D P r o g} [P r o g e s t e r o n e_{i n}] + k_{- A B H D P r o g})$ .

Во втором модуле на вход подавалась активность PLC следующим выражением:

$[P L C β a c t] = 8 e^{\frac{- {(t - 600)}^{2}}{250^{2}}} / {мкм}^{2}$ .

Активность PLCδ4 описывалась как кальций-зависимый поток IP₃ в цитозоль – уравнение (27). Второй модуль состоит из 8 уравнений. Обозначения переменных модели указаны в табл. Д2. Обозначения параметров модели указаны в табл. Д4.

$\frac{\partial [C a_{C y t}^{2 +}]}{\partial t} = J_{A c r, l e a k} - J_{S P C A} - J_{P M C A} + J_{I P 3 r} + J_{l e a k} + J_{B u f C y t} + D_{C a} Δ [C a_{C y t}^{2 +}]$ , (12)

$\frac{d [C a_{A c r}^{2 +}]}{d t} = J_{S P C A} - J_{R N E, l e a k} - J_{I P 3 r} + J_{B u f E R}$ , (13)

$J_{S P C A} = \{\begin{matrix} \frac{V_{S P C A} {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{2}}{{K_{S P C A}^{}}^{2} + {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{2}}, \vec{x} \in Мембрана акросомы \\ 0, \vec{x} \notin Мембрана акросомы \end{matrix}$ , (14)

$J_{P M C A} = \{\begin{matrix} \frac{V_{P M C A} {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{2}}{{K_{P M C A}^{}}^{2} + {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{2}}, \vec{x} \in Жгутик \\ 0, \vec{x} \notin Жгутик \end{matrix}$ , (15)

_{$J_{A c r, l e a k} = \{\begin{matrix} \begin{array}{l} k_{l e a k} ([C a_{A c r}^{2 +}] - [C a_{C y t}^{2 +}]), \vec{x} \in Мембрана \\ акросомы \end{array} \\ 0, \vec{x} \notin Мембрана акросомы \end{matrix}$ ,}(16)

$J_{l e a k} = \{\begin{matrix} k_{l e a k P P}, \vec{x} \in Жгутик \\ 0, \vec{x} \notin Жгутик \end{matrix}$ , (17)

$J_{I P 3 r} = \{\begin{matrix} \begin{array}{l} N_{I P 3} k_{I P 3} P_{0} ([C a_{A c r}^{2 +}] - [C a_{C y t}^{2 +}]), \vec{x} \in Мембрана \\ акросомы \end{array} \\ 0, \vec{x} \notin Мембрана акросомы \end{matrix}$ (18)

где $P_{0} = m_{\infty}^{3} h^{3}$ – вероятность пребывания IP₃R в открытом состоянии, определяемая согласно модели Ли-Ринзела [52], h – доля каналов, не инактивированных кальцием:

$\frac{d h}{d t} = \frac{h_{\infty} - h}{τ_{h}}$ , (19)

где $τ_{h} = \frac{1}{a_{2} (Q_{2} + [C a_{c y t}^{2 +}])}$ , $m_{\infty} = (\frac{[I P_{3}]}{[I P_{3}] + K_{1}}) (\frac{[C a_{c y t}^{2 +}]}{[C a_{c y t}^{2 +}] + K_{5}})$ , $h_{\infty} = \frac{Q_{2}}{Q_{2} + [C a_{c y t}^{2 +}]}$ , $Q_{2} = K_{2} \frac{[I P_{3}] + K_{1}}{[I P_{3}] + K_{3}}$

_{$\begin{array}{l} J_{B u f E R} = - [C a R e t S l o w] [C a_{A c r}^{2 +}] k_{r e t S}^{+} + \\ + [C a R e t S l o w C a] k_{r e t S}^{-} - \\ [C a R e t F a s t] [C a_{A c r}^{2 +}] k_{r e t F}^{+} + [C a R e t F a s t] k_{r e t F}^{-} \end{array}$ ,}(20)

_{$\begin{array}{l} J_{B u f C y t} = - [C a M S l o w] [C a_{C y t}^{2 +}] k_{M S}^{+} + \\ + [C a M S l o w C a] k_{M S}^{-} - \\ - [C a M F a s t] [C a_{C y t}^{2 +}] k_{M F}^{+} + [C a M F a s t] k_{M F}^{-} \end{array}$ ,}(21)

где J_SPCA – это поток через SPCA, J_PMCA – поток через PMCA, J_IP₃_r – поток через IP₃R, J_leak и J_RNE_,_leak – утечки из внешней среды и депо.

$\frac{d [C a R e t S l o w]}{d t} = - [C a R e t S l o w] [C a_{A c r}^{2 +}] k_{+ C a R e t S l o w}^{} + [C a R e t S l o w C a] \frac{k_{+ C a R e t S l o w}^{}}{K_{d C a R e t S l o w}^{}}$ (22)

$\frac{d [C a R e t F a s t]}{d t} = - [C a R e t F a s t] [C a_{A c r}^{2 +}] k_{+ C a R e t F a s t}^{} + [C a R e t F a s t C a] \frac{k_{+ C a R e t F a s t}^{}}{K_{d C a R e t F a s t}^{}}$ (23)

$\frac{d [C a M F a s t]}{d t} = - [C a M F a s t] [C a_{C y t}^{2 +}] k_{+ C a M F a s t}^{} + [C a M F a s t C a] k_{- C a M F a s t}^{}$ , (24)

$\frac{d [C a M S l o w]}{d t} = - [C a M S l o w] [C a_{C y t}^{2 +}] k_{+ C a M S l o w}^{} + [C a M S l o w C a] \frac{k_{+ C a M S l o w}^{}}{K_{d C a M S l o w}^{}}$ , (25)

$\frac{\partial [I P 3]}{\partial t} = J_{P L C β} - J_{I P 5 p p} + J_{p l c d} + D_{I P 3} Δ [I P 3]$ , (26)

$J_{P L C δ} = \{\begin{matrix} \frac{N_{P L C δ} k_{P L C}^{} {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{}}{N_{A} V_{c y t} ({K_{P L C}^{}}^{} + {[C a_{C y t}^{2 +}]}^{})}, \vec{x} \in Г о л о в к а + ш е й к а \\ 0, \vec{x} \notin Г о л о в к а + ш е й к а \end{matrix}$ , (27)

$J_{PLCβ} = \{\begin{matrix} [P L C β a c t] k_{PLC}, \in Г о л о в к а + ш е й к а \\ 0, \notin Г о л о в к а + ш е й к а \end{matrix}$ , (28)

$J_{I P 5 p p} = \frac{N_{I P 5 p p} k_{I P 5 p p}^{} {[I P 3]}^{}}{N_{A} V_{c y t} ({K_{I P 5 p p}^{}}^{} + {[I P 3]}^{})}$ , (29)

где $J_{I P 5 p p}$ – скорость деградации IP₃ инозитол 5-фосфатазой (IP5pp), $J_{P L C δ}$ – скорость производства IP₃ PLCδ; – $J_{P L C β}$ скорость производства IP₃ PLC^β.

Полученная система из 8 уравнений была упрощена с помощью исследования иерархии времен путем применения теоремы Тихонова до 7 уравнений. Cначала было произведено обезразмеривание переменных:

$I P 3_{s} = \frac{[I P 3]}{I P 3_{a v g}}$ , $C {a_{C y t}^{2 +}}_{s} = \frac{[C a_{C y t}^{2 +}]}{C {a_{C y t}^{2 +}}_{a v g}}$ , $C {a_{A c r}^{2 +}}_{s} = \frac{[C a_{A c r}^{2 +}]}{C {a_{A c r}^{2 +}}_{a v g}}$ , $C a R e t S l o w_{s} = \frac{[C a R e t S l o w]}{C a R e t S l o w_{a v g}}$

$C a R e t F a s t_{s} = \frac{[C a R e t F a s t]}{C a R e t F a s t_{a v g}}$ , $C a M S l o w_{s} = \frac{[C a M S l o w]}{C a M S l o w_{a v g}}$ , $C a M F a s t_{s} = \frac{[C a M F a s t]}{C a M F a s t_{a v g}}$ .

Значения с индексом _avg соответствуют средним за период активации значениям переменных. Численные значения даны в табл. Д3.

Таблица Д3. Средние по времени значения переменных при активации 50 мкМ прогестерона

Переменная	Среднее значение	Переменная	Среднее значение	Переменная	Среднее значение
PLCβ_avg	15 мкМ⁻²	→PGE2_avg	0.15 мкМ	[CaRetSlow]	2500 мкМ
PLCβ_AСTavg	6 мкМ⁻²	ABHD2_avg	8 мкМ⁻²	[CaMFast]	10 мкМ
βγ_avg	33 мкМ⁻²	ABHD2*_avg	6 мкМ⁻²	[CaMSlow]	6 мкМ
Ga^GTP_avg	200 мкМ⁻²	IP3_avg	0.1 мкМ	[CaRetFastCa]	300 мкМ
GPCRact_avg	13 мкМ⁻²	Ca²⁺_Cytavg	0.25 мкМ	[CaRetSlowCa]	300 мкМ
GPCR_avg	5 мкМ⁻²	Cal²⁺_Acravg	10 мкМ	[CaMFastCa]	4.5 мкМ
AG_avg	0.6 мкМ	[CaRetFast ]	10 мкМ	[CaMSlowCa]	0.8 мкМ

Рис. Д3. Использование квазистационарного и квазиравновесного приближений для второго модуля модели. а – При использовании квазистационарного (квазистац.) приближения для концентрации быстрого сайта кальмодулина, кальциевый ответ не меняется (черная кривая). Для кальция в депо при использовании квазистационарного приближения кальциевый ответ отсутствует. б – При использовании квазиравновесного приближения для кальретикулина, кальциевый ответ отсутствует. При использовании квазистационарного приближения для IP₃ кальциевый ответ сохраняется, но осцилляции в модели отсутствуют при любых значениях концентрации IP₃.

В обезразмеренную систему были подставлены численные значения для констант, и уравнения переписаны в виде

$\frac{d p_{s}}{d t} = A^{S} O$ . (1)

Результирующие значения для коэффициентов A^Sсоотносились следующим образом:

A^IP3 ~ A^CaRetSlow ~ A^CaRerFast ≪ A^CaMSlow ≪ A^CaRNE ~ A^CaMFast≪ A^CaCyt

При применении квазистационарного приближения для ${Ca}_{Cyt}^{2 +}$ (рис. Д3а), модель расходилась. При применении квазистационарного приближения для ${Ca}_{Acr}^{2 +}$ , (рис. Д3б), кальциевый ответ на прогестерон отсутствовал. Аналогич- ный результат был получен для использования стационарного приближения для CaRetFast и CaRetSlow (рис. Д3б). В случае использования стационарного приближения для ответ наблюдался в полной мере, однако модель не была способна воспроизводить кальциевые осцилляции (рис. Д3б). Использование квазистационарного приближения для быстрого сайта кальмодулина не меняло вид кальциевого ответа, и далее данное приближение использовалось как для гомогенной, так и трехмерной модели.

Квазистационарное приближение для быстрого сайта кальмодулина было задано следующим образом:

$[C a M F a s t C a] = {[C a M F a s t]}_{0} - [C a M F a s t]$ ,

$[C a M F a s t] = \frac{k_{- C a M F a s t}^{} {[C a M F a s t]}_{0}}{([C a_{C y t}^{2 +}] k_{+ C a M F a s t}^{} + k_{- C a M F a s t}^{})}$ .

Таблица Д4. Параметры модели

	Значение	Ссылка	Комментарий
Кальциевый модуль
K1	0.13 мкМ	[53]	Параметр IP₃R
K2	30 мкМ	[54]	Параметр IP₃R
K3	0.003 мкМ	[54]	Параметр IP₃R
K5	0.13 мкМ	[54]	Параметр IP₃R
a₂	10⁻⁴	[54]	Параметр IP₃R
V_SPCA	2.31 мкМ/с	Подбор параметров	Максимальная скорость SPCA
K_SPCA	0.27 мкМ	[55]	Аффинность SPCA к кальцию
k_leak	0,01	Подбор параметров	Коэффициент утечки из акросомы
k_IP₃	0.00007 (мкМ × с)⁻¹	[56]	Поток через 1 открытый IP₃R
k_leakPP	0.15 мкМ/с	[55]	Утечка кальция в цитозоль
K_PLC	0.7 мкМ	[57]	Аффинность к кальцию PLC_δ
k_PLC	5000 с⁻¹	[58]	Каталитическая константа PLC_δ и PLC_β
N_PLC_δ	15	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Количество PLC_δ
N_PLC_β	140	[59]	Количество PLC_β
N_IP₃	1850	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Количество IP₃R
N_IP₅_pp	240	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Количество IP5pp
k_catIp₅_pp	340 с⁻¹	[60]	Каталитическая константа IP5pp
K_Ip₅_pp	0.7 мкМ	[61]	Аффинность IP5PP к IP₃
N_CaRet	54000	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Количество CaRet
N_CaRetSlow	N_CaRetSlow× 18	[62]	Емкость сайта С кальретикулина
N_CaRetFast	N_CaRetSlow × 2	[62]	Емкость сайта P кальретикулина
k₊_CaRetSlow	0.1 (мкМ × с)^–¹	[63]	Скорость ассоциации сайта C с кальцием
K_d_CaRetSlow	2000 мкМ	[63]	Константа диссоциации сайта C и кальция
k₊_CaRetFast	0.05	[15]	Скорость ассоциации сайта P с кальцием
K_d_CaRetFast	1 мкМ	[64]	Константа диссоциации сайта P и кальция
N_CaM	54000	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Количество молекул кальмодулина
N_CaMSlow	N_CaM× 2	[63]	Емкость сайта N кальмодулина
N_CaMFast	N_CaM× 2	[63]	Емкость сайта C кальмодулина
K⁺_CaMSlow	10 с⁻¹	[65]	Скорость ассоциации сайта C кальмодулина с кальцием
K_d_CaMSlow	1 мкМ	[63]	Константа диссоциации сайта C кальмодулина и кальция
k₊_CaMFast	100 (мкМ × с)^–1	[65]	Скорость ассоциации сайта N кальмодулина с кальцием
k_-_CaMFast	500 с⁻¹	[65]	Скорость диссоциации сайта N кальмодулина с кальцием
V_PMCA	1 мкМ	[66]	Максимальная скорость PMCA
K_PMCA	0.27 мкМ	[67]	Константа полуактивации PMCA
Модуль ABHD2–PLCβ
kcat_ABHD	0.35	[68]	Каталитическая константа для ABHD2
K_m_ABHD_-_AG	12 мкМ	[69]	Аффинность ABHD2 к 2-AG
k₊_ABHDProg	3	[15]	K⁺для связывания прогестерона и ABHD2
K_m_ABHDProg	16	[6]	Aффинность ABHD2 к прогестерону
k_AA	0.01	[6]	Скорость генерации 2-AG мембраной
N_gpcr	400	Метод оценки описан в [15] на основе [59]	Начальное количество молекул ABHD2
k_diss	25 с⁻¹	[34]	Параметр активации GPCR
k_G1	10⁻⁶ c⁻¹	[34]	Параметр активации GPCR
M	0.5 мкМ	[34]	Полная концентрация GPCR
K_G₂	0.5 мкМ	[34]	Параметр активации GPCR
K_G₃	0.002 мкМ	[34]	Параметр активации GPCR
[GAP]	0.025 мкМ	[34]	Концентрация GAP в клетке
k_hydr	5	[34]	Параметр активации GPCR
k_DActPLC	1 c^-¹	Подбор параметров	Скорость деактивации PLCβ
k_a	5 (мкМ × c)^–¹	Подбор параметров	Скорость активации PLC β α^GTP-субъединицей
k_intern	0.01 c^-1	[34]	Скорость интернализации активированного G-белка
2AG_Vol₀	0.7 мкМ	[6]	Начальная объемная концентрация 2-AG
k_COX	5.9 (мкМ × c)^–¹	[70]	Скорость конвертации АА в PGE2 циклооксигеназой
N_COX	400	[59]	Количество циклооксигеназы в сперматозоиде
k_degPGE	0.006 с⁻¹	[71]	Скорость деградации PGE2
k_-GPCR	1 с⁻¹	Подбор параметров	Скорость диссоциации PGE2 и GPCR
K_dGPCR	0.001 мкМ	[72]	Константа диссоциации комплекса PGE2-GPCR

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа поддержана грантом РНФ № 23-74-00057. Работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами МГУ имени М.В. Ломоносова.

Соответствие принципам этики. Данное исследование было одобрено комиссией по биоэтике МГУ имени М.В. Ломоносова (номер заявки 109-ж от 06 марта 2022 года) и проведено в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации.

Әдебиет тізімі

Ottolini M., Sonkusare S.K. 2021. The calcium signaling mechanisms in arterial smooth muscle and endothelial cells. Compr. Physiol. 11 (2), 1831–1869.
Kalyanasundaram A., Li N., Hansen B.J., Zhao J., Fedorov V.V. 2019. Canine and human sinoatrial node: Differences and similarities in the structure, function, molecular profiles, and arrhythmia. J. Vet. Cardiol. 22, 2–19.
Suarez S.S., Ho H.C. 2003. Hyperactivation of mammalian sperm. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 49 (3), 351–356.
Sanchez-Cardenas C., Servin-Vences M.R., Jose O., Trevino C.L., Hernandez-Cruz A., Darszon A. 2014. Acrosome reaction and Ca²⁺ imaging in single human spermatozoa: New regulatory roles of [Ca²⁺]i. Biol. Reprod. 91 (3), 67.
Taraborrelli S. 2015. Physiology, production and action of progesterone. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 94 Suppl 161, 8–16.
Miller M.R., Mannowetz N., Iavarone A.T., Safavi R., Gracheva E.O., Smith J.F., Hill R.Z., Bautista D.M., Kirichok Y., Lishko P.V. 2016. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science. 352 (6285), 555–559.
Nakamura Y., Fukami K. 2009. Roles of phospholipase C isozymes in organogenesis and embryonic development. Physiology (Bethesda). 24, 332–341.
Kim Y.H., Park T.J., Lee Y.H., Baek K.J., Suh P.G., Ryu S.H., Kim K.T. 1999. Phospholipase C-delta1 is activated by capacitative calcium entry that follows phospholipase C-beta activation upon bradykinin stimulation. J. Biol. Chem. 274 (37), 26127–26134.
Finkelstein M., Etkovitz N., Breitbart H. 2020. Ca²⁺ signaling in mammalian spermatozoa. Mol. Cell Endocrinol. 516, 110953.
Alasmari W., Barratt C.L., Publicover S.J., Whalley K.M., Foster E., Kay V., Martins da Silva S., Oxenham S.K. 2013. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Hum. Reprod. 28 (4), 866–876.
Schuh K., Cartwright E.J., Jankevics E., Bundschu K., Liebermann J., Williams J.C., Armesilla A.L., Emerson M., Oceandy D., Knobeloch K.P., Neyses L. 2004. Plasma membrane Ca²⁺ ATPase 4 is required for sperm motility and male fertility. J. Biol. Chem. 279 (27), 28220–28226.
Harper C., Wootton L., Michelangeli F., Lefievre L., Barratt C., Publicover S. 2005. Secretory pathway Ca²⁺-ATPase (SPCA1) Ca²⁺ pumps, not SERCAs, regulate complex [Ca²⁺]i signals in human spermatozoa. J. Cell Sci. 118 (Pt 8), 1673–1685.
Si Y., Olds-Clarke P. 2000. Evidence for the involvement of calmodulin in mouse sperm capacitation. Biol. Reprod. 62 (5), 1231–1239.
Nakamura M., Oshio S., Tamura A., Okinaga S., Arai K. 1992. Antisera to calreticulin inhibits sperm motility in mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (2), 984–990.
Korobkin J., Balabin F.A., Yakovenko S.A., Simonenko E.Y., Sveshnikova A.N. 2021. Occurrence of calcium oscillations in human spermatozoa is based on spatial signaling enzymes distribution. Int. J. Mol. Sci. 22 (15), 8018.
Rennhack A., Schiffer C., Brenker C., Fridman D., Nitao E.T., Cheng Y.M., Tamburrino L., Balbach M., Stolting G., Berger T.K., Kierzek M., Alvarez L., Wach-ten D., Zeng X.H., Baldi E., Publicover S.J., Kaupp U.B., Strunker T. 2018. A novel cross-species inhibitor to study the function of CatSper Ca²⁺ channels in sperm. Br J Pharmacol. 175 (15), 3144–3161.
Herrick S.B., Schweissinger D.L., Kim S.W., Bayan K.R., Mann S., Cardullo R.A. 2005. The acrosomal vesicle of mouse sperm is a calcium store. J. Cell Physiol. 202 (3), 663–671.
Pietrobon E.O., Soria M., Dominguez L.A., Monclus Mde L., Fornes M.W. 2005. Simultaneous activation of PLA2 and PLC are required to promote acrosomal reaction stimulated by progesterone via G-proteins. Mol. Reprod. Dev. 70 (1), 58–63.
Herrero M.B., Cebral E., Franchi A., Motta A., Gimeno M.F. 1998. Progesterone enhances prostaglandin E2 production via interaction with nitric oxide in the mouse acrosome reaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252 (2), 324–328.
Joyce C.L., Nuzzo N.A., Wilson L., Jr., Zaneveld L.J. 1987. Evidence for a role of cyclooxygenase (prostaglandin synthetase) and prostaglandins in the sperm acrosome reaction and fertilization. J. Androl. 8 (2), 74–82.
Lishko P.V., Botchkina I.L., Kirichok Y. 2011. Progesterone activates the principal Ca²⁺ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387–391.
Breyer R.M., Bagdassarian C.K., Myers S.A., Breyer M.D. 2001. Prostanoid receptors: subtypes and signaling. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41, 661–690.
Gao D.D., Lan C.F., Cao X.N., Chen L., Lei T.L., Peng L., Xu J.W., Qiu Z.E., Wang L.L., Sun Q., Huang Z.Y., Zhu Y.X., Zhou W.L., Zhang Y.L. 2022. G protein-coupled estrogen receptor promotes acrosome reaction via regulation of Ca²⁺ signaling in mouse spermdagger. Biol. Reprod. 107 (4), 1026–1034.
Kawai T., Miyata H., Nakanishi H., Sakata S., Morioka S., Sasaki J., Watanabe M., Sakimura K., Fujimoto T., Sasaki T., Ikawa M., Okamura Y. 2019. Polarized PtdIns(4,5) P(2) distribution mediated by a voltage-sensing phosphatase (VSP) regulates sperm motility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 116 (51), 26020–26028.
Choi D., Lee E., Hwang S., Jun K., Kim D., Yoon B.K., Shin H.S., Lee J.H. 2001. The biological significance of phospholipase C beta 1 gene mutation in mouse sperm in the acrosome reaction, fertilization, and embryo development. J. Assist. Reprod. Genet. 18 (5), 305–310.
Fukami K., Yoshida M., Inoue T., Kurokawa M., Fissore R.A., Yoshida N., Mikoshiba K., Takenawa T. 2003. Phospholipase Cdelta4 is required for Ca²⁺ mobilization essential for acrosome reaction in sperm. J. Cell Biol. 161 (1), 79–88.
Ohlmann P., Hechler B., Cazenave J.P., Gachet C. 2004. Measurement and manipulation of [Ca²⁺]i in suspensions of platelets and cell cultures. Methods Mol. Biol. 273, 229–250.
Mirabito Colafella K.M., Neuman R.I., Visser W., Danser A.H.J., Versmissen J. 2020. Aspirin for the prevention and treatment of pre-eclampsia: A matter of COX-1 and/or COX-2 inhibition? Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 127 (2), 132–141.
Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. 1985. A new generation of Ca²⁺ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440–3450.
Bergmann F.T., Hoops S., Klahn B., Kummer U., Mendes P., Pahle J., Sahle S. 2017. COPASI and its applications in biotechnology. J. Biotechnol. 261, 215–220.
Hoops S., Sahle S., Gauges R., Lee C., Pahle J., Simus N., Singhal M., Xu L., Mendes P., Kummer U. 2006. COPASI-a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067–3074.
Moraru, II, Schaff J.C., Slepchenko B.M., Blinov M.L., Morgan F., Lakshminarayana A., Gao F., Li Y., Loew L.M. 2008. Virtual Cell modelling and simulation software environment. IET Syst. Biol. 2 (5), 352–362.
Marhl M., Schuster S., Brumen M., Heinrich R. 1997. Modeling the interrelations between the calcium oscillations and ER membrane potential oscillations. Biophys. Chem. 63 (2–3), 221–239.
Katanaev V.L., Chornomorets M. 2007. Kinetic diversity in G-protein-coupled receptor signalling. Biochem. J. 401 (2), 485–495.
Romarowski A., Sanchez-Cardenas C., Ramirez-Gomez H.V., Puga Molina Ldel C., Trevino C.L., Hernandez-Cruz A., Darszon A., Buffone M.G. 2016. A specific transitory increase in intracellular calcium induced by progesterone promotes acrosomal exocytosis in mouse sperm. Biol. Reprod. 94 (3), 63.
Klonowski W. 1983. Simplifying principles for chemical and enzyme reaction kinetics. Biophys. Chem. 18 (2), 73–87.
Lopez-Gonzalez I., Torres-Rodriguez P., Sanchez-Carranza O., Solis-Lopez A., Santi C.M., Darszon A., Trevino C.L. 2014. Membrane hyperpolarization during human sperm capacitation. Mol. Hum. Reprod. 20 (7), 619–629.
Smith D., Gaffney E., Blake J., Kirkman-Brown J. 2009. Human sperm accumulation near surfaces: a simulation study. J. Fluid Mechanics. 621, 289–320.
Cummins J.M., Woodall P.F. 1985. On mammalian sperm dimensions. J. Reprod. Fertil. 75 (1), 153–175.
Simons J., Fauci L. 2018. A model for the acrosome reaction in mammalian sperm. Bull Math Biol. 80 (9), 2481–2501.
Kirkman-Brown J.C., Barratt C.L., Publicover S.J. 2004. Slow calcium oscillations in human spermatozoa. Biochem. J. 378 (Pt 3), 827–832.
Lechleiter J., Girard S., Clapham D., Peralta E. 1991. Subcellular patterns of calcium release determined by G protein-specific residues of muscarinic receptors. Nature. 350 (6318), 505–508.
Vera-Siguenza E., Pages N., Rugis J., Yule D.I., Sneyd J. 2019. A mathematical model of fluid transport in an accurate reconstruction of parotid acinar cells. Bull. Math. Biol. 81 (3), 699–721.
Bell M., Bartol T., Sejnowski T., Rangamani P. 2019. Dendritic spine geometry and spine apparatus organization govern the spatiotemporal dynamics of calcium. J. Gen. Physiol. 151 (8), 1017–1034.
Zador A., Koch C. 1994. Linearized models of calcium dynamics: formal equivalence to the cable equation. J. Neurosci. 14 (8), 4705–4715.
Weber K., Waletzky A., Fendl D., Ordonez P., Takawale P., Hein F., Riedel W., Konig A., Kunze M., Leoni A.L., Rivera J., Quirici R., Romano I., Paepke S., Okazaki Y., Hardisty J.F. 2014. New method for sperm evaluation by 3-dimensional laser scanning microscopy in different laboratory animal species. Int. J. Toxicol. 33 (5), 353–361.
Sunanda P., Panda B., Dash C., Padhy R.N., Routray P. 2018. An illustration of human sperm morphology and their functional ability among different group of subfertile males. Andrology. 6 (5), 680–689.
Albrechtova J., Albrecht T., Dureje L., Pallazola V.A., Pialek J. 2014. Sperm morphology in two house mouse subspecies: Do wild-derived strains and wild mice tell the same story? PLoS One. 9 (12), e115669.
Yeung C.H., Anapolski M., Cooper T.G. 2002. Measurement of volume changes in mouse spermatozoa using an electronic sizing analyzer and a flow cytometer: validation and application to an infertile mouse model. J. Androl. 23 (4), 522–528.
Dickinson G.D., Ellefsen K.L., Dawson S.P., Pearson J.E., Parker I. 2016. Hindered cytoplasmic diffusion of inositol trisphosphate restricts its cellular range of action. Sci. Signal. 9 (453), ra108.
Samtleben S., Jaepel J., Fecher C., Andreska T., Rehberg M., Blum R. 2013. Direct imaging of ER calcium with targeted-esterase induced dye loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317.
Li Y.X., Rinzel J. 1994. Equations for InsP3 receptor-mediated [Ca²⁺]i oscillations derived from a detailed kinetic model: A Hodgkin-Huxley like formalism. J. Theor. Biol. 166 (4), 461–473.
De Young G.W., Keizer J. 1992. A single-pool inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-based model for agonist-stimulated oscillations in Ca²⁺ concentration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (20), 9895–9899.
Cai X., Li X., Qi H., Wei F., Chen J., Shuai J. 2016. Comparison of gating dynamics of different IP(3) R channels with immune algorithm searching for channel parameter distributions. Phys. Biol. 13 (5), 056005.
Li L.F., Xiang C., Zhu Y.B., Qin K.R. 2014. Modeling of progesterone-induced intracellular calcium signaling in human spermatozoa. J. Theor. Biol. 351, 58–66.
Vais H., Foskett J.K., Mak D.O. 2010. Unitary Ca²⁺ current through recombinant type 3 InsP3 receptor channels under physiological ionic conditions. J. Gen. Physiol. 136 (6), 687–700.
Olson S.D., Suarez S.S., Fauci L.J. 2010. A model of CatSper channel mediated calcium dynamics in mammalian spermatozoa. Bull. Math. Biol. 72 (8), 1925–1946.
Kadamur G., Ross E.M. 2013. Mammalian phospholipase C. Annu. Rev. Physiol. 75, 127–154.
Wang M., Weiss M., Simonovic M., Haertinger G., Schrimpf S.P., Hengartner M.O., von Mering C. 2012. PaxDb, a database of protein abundance averages across all three domains of life. Mol. Cell. Proteomics. 11 (8), 492–500.
De Pitta M., Goldberg M., Volman V., Berry H., Ben-Jacob E. 2009. Glutamate regulation of calcium and IP3 oscillating and pulsating dynamics in astrocytes. J. Biol. Phys. 35 (4), 383–411.
Sims C.E., Allbritton N.L. 1998. Metabolism of inositol 1,4,5-trisphosphate and inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate by the oocytes of Xenopus laevis. J. Biol. Chem. 273 (7), 4052–4058.
Baksh S., Michalak M. 1991. Expression of calreticulin in Escherichia coli and identification of its Ca²⁺ binding domains. J. Biol. Chem. 266 (32), 21458–21465.
Means S., Smith A.J., Shepherd J., Shadid J., Fowler J., Wojcikiewicz R.J., Mazel T., Smith G.D., Wilson B.S. 2006. Reaction diffusion modeling of calcium dynamics with realistic ER geometry. Biophys. J. 91 (2), 537–557.
Michalak M., Corbett E.F., Mesaeli N., Nakamura K., Opas M. 1999. Calreticulin: One protein, one gene, many functions. Biochem. J. 344 (Pt 2), 281–292.
Hoffman L., Chandrasekar A., Wang X., Putkey J.A., Waxham M.N. 2014. Neurogranin alters the structure and calcium binding properties of calmodulin. J. Biol Chem. 289 (21), 14644–14655.
Wennemuth G., Babcock D.F., Hille B. 2003. Calcium clearance mechanisms of mouse sperm. J. Gen. Physiol. 122 (1), 115–128.
Lytton J., Westlin M., Burk S.E., Shull G.E., MacLennan D.H. 1992. Functional comparisons between isoforms of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum family of calcium pumps. J. Biol. Chem. 267 (20), 14483–14489.
Vila A., Rosengarth A., Piomelli D., Cravatt B., Marnett L.J. 2007. Hydrolysis of prostaglandin glycerol esters by the endocannabinoid-hydrolyzing enzymes, monoacylglycerol lipase and fatty acid amide hydrolase. Biochemistry. 46 (33), 9578–9585.
Tyukhtenko S., Karageorgos I., Rajarshi G., Zvonok N., Pavlopoulos S., Janero D.R., Makriyannis A. 2016. Specific inter-residue interactions as determinants of human monoacylglycerol lipase catalytic competency: A role for global conformational changes. J. Biol. Chem. 291 (6), 2556–2565.
Liu Y., Roth J.P. 2016. A revised mechanism for human cyclooxygenase-2. J. Biol. Chem. 291 (2), 948–958.
Hwa J., Martin K. 2017. The Eicosanoids: Prostaglandins, Thromboxanes, Leukotrienes, & Related Compounds. In: Basic & Clinical Pharmacology. 14th ed. Ed. Katzung B.G. New York: McGraw-Hill Education.
Marshall F.H., Patel K., Lundstrom K., Camacho J., Foord S.M., Lee M.G. 1997. Characterization of [3H]‐prostaglandin E2 binding to prostaglandin EP4 receptors expressed with Semliki Forest virus. Br.J. Pharmacol. 121 (8), 1673–1678.