Effect of temperature on the coagulation activity of blood plasma in rainbow trout (Oncorhynchus Mykiss), common carp (Cyprinus Carpio) and the african catfish (Clarias Gariepinus) in vitro

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Data from coagulograms of rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792), african sharptooth catfish Clarias gariepinus (Burchell, 1822) and common scaly carp Cyprinus carpio (L., 1758) obtained by clotting methods at plasma incubation temperatures of 43°C, 40°C, 37°C, 24°C, 28°C and 18°C were analyzed. It was revealed that in catfish and carp the internal pathway predominates in the activation of blood coagulation, and in trout the main ones are the formation of a clot along the internal and general pathways. The amount of soluble fibrin-monomer complexes in trout is the highest of all fish studied. Hypo- and hypercoagulable states in the plasma hemostasis of the studied fish species in vitro were established at both low and high temperatures of the reaction medium. Fibrinogen and antithrombin III exhibit thermolabile at temperatures other than 37°C. Correlation and regression analysis showed that the most closely related to changes in temperature in carp are prothrombin time (PT), and the activity of fibrinogen and antithrombin III in catfish. A change in PT of 50% can be explained by the influence of the temperature factor, and the fibrinogen and antithrombin III activity by 77% and 52%, respectively. The identified patterns can become the basis for determining the boundaries of thermal adaptation of fish and developing biomarkers of heat stress.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Гемостаз – сложный защитный механизм сохранения жидкого состояния крови у позвоночных, включающий множественные взаимозависимые действия между тромбоцитами, эндотелием сосудов и плазменными белками. Плазменно-коагуляционное звено (вторичный гемостаз) представляет собой каскад протеолитических реакций, главная цель которого – формирование фибринового сгустка (Тюкавин, 2021). Очевидно, нарушения в одном или нескольких компонентах этой сложной системы могут приводить к обильным кровотечениям или тромбозам у животных.

Основные механизмы свертывания крови хорошо исследованы у высших животных и человека, но значительно меньше у низших позвоночных, в том числе у рыб. В связи с особенностями среды обитания и эволюционной ступени вопрос изучения основных механизмов их гемокоагуляции становится актуальным. Генетическая и эволюционная картины функционирования гемостатического каскада рыб достаточно полны (Jagadeeswaran, Sheehan, 1999; Jiang, Doolittle, 2003; Jagadeeswaran et al., 2007; Doolittle, 2009; Kim et al., 2009), а Danio rerio (Hamilton, 1822) используется как генетическая модель в современных медицинских коагулологических исследованиях (Jagadeeswaran et al., 2005). Также дана клинико-диагностическая характеристика свертывания крови некоторых видов костистых рыб (Doolittle, Surgenor, 1962; Van Vliet, 1985; Lewis, 1996; Tavares-Dias, Oliveira, 2009). Согласно этим данным, свертывание крови происходит по одной и той же фундаментальной схеме у всех позвоночных, а факторы свертывания крови рыб аналогичны таковым у млекопитающим, за исключением определенной степени видоспецифичности белков. Такая специфичность затрудняет количественное измерение многих компонентов свертывания крови и их качественную идентификацию. Также эти исследования выявили различия во времени свертывания и содержания определенных факторов свертывания крови у различных групп рыб и подчеркнули необходимость использования проверенных и однотипных процедур (например, природы используемого тромбопластина, вида лабораторной посуды) в исследованиях гемостаза этих гидробионтов.

Известно (Tavares-Dias, Oliveira, 2009; Жичкина и др., 2017), что время свертывания крови у рыб короче, чем у млекопитающих, вероятно, из-за высоких уровней некоторых компонентов коагуляции. Ускорителем процесса также может служить кожная слизь, в которой содержится, как предполагается, большое количество тромбопластина (тканевого фактора) (Кудряшов, 1960; Головина, 1996; Ботяжова, 2000; Жичкина, 2017). Важно отметить, что тромбоциты рыб играют центральную роль во внутреннем преобразовании протромбина в тромбин и ответственны за ретракцию сгустка (Doolittle, Surgenor, 1962; Doolittle, 2009).

Некоторые данные коагулограмм, полученных с помощью рутинных лабораторных скрининговых тестов, охватывают небольшое количество пресноводных видов: мозамбикская тиляпия Oreochromis mossambicus (Peters, 1852) (Smit, Schoonbee, 1988), карп обыкновенный Cyprinus carpio (L., 1758) (Fujikata, Ikeda, 1985a, 1985b, 1985с; Kawatsu, 1986; Kawatsu, Sato, 1987; Kawatsu, Kondo, 1989; Kawatsu et al., 1989, 1991; Jung, Kawatsu, 1994; Jung, Kawatsu, 1995a, 1995b; Березина, Фомина, 2022; Berezina, Fomina, 2022), радужная форель Onchorynchus mykiss (Walbaum, 1792) (Ruis, Bayne, 1997), нильская тиляпия Oreochromis niloticus (Peters, 1852) (Berezina, Fomina, 2022) и американский сомик Ameiurus nebulosus (Lesueur, 1819) (Langdell, 1965), а также морских видов рыб (Pavlidis et al., 1999). Перечисленные и другие исследования показывают, что свертывающая активность крови у рыб зависит от очень многих факторов: температуры, болезней, истощения, токсических веществ, актикоагулянтов, стресса. Наши исследования (Berezina, Fomina, 2022) подтверждают огромную вариабельность параметров коагуляции у рыб различных классов и видов и указывают на преобладание общего и внешнего путей активации гемокоагуляции у костно-хрящевых рыб (Chondrostei), тогда как функциональность внутреннего пути у костистых (Teleostei) варьируется между различными группами рыб. Важно подчеркнуть, что из-за отсутствия стандартизации используемых методик некоторые вопросы структурно-функциональной организации свертывания крови у рыб остаются открытым.

Исследование влияния температурного фактора на коагуляционную активность крови у рыб актуально по нескольким причинам: во-первых, в целях адаптации существующих скрининговых тестов, созданных в гуманной медицине; во-вторых, для уточнения знаний о реактивности коагуляционного ответа пойкилотермных рыб в ответ на гипо- и гипертермию.

Температура является вторым по важности после кислорода фактором водного образа жизни. Рыбы испытывают в природных условиях непрерывные колебания температуры, и воздействие колебаний температур на рыб может проявляться по-разному в зависимости от характера колебаний (Смит, 1986). В настоящих условиях потепления климата эвритермным и стенотермным рыбам необходимо справляться с постепенным повышением температуры среды обитания и с увеличением частоты резких колебаний температуры. Также рыбы могут подвергаться резкому понижению температуры воды в результате естественных или антропогенных термоклинов.

Биохимически катализируемые реакции в организме любого животного имеют тенденцию протекать медленнее при низких температурах и быстрее при более высоких, вплоть до начала денатурации белков, после чего скорость реакции быстро снижается (Evans et al., 2014). Помимо этого, тепловой стресс, как и любой другой вид стресса, у рыб сопровождается выделением гормонов стресса – кортизола и катехоламинов, адреналина и норадреналина. Наличию коагуляционных сдвигов под влиянием гормонов стресса у Cyprinus carpio и Oreochromis niloticus посвящены наши более ранние исследования (Berezina et al., 2020; Березина, 2021).

Кровь, в том числе система гемостаза, – наиболее лабильная система и достаточно быстро реагирует на различные изменения, происходящие в окружающей среде. Известно, что при повышении температуры тела у животных и человека происходит резкая активация свертывающей системы крови (Николаев, 2016), тогда как при снижении – регистрируют как гипер-, так и гипокоагуляционные сдвиги (Лычева и др., 2017). Предполагается, что ферменты, принимающие участие в свертывании крови рыб, способны работать в более широком диапазоне температур, чем у теплокровных видов, поскольку температура их тела тесно связана с изменчивой температурой воды (Ботяжова, 2000).

Цель данной работы – исследовать функциональное состояние плазменного гемостаза рыб стандартными клоттинговыми методами и установить закономерности в реагировании этой системы на воздействие термического фактора in vitro.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Подробной клинико-диагностической характеристике параметров коагулограммы посвящена наша более ранняя работа (Березина, Фомина, 2022).

Опыт проводили в региональном центре развития аквакультуры “АкваБиоЦентр” Вологодской Государственной молочно-хозяйственной академии им. Н.В. Верещагина. В исследовании использовали кровь здоровых особей радужной форели Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) (n = 15) массой 800–1000 г (без половой идентификации), выращенных в ООО “Аквакультура” (Моткозеро Белозерского р-на Вологодской обл.); здоровых особей африканского клариевого сома Clarias gariepinus (Burchell, 1822) (n = 10) массой 200–1000 г (без половой идентификации), выращенных в “АкваБиоЦентре” Вологодской государственной молочно-хозяйственной академии им. Н.В. Верещагина; особей обыкновенного чешуйчатого карпа Cyprinus carpio (n = 15) массой 800–1000 г (без половой идентификации), выращенных в рыбоводческом хозяйстве ООО “Рыботоварная фирма “Диана” (Вологодская обл.). Отбор проб крови проводили пункцией гемального канала в пробирки из силиконизированного стекла, содержащие 3.8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 1 : 9. Объектом исследования была бедная тромбоцитами плазма. До взятия крови рыб анестезировали, добавляя в воду гвоздичное масло в концентрации 0.033 мл/л (Hamackova et al., 2006) и выдерживая в ней 15 мин.

Для определения показателей плазменно-коагуляционного гемостаза рыб использовали коагулометр “Thrombostat” (Behnk Elektronik, Германия) со стандартным температурным режимом 37°С (Фомина и др., 2017) и термостат медицинский водяной ELMI TW-2 с установленными температурами: 43°C, 40°C, 28°C (для Clarias gariepinus), 24°C и 18°C. Применяли медицинские наборы: “Тромбо-тест”, “Техпластин-тест”, “АПТВ-тест”, “РФМК-тест планшетный вариант”, “Хромотех-Антитромбин” (ООО Технология-Стандарт, Россия) и активность фибриногена (НПО РЕНАМ, Россия). Все исследования проводили в соответствии с инструкциями к реагентам.

Данные представлены в виде среднего значения и его стандартной ошибки (M ± m). Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Шапиро–Уилка. Для оценки достоверности различий параметров между видами в парных независимых выборках использовали критерий Манна–Уитни, для различий параметров при разных температурах в множественных зависимых выборках – критерий Вилкоксона. Силу парной линейной связи между переменными оценивали при помощи непараметрического коэффициента корреляции Спирмана (R). Качественную интерпретацию силы связи между показателями коагулограммы и температурой инкубации плазмы выполняли на основе шкалы Чеддока. Влияние температурного фактора оценивали с помощью теоретического коэффициента детерминации (R2). Статистическую значимость коэффициентов корреляции проверяли с помощью статистического критерия Фишера (однофакторный дисперсионный анализ, One-way ANOVA) (Шихова, 2017).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе описания полученных результатов дан их сравнительный межвидовой анализ при стандартизированной для клоттинговых тестов температуре, равной 37°C. Нарушения конечного этапа свертывания (по общему пути) определяют с помощью измерения ТВ, а ПВ характеризует гемокоагуляцию по внешнему пути (путь тканевой активации). В процессе сравнения коагулограмм (табл. 1) достоверно выявлены крайне удлиненные ТВ и ПВ у африканского клариевого сома по сравнению с обыкновенным карпом и радужной форелью. Также достоверно высокие значения ПВ были получены у радужной форели (рис. 1а), однако ТВ оказалось наиболее коротким по сравнению с остальными видами рыб. Эффективность внутреннего (путь контактной активации) и общего путей свертывания, оцениваемая по АЧТВ, у радужной форели и обыкновенного карпа достоверно в 10 раз выше, чем у африканского клариевого сома (рис. 1в). Активность фибриногена – показатель, отражающий способность превращения фибриногена в фибрин под влиянием человеческого тромбина в условиях разной температуры. У обыкновенного карпа при 37°C эта активность была достоверно выше на 64% по сравнению с африканским клариевым сомом и на 28% по сравнению с радужной форелью (рис. 2а). Активность антитромбина III отражает способность этого белка инактивировать факторы свертывания. Антикоагуляционные свойства крови при 37°C у африканского клариевого сома достоверно на 79% более выражены по сравнению с обыкновенным карпом (рис. 2б).

 

Таблица 1. Коагулограмма рыб при различных температурах инкубации плазмы

Т

Вид

ТВ, с

ПВ, с

АЧТВ, с

Активность фибриногена, c

Активность антитромбина III, c

18 (а)

O. mykiss

91.76 ± 43.46#

>250#°б

34.64 ± 1.66#вд

–

–

C. gаriepinus

>1000*°

>1000*°

425.00 ± 73.06*°бвгд

>300°

–

C. cаrpio

10.99 ± 1.47#бвгд

23.27 ± 2.03*#бвгд

42.93 ± 4.94*#бвгд

28.17 ± 1.96#вг

45.20 ± 8.48бвг

24/28 (б)

O. mykiss

30.16 ± 1.16#вд

98.39±12.39#°авд

31.64 ± 7.20#°вд

21.39 ± 2.30#в

–

C. gаriepinus

>1000*°

>1000*°

189.46 ± 65.97*°а

>300*°

297.40 ± 57.03в

C. cаrpio

26.62 ± 5.18#авгд

11.47 ± 0.80*#авгд

25.73 ± 2.74*#авгд

25.83 ± 1.60#вгд

82.46 ± 10.77авгд

37 (в)

O. mykiss

15.87 ± 1.44#°бд

>250#°б

15.21 ± 0.43#абд

14.18 ± 2.85бс

–

C. gаriepinus

>1000*

>1000*°

153.88 ± 52.49*°а

7.03 ± 0.85*°г

3.70 ± 0.11°б

C. cаrpio

535.13 ± 127.76*абгд

212.74 ± 24.42#*абгд

14.22 ± 1.20#абг

19.65 ± 1.25#абд

17.84 ± 1.84#аб

40 (г)

C. gаriepinus

>1000°

>1000°

132.69 ± 68.39а°

33.24 ± 8.09в

–

C. cаrpio

187.97 ± 12.89#абвд

150.34 ± 13.01#абвд

11.00 ± 0.99#абв

18.55 ± 0.57абд

22.02 ± 2.42аб

43 (д)

O. mykiss

12.84 ± 0.90#°бв

>250#°б

>250#°абв

–

–

C. gаriepinus

>1000*°

>1000*°

96.70 ± 26.60*°а

74.35 ± 2.96°

–

C. cаrpio

90.77 ± 10.39*#абвг

670.93 ± 49.43*#абвг

14.27 ± 1.43*#аб

26.02 ± 2.66#бвг

27.95 ± 5.73б

Примечание. T – температура инкубации плазмы, °C; а–д – значимые различия между значениями при разных температурах инкубации плазмы (p ≤0.05).

* – значимые различия со значением Oncorhynchus mykiss (p ≤0.05), # – значимые различия со значением C. gаriepinus (p ≤0.05); ° – значимые различия со значением Cуprinus cаrpio (p ≤0.05).

 

 

Рис. 1. ПВ (а), ТВ (б) и АЧТВ (в) при различных температурах инкубации плазмы. 1 – Oncorhynchus mykiss, 2 – Clarias gariepinus, 3 – Cyprinus carpio.

 

Рис. 2. Активность фибриногена (а) и антитромбина III (б) у рыб при различных температурах инкубации плазмы. Обозначения, как на рис. 1.

 

На втором этапе анализа наблюдений определен коагулологический ответ на изменение температуры реакционной среды (плазмы) у рыб с различным термобиологическим статусом. Анализируя свертывающую активность крови радужной форели, можно проследить ускорение ТВ по мере увеличения температуры инкубации в 7.1 раза. При исследовании ПВ зарегистрировано отсутствие или крайне сильное удлинение процесса свертывания как при увеличении, так и при уменьшении температуры инкубации. Длительность АЧТВ у этого вида рыб при минимальной температуре 18°C в 2.2 раза больше, чем при стандартной для данной методики (37°C), а при наивысшей (43°C) можно наблюдать неактивность коагуляционных процессов. Скорость преобразования фибриногена у радужной форели оценивали при 24°C и 37°C, разница между которыми заключалась в замедлении этого процесса на 33% из-за уменьшения температуры инкубации.

Динамика ТВ и ПВ в ответ на изменение температурной среды у африканского клариевого сома in vitro отсутствовала. Самое длительное АЧТВ зафиксировано при температуре 18°C, и прямо пропорционально ускорялось по мере увеличения температуры до 43°C, образовав разницу в 4.4 раза. Аналогичная картина характерна и для активности фибриногена. При низких температурах активность фибриногена была чрезвычайно низкой, и крайнее ускорение перехода этого белка в нерастворимую форму происходило с повышением температуры инкубации от общеупотребимой (37°C), разница была в 10.5 раз. Активность антитромбина (АТ III) при 28°С в 80.3 раза превышала таковую при стандартной температуре (37°C).

В плазме обыкновенного карпа возникал комплекс гипер- и гипокоагуляционных реакций в процессе изменения температуры. Самое длительное ТВ зафиксировано при стандартной температуре (37°C), тогда как с ее уменьшением до 18°C или увеличением до 43°C оно сокращалось в 49 и 6 раз соответственно. Также отмечено общее удлинение ПВ от низких температур к высоким в 29 раз. Напротив, АЧТВ в 3 раза сокращалось с повышением температуры инкубации плазмы, минимум зафиксирован при 40°C. Активность фибриногена при падении или подъеме температуры линейно снижалась на 30.2 и 24.4% соответственно относительно минимума при 37°C. Наибольшую активность антитромбин III у обыкновенного карпа проявлял в диапазоне 18–24°C, наименьшую – в 37–43°C.

Также выявлена разница в содержании промежуточных продуктов распада фибринового сгустка вследствие фибринолиза, называемых фибрин-мономерными комплексами (РФМК). Их количество, определенное при температуре 22–24°C, у радужной форели и карпа достигало 91.76 ± 43.46 и 7.47 ± 1.09 соответственно. Количество РФМК форели было достоверно наибольшим из всех исследованных нами ранее рыб (Berezinа, Fomina, 2022). В крови сома зафиксировано отсутствие РФМК.

На третьем этапе обработки данных выявлена связь параметров коагулограммы с температурным фактором, и оценены качество и значимость полученных корреляций. Корреляционно-регрессионный и однофакторный дисперсионный анализы показали, что степень влияния температурного фактора на изучаемые параметры у разных видов рыб неодинакова и разнонаправлена. Наиболее тесные (R = 0.7–0.9) достоверные зависимости были получены у двух видов рыб: положительная связь между температурой и ПВ у обыкновенного карпа (R = 0.8), а также отрицательная связь между температурой и активностью фибриногена (R = –0.7) и антитромбина III (R = –0.8) у африканского клариевого сома. У форели тесных достоверных связей не было выявлено. Поля указанных корреляций даны на рис. 3. Основываясь на полученных зависимостях и теоретическом коэффициенте детерминации, можно утверждать, что ПВ у карпа на 50% зависит от температуры инкубации плазмы. Для показателей активности фибриногена и антитромбина III сома были характерны доли влияния температуры в 77 и 52% соответственно.

 

Рис. 3. Регрессионная модель корреляции между температурой инкубации плазмы и ПВ у Cyprinus carpio (1), активностью фибриногена (2) и антитромбина III (3) у Clarias gariepinus.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При интерпретации полученных данных необходимо учитывать, что не существует стандартизированных температурных условий при проведении коагулологических анализов у рыб. По-видимому, следует принимать “зону температурного комфорта” того или иного вида как более корректную при оценке физиологических реакций. Для форели она находится в пределах 10–18°C (Григорьев, Седова, 2008), для обыкновенного карпа – 20–24°C (Oyugi et al., 2012), и для африканского клариевого сома – 25–30°C (Ярмош, 2020). Однако при проведении сравнительных межвидовых исследований актуален вопрос, какую температуру инкубации принимать как стандартную с учетом подтвержденной термальной реактивности коагуляционных процессов. Вместе с тем, в исследованиях гемостаза важен правильный подбор лабораторной посуды (Kawatsu, 1986; Smit, Schoonbee, 1988) и вида тканевого фактора, из-за которых получаемые значения могут различаться (Langdell, 1965; Kawatsu, Kondo, 1989). Например, множество авторов подчеркивают, что использование тромбопластина мозга рыб в исследованиях сильно ускоряет формирование сгустка (Smit, 1988; Lewis, 1996; Pavlidis et al., 1999; Tavares-Dias, Oliveira, 2009).

С учетом настоящих и наших предыдущих исследований (Березина, Фомина, 2022) неактивность коагуляционного гемостаза у африканского клариевого сома весьма сходна с таковой обыкновенного карпа, где ТВ и ПВ были достаточно длинными. Короткое относительно них АЧТВ свидетельствует о преобладании внутренней активации свертывания. Исходя из данных коагулограммы форели, активность гемостаза по общему пути у форели является основной. Нельзя точно сказать о видоспецифичности строения собственных белков каскада коагуляции (тканевый фактор, тромбин) исследованных видов рыб, поскольку воздействие стресса (Березина, 2021) показало активацию коагуляционного процесса у карпа и тиляпии с использованием тех же реактивов. Однако при использовании аутореагентов вероятно ускорение свертывания.

В описании методик исследований гемокоагуляции у рыб температура инкубации в основном устанавливается согласно утвержденной для медицинских наборов (37°С), либо равна комнатной (22–24°С) или вовсе не указывается, однако есть немногочисленные данные о вариативности температур. Известно, что кровь антарктических рыб, способных жить при температуре ~0°С (Pagothenia borchgrevinki и Salmo gairdnerii), быстро сворачивается в холоде, и скорость свертывания увеличивается при нагреве до 25°С, после чего процесс свертывания инактивируется (Feeney et al., 1972). В этой же работе указано, что наименьшее время коагуляции у Cуprinus carpio – при температуре от 26°C до 42°C, после чего процесс прекращается. В работе (Langdell et al., 1965) авторы, определяя коагуляционную активность крови Ameiurus nebulosus при 28°C, отмечают, что плазма рыбы быстро разрушается при более высоких температурах. Также, помимо времени свертывания крови, имеются описания коагулограмм рыб (ПВ, АЧТВ, время рекальцификации). По данным (Kawatsu, 1986), цитратная плазма Cуprinus carpio теряет свертывающую активность в течение 12 ч при инкубации при 37°C, тогда как при 25°C свертывающая активность поддерживается в течение долгих часов. Автор делает вывод о хорошо развитом внутреннем пути активации коагуляции у карпа и предполагает наличие двух или более термолабильных факторов свертывания крови в его плазме, которые быстро разрушаются при высокой температуре. В работе (Smit, Schoobee, 1988) не выявлено различий в активности протромбина у Oreochromis mossambicus и Cyprinus carpio при 25°C и 34°C.

Повышение свертывающей активности крови (времени свертывания) также было зафиксировано в результате воздействия теплового стресса на Oreochromis mossambicus и объяснено увеличением количества тромбоцитов и катализом превращения фибриногена в фибрин (Zaragoza et al., 2008). Аналогичные изменения в гемокоагуляции Oncorhynchus mykiss под влиянием термического шока и других стрессоров отмечают другие авторы (Ruis, Bayne, 1997). Судя по этим данным, система свертывания крови также участвует в общей реакции рыб на стресс. Фактическая кровопотеря, по-видимому, не является необходимой для повышения активности механизма гемостаза. Внутрисосудистое свертывание крови – проблема, встречающаяся у млекопитающих из-за дисфункции противосвертывающих и фибринолитических механизмов, может быть особенно важной и в белых мышцах рыб с плохой перфузией, где тромбообразование способно усугубляться застоем крови. Об этом свидетельствует сохранение гиперкоагуляции у Salmo gairdneri в течение 5 ч после действия стрессора при нормальном уровне тромбоцитов (Casillas, Smith, 1977). В обоих исследованиях авторы приходят к заключению, что изменения в свертывающей системе крови служат чувствительными индикаторами сублетальных стрессов у рыб.

Наши наблюдения частично подтверждают вышеуказанные эффекты у млекопитающих и рыб. Обобщенные данные свидетельствуют об активации свертывающих процессов при нагреве реакционной среды по общему и внутреннему путям коагуляции у форели, и только по внутреннему – у сома и карпа. В то же время, увеличение температуры плазмы угнетает свертывание (гипокоагуляция) по общему и внешнему путям у карпа. Крайне высокие (43°C) температуры инактивируют или сильно замедляют активацию гемостаза по внутреннему пути у форели, а относительно быстрое превращение протромбина в тромбин у этого вида рыб происходит исключительно при 24°C. Наибольшая активность фибриногена и антитромбина у всех видов рыб наблюдается при ~37°C, отклонение от нее приводит к угнетению разной степени, что, вероятно, вызвано частичным разрушением этих белков или видоспецифичностью тромбина, используемого в лабораторных тестах.

Учитывая вышеизложенное, очевидно, что изменение климата негативно повлияет на продуктивность рыб, увеличивая частоту экстремальных температурных явлений, которые будут иметь острые физиологические последствия. В это число входит также дисбаланс функционирования системы гемостаза и других параметров гемодинамики.

Полученные экспериментальные данные, характеризующие реактивность плазменного гемостаза рыб, можно использовать для разработки лабораторных клоттинговых тестов, адаптированных для экологии, ихтиологии и рыбоводства. Выявленные закономерности, если они будут подтверждены in vivo, также послужат основой для более глубокого понимания термоустойчивости организма рыб и разработки биомаркеров теплового стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При определении гемостатического статуса лабораторными скрининговыми методами установлено, что у африканского клариевого сома и обыкновенного карпа в активации свертывания крови преобладает внутренний (контактный) путь, у радужной форели активация идет по общему и внутреннему путям. Количество промежуточных продуктов распада фибринового сгустка вследствие фибринолиза у форели наибольшее из исследованных рыб, у сома они отсутствуют. Также описанные гемостазиологические картины свидетельствуют о выраженном влиянии температуры на активность коагуляции in vitro. При нагреве она растет или снижается у всех видов рыб с различной выраженностью ответа тех или иных механизмов. Крайне высокие температуры инактивируют или сильно замедляют активацию гемостаза по внутреннему и внешнему путям у форели и по внешнему – у карпа. Вместе с тем, фибриноген и антитромбин III проявляют термолабильность при температурах, отличных от 37°C. Выявлены наиболее зависимые от температуры реакционной среды параметры коагулограммы: тесная положительная связь протромбинового времени с нагревом у карпа, (причем изменение этого параметра на 50% можно объяснить влиянием температурного фактора); тесная отрицательная связь активности фибриногена и антитромбина у сома – эти параметры на 77 и 52% соответственно зависят от температуры. Выявленные закономерности следует учитывать при определении границ термоустойчивости рыб и разработки биомаркеров теплового стресса.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование проведено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 23-26-00115, https://rscf.ru/project/23-26-00115.

×

About the authors

D. I. Berezina

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Vologda State Dairy Farming Academy by N.V. Vereshchagin"

Author for correspondence.
Email: vetxwork@gmail.com
Russian Federation, Vologda

L. L. Fomina

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Vologda State Dairy Farming Academy by N.V. Vereshchagin"

Email: vetxwork@gmail.com
Russian Federation, Vologda

T. S. Kulakova

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Vologda State Dairy Farming Academy by N.V. Vereshchagin"

Email: vetxwork@gmail.com
Russian Federation, Vologda

K. E. Modanova

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Vologda State Dairy Farming Academy by N.V. Vereshchagin"

Email: vetxwork@gmail.com
Russian Federation, Vologda

V. V. Popova

Limited Liability Company “Aquaculture”

Email: vetxwork@gmail.com
Russian Federation, Cherepovets

References

  1. Березина Д.И. 2021. Гематологические показатели рыб при индуцированном стрессе: Дис. ... канд. биол. наук: 06.02.01. Вологда; Молочное.
  2. Березина Д.И., Фомина Л.Л. 2022. Влияние аналогов кортизола на показатели вторичного гемостаза карпа Cyprinus cаrpio // Биология внутр. вод. № 5. С. 586. https://doi.org/10.31857/S0320965222050047
  3. Ботяжова О.А. 2000. Физиология системы крови: сравнительные, экологические и эволюционные аспекты: Уч. пособие. Ярославль: Ярослав. гос. ун-т.
  4. Головина Н.А. 1996. Морфофункциональная характеристика крови рыб – объектов аквакультуры: Дис. ... докт. биол. наук: 03.00.10. М. 228 с.
  5. Григорьев С.С., Седова Н.А. 2008. Перспективы товарного лососеводства на Камчатке // Рыбоводство и рыбное хозяйство. № 12. С. 2.
  6. Жичкина Л.В., Карпенко Л.Ю., Касумов М.К., Скопичев В.Г. 2017. Физиология рыб. Книга 1. Физиология крови и кровообращения рыб. Иммунная система рыб. СПб.: Квадро.
  7. Кудряшов Б.А. 1960. Проблемы свертывания крови и тромбообразования. М.: Высш. шк.
  8. Лычева Н.А., Шахматов И.И., Киселев В.И. 2017. Влияние среды охлаждения на состояние системы гемостаза у крыс // Бюллетень сибирской медицины. Вып. 16(1). С. 50.
  9. Николаев В.Ю. 2016. Состояние системы гемостаза при общем перегревании у крыс: Дис. ... канд. мед. наук: 03.03.01. Барнаул.
  10. Смит Л.С. 1986. Введение в физиологию рыб: сокращ. пер. с англ. В.И. Лапина. М.: Агропромиздат. (Smith L.S. 1982. Introduction to fish physiology. TFH.).
  11. Тюкавин А.И., Черешнев В.А., Яковлев В.Н., Гайворонский И.В. 2021. Физиология с основами анатомии: Учебник. М.: ИНФРА-М.
  12. Фомина Л.Л., Кулакова Т.С., Березина Д.И. 2017. Определение активности плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза рыб клоттинговыми методами с использованием коагулометра // Актуальные вопросы вет. биологии. Т. 35. № 3. С. 54.
  13. Шихова О.А. 2017. Математическая биостатистика: Методические указания и индивидуальные задания. Вологда; Молочное: ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА.
  14. Ярмош В.В. 2020 Клариевый сом – перспективный объект индустриального рыбоводства: монография. Пинск: ПолесГУ.
  15. Berezina D.I., Fomina L.L., Goreva A.D. 2020. Effect of stress factors on the coagulogram of common carp, Cyprinus carpio // Biosci. Biotechnol. Res. Asia. V. 17. № 3. P. 629.
  16. Berezinа D.I., Fominа L.L. 2022. Compаrаtive physiologicаl аspects of plаsmа hemostаsis of some commerciаl fish species // Egyptiаn J. Аquаt. Biol. аnd Fish. V. 25. № 6. P. 33.
  17. Casillas E., Smith L.S. 1977. Effect of stress on blood coagulation and haematology in rainbow trout (Salmo gairdneri) // J. Fish Biol. V. 10(5). P. 481.
  18. Doolittle R.F., Surgenor D.M. 1962. Blood coаgulаtion in fish // Аmer. J. Physiol.–Legаcy Content. V. 203. № 5. P. 964.
  19. Doolittle R.F. 2009. Step–by–step evolution of vertebrаte blood coаgulаtion // Cold Spring Hаrbor Lаborаtory Press. V. 74. P. 35.
  20. Evans D.H., Claiborne J.B., Currie S. 2014. The physiology of fishes. USA, FL. CRC Press.
  21. Feeney R.E., Vаndenheede J., Osugа D.T. 1972. Mаcromolecules from cold-аdаpted аntаrctic fishes // Die Nаturwissenschаften. V. 59. № 1. P. 22.
  22. Fujikаtа А., Ikedа Y. 1985b. Effect of hаndling on blood coаgulаtion in cаrp (Cyprinus cаrpio) // Bull. Jаpаnese Soc. Sci. Fish. V. 51. P. 1093.
  23. Fujikаtа А., Ikedа Y. 1985c. Relаtion between blood–coаgulаtion аnd thrombocyte in cаrp // Bull. Jаpаnese Soc. Sci. Fish. V. 51. № 10. P. 1613.
  24. Fujikаtа А., Ikedа Y. 1985а. Blood–coаgulаtion аnd clotting tests in cаrp // Bull. Jаpаnese Soc. Sci. Fish. V. 51. № 6. P. 933.
  25. Hаmаckovа J., Kouril J., Kozаk P., Stupkа. Z. 2006. Clove oil аs аn аnаesthetic for different freshwаter fish species // Bulgаriаn J. Аgricult. Sci. V. 12. № 2. P. 185.
  26. Jiаng Y., Doolittle R.F. 2003. The evolution of vertebrаte blood coаgulаtion аs viewed from а compаrison of puffer fish аnd seа squirt genomes // Proceedings of the Nаtionаl Аcаdemy of Sciences. V. 100. № 13. P. 7527.
  27. Jung S.H., Kаwаtsu H. 1994. Russell's viper venom clotting time of common cаrp plаsmа // Fisheries Science. V. 60. № 5. P. 511.
  28. Jung S.H., Kаwаtsu H. 1995а. Аnticoаgulаnt Effects of Wаrfаrin in the Common Cаrp // Fisheries Sci. V. 61. № 4. P. 653.
  29. Jung S.H., Kаwаtsu H. 1995b. Effects of the herbicide molinаte on Russell's viper venom clotting time аnd chromogenic substrаte аssаy for fаctor x in the plаsmа of common cаrp, Cyprinus cаrpio // Аquаculture Sci. V. 43. № 1. P. 153.
  30. Jаgаdeeswаrаn P., Gregory M., Dаy K. et аl. 2005. Zebrаfish: а genetic model for hemostаsis аnd thrombosis // J. Thromb. аnd Hаemost. V. 3. № 1. P. 46.
  31. Jаgаdeeswаrаn P., Kulkаrni V., Cаrrillo M. et аl. 2007. Zebrаfish: from hemаtology to hydrology // J. Thromb. аnd Hаemost. V. 5. № 1. P. 300.
  32. Jаgаdeeswаrаn P., Sheehаn J.P. 1999. Аnаlysis of blood coаgulаtion in the zebrаfish // Blood Cells, Molecules, аnd Diseаses. V. 25. № 4. P. 239.
  33. Kim S., Cаrrillo M., Kulkаrni V. et аl. 2009. Evolution of primаry hemostаsis in eаrly vertebrаtes // PLoS ONE. V. 4. № 12. e8403.
  34. Kаwаtsu H. 1986. Clotting time of common cаrp blood // Bull. Jаpаnese Soc. Sci. Fish. V. 52. № 4. P. 591.
  35. Kаwаtsu H., Kondo K., Kubono K. 1989. Hemostаtic disorder in common cаrp induced by exposure to the herbicide molinаte // Nippon Suisаn Gаkkаishi. V. 55. № 5. P. 779.
  36. Kаwаtsu H., Kubono K., Wаkаbаyаshi T. 1991. Effect of orаl аdministrаtion of wаrfаrin on blood coаgulаtion in the common cаrp // Nippon Suisаn Gаkkаishi. V. 57. № 4. P. 619.
  37. Kаwаtsu H., Sаto M. 1987. Effect of glаss contаct on the clotting time of cаrp blood // Nippon Suisаn Gаkkаishi. V. 53. № 9. P. 1533.
  38. Kаwаtsu H., Kondo K. 1989. Prothrombin time of common cаrp blood // Nippon Suisаn Gаkkаishi. V. 55. № 1. P. 183.
  39. Lewis J.H. 1996. Compаrаtive hemostаsis in vertebrаtes. N.Y.: Springer Science & Business Mediа.
  40. Lаngdell R.D., Bryаn F.T., Gibson Jr.W.S. 1965. Coаgulаtion of cаtfish blood // Proceedings of the Society for Experimentаl Biology and Medicine. V. 118. № 2. P. 439.
  41. Oyugi D.O., Cucherousset J., Bаker D.J. et аl. 2012. Effects of temperаture on the forаging аnd growth rаte of juvenile common cаrp, Cyprinus cаrpio // J. Thermаl Biol. V. 37. № 1. P. 89.
  42. Pаvlidis M., Berry M., Kokkаri C., Kentouri M. 1999. Prothrombin time, аctivаted pаrtiаl thromboplаstin time аnd fibrinogen vаlues in Mediterrаneаn mаrine teleosts // Fish Physiol. аnd Biochem. V. 21. № 4. P. 335.
  43. Ruis M.А.W., Bаyne C.J. 1997. Effects of аcute stress on blood clotting аnd yeаst killing by phаgocytes of rаinbow trout // J. Аquаt. Аnim. Heаlth. V. 9. № 3. P. 190.
  44. Smit G.L., Schoonbee H.J. 1988. Blood coаgulаtion fаctors in the freshwаter fish Oreochromis mossаmbicus // J. Fish Biol. V. 32. № 5. P. 673.
  45. Tаvаres-Diаs M., Oliveirа S.R. 2009. А review of the blood coаgulаtion system of fish // Revistа Brаsileirа de Biociênciаs. V. 7. № 2. P. 205.
  46. Vаn Vliet K.J., Smit G.L., Pieterse J.J. et аl. 1985. Thromboelаstrogrаphic diаgnosis of blood coаgulаtion in two freshwаter fish species // Comp. Biochem. Physiol. V. 82А. № 1. P. 19.
  47. Zaragoza O.D.R., Rodríguez M.H., Bückle Ramirez L.F. 2008. Thermal stress effect on tilapia Oreochromis mossambicus (Pisces: Cichlidae) blood parameters // Mar. Freshwater Behav. and Physiol. V. 41(2). P. 79.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. PT (a), TT (b) and APTT (c) at different plasma incubation temperatures. 1 – Oncorhynchus mykiss, 2 – Clarias gariepinus, 3 – Cyprinus carpio.

Download (739KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Fibrinogen (a) and antithrombin III (b) activity in fish at different plasma incubation temperatures. Designations as in Fig. 1.

Download (356KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Regression model of correlation between plasma incubation temperature and PT in Cyprinus carpio (1), fibrinogen (2) and antithrombin III (3) activity in Clarias gariepinus.

Download (159KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 The Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».