CAR beyond the classical CAR-T: functional features and application prospects (review)

Full Text

Принятые сокращения: РТПХ – реакция «трансплантат против хозяина»; СВЦ – синдром выброса цитокинов; ТКР – T-клеточный рецептор; CAR – химерный антигенный рецептор; CAR-M – макрофаги, экспрессирующие CAR; CBCR – химерные B-клеточные рецепторы; CIK – цитокин-индуцированные киллеры; DC – дендритные клетки; DN T-клетки – двойные негативные T-клетки; iPSC – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; FDA – Управление по надзору за продуктами и лекарствами; GD2 – дисиалоганглиозид; MAIT – ассоциированные со слизистыми инвариантные T-клетки; MHC – главный комплекс гистосовместимости; NK – естественные киллеры; NKT-клетки – естественные киллерные T-клетки; iNKT – инвариантные NKT-клетки; NSCAR – несигнализирующий CAR; Treg – T-регуляторные клетки.

Введение

Химерный рецептор, состоящий из вариабельного иммуноглобулинового домена и константных участков Т-клеточного рецептора (ТКР), был впервые создан в 1987 г. [1]. В этом исследовании химерный рецептор, распознающий бактериальный антиген фосфорилхолин, был экспрессирован на T-лимфобластных клетках линии EL4. Первые T-лимфоциты, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы (chimeric antigen receptor, CAR), были получены в 1993 г. [2]. CAR, созданный в этом исследовании, распознает 2,4,6-тринитрофенол и относится к числу рецепторов первого поколения. Он состоит из внеклеточного антигенраспознающего одноцепочечного вариабельного фрагмента scFv (single-chain variable fragment), который соединен трансмембранным участком с внутриклеточным сигнальным доменом CD3ζ, входящим в состав эндогенного ТКР [3]. CAR-T-клетки, экспрессирующие рецептор первого поколения, оказались недостаточно эффективными в уничтожении злокачественных клеток, так как, несмотря на выраженные цитотоксические свойства, быстро переходили в истощенное состояние [4]. В 2002 г. были получены CAR второго поколения, в которых между сигнальным и трансмембранным доменом находился костимуляторный домен CD28 [5]. CAR-T-клетки второго поколения, направленные против антигена CD19, показали свою эффективность в распознавании и элиминации В-клеточных опухолей в мышиной модели [6]. С тех пор активно ведутся разработки CAR-T-лимфоцитов, направленных на различные опухолеассоциированные антигены.

Особенно эффективно подход CAR-T показал себя в терапии онкогематологических заболеваний. По состоянию на 2023 г., Управление по надзору за продуктами и лекарствами (Food and Drug Administration, FDA) одобрило шесть CAR-T-клеточных терапевтических препаратов, направленных на лечение B-клеточных неоплазий [7]. На данный момент продукты CAR-T, успешно прошедшие клинические испытания и одобренные FDA, основаны на CAR второго поколения, содержащих в качестве костимуляторных доменов сигнальные домены CD28 или 4-1BB. Тем не менее на стадии клинических исследований и разработок находятся различные варианты CAR-T-терапии, химерный рецептор в которых состоит из различных иммуномодулирующих доменов. В частности, созданы рецепторы CAR третьего поколения, содержащие два костимуляторных домена, однако их применение в клинике ограничено выраженными побочными эффектами. В случае химерных рецепторов четвертого поколения CAR-T-клетки, помимо CAR, экспрессируют цитокины, которые увеличивают персистенцию CAR-T-клеток в опухолевом микроокружении [8].

Несмотря на значительные успехи CAR-T-терапии в лечении онкогематологических заболеваний, у этого подхода есть ряд недостатков. Терапия становится неэффективной при утрате злокачественными клетками опухолевого антигена, на который были нацелены химерные рецепторы [8]. Кроме того, в случае солидных опухолей CAR-T-клетки зачастую не могут инфильтрировать опухоль и распознать антиген. Более того, на цитотоксическую функцию CAR-T-клеток значительно влияет иммуносупрессивное опухолевое микроокружение, поэтому в настоящее время прогресс в терапии солидных опухолей с помощью подхода CAR-T ограничен [9]. Наконец, выделение провоспалительных цитокинов активированными CAR-T-клетками может приводить к тяжелым побочным эффектам, таким как синдром выброса цитокинов (СВЦ) и нейротоксичность [10]. В целом, и СВЦ, и нейротоксичность обусловлены быстрой активацией и пролиферацией T-клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины. Как правило, подобный ответ развивается в течение недели после введения CAR-T-клеток. Предполагается, что чрезмерное выделение провоспалительных цитокинов повышает проницаемость капилляров в головном мозге, что может привести к тяжелым неврологическим симптомам и даже смерти. Тем не менее молекулярные механизмы нейротоксичности, развивающейся в результате CAR-T-терапии, окончательно не выяснены [10]. Нередко тяжелые побочные эффекты CAR-T-терапии обусловлены недостаточной регуляцией активности CAR-T-клеток, которые иногда могут активироваться даже при отсутствии антигенного стимула [11].

Для преодоления указанных трудностей ведется разработка новых стратегий для создания CAR-T-клеток [12, 13]. Кроме того, активно исследуется возможность применения других, отличных от Т-клеток, лейкоцитов в роли клеток, несущих CAR (рис. 1). На сегодняшний день клетки, экспрессирующие CAR, были получены из γδ T-клеток, регуляторных T-клеток, ассоциированных со слизистыми инвариантных T-клеток (MAIT), двойных негативных (DN) T-клеток, естественных киллеров (NK), естественных киллерных T-клеток (NKT-клеток), цитокин-индуцированных киллеров (CIK), макрофагов, дендритных клеток (DC) и даже B-лимфоцитов.

 

Рис. 1. Преимущества и недостатки использования различных типов клеток при создании клеточных продуктов, несущих CAR. ТКР – Т-клеточный рецептор; CAR – химерный антигенный рецептор; NKG2D – активирующий рецептор; MR1 – неканонический главный комплекс гистосовместимости, близкий к I классу; CD1 – неканонический главный комплекс гистосовместимости, близкий к I классу

 

Доклинические исследования показали, что у многих альтернативных иммунных CAR-клеток при высокой противоопухолевой активности многие недостатки CAR-T выражены в меньшей степени либо полностью отсутствуют. Тем не менее на текущий момент такие CAR-клетки недостаточно изучены: лишь для нескольких препаратов такого рода запущены клинические испытания, находящиеся на I/II фазах, или доступны данные доклинических исследований, остальные варианты терапии находятся на стадии разработки. В этом обзоре будут подробно освещены особенности функционирования CAR в разных группах иммунных клеток, а также результаты имеющихся доклинических и клинических исследований.

CAR в иммунных клетках разных типов

Ниже будут рассмотрены особенности разных типов иммунных клеток, которые могут быть использованы в разработке новых подходов CAR-опосредованной иммунотерапии. Также будут освещены актуальные результаты доклинических и, при наличии, клинических исследований по экспрессии и эффективности CAR в разных типах иммунных клеток.

Естественные киллеры или NK-клетки (от natural killers) относятся к числу клеток врожденного иммунитета лимфоидного ряда. На долю NK-клеток приходится около 10% лимфоцитов периферической крови [14]. В отличие от T-лимфоцитов, они распознают злокачественные и инфицированные клетки организма с помощью множества неполиморфных активирующих и ингибирующих рецепторов, и направленность ответа NK-клетки в каждом случае – это результат баланса сигналов. Если по совокупности сигналы от активирующих рецепторов перевешивают таковые от ингибирующих рецепторов, то NK-клетка лизирует клетку-мишень. NK-Клетки экспрессируют на своей поверхности множество активирующих и ингибирующих рецепторов, важнейшими среди которых являются рецепторы, распознающие главный комплекс гистосовместимости (main histocompatibility complex) MHC I и MHC I-подобные молекулы. Те клетки организма, которые экспонируют эти молекулы, воспринимаются NK-клетками как здоровые [15]. Отметим, что эритроциты не несут на своей поверхности ни активирующих, ни ингибирующих лигандов для рецепторов NK-клеток, и потому не распознаются ими как мишень. Помимо MHC, NK-клетки могут узнавать и другие лиганды на поверхности клеток, в частности, маркеры стресса MICA, MICB и UL16BP1 благодаря специальным рецепторам, к числу которых относится, например, рецептор NKG2D, присутствующий также на поверхности γδ T-клеток [16]. Кроме того, благодаря экспрессии FcγRIIIa NK-клетки могут распознавать и убивать клетки, опсонизированные антителами [17].

Цитотоксические функции NK-клеток реализуются благодаря формированию иммунологического синапса между NK-клеткой и клеткой-мишенью и последующей секреции литических гранул с гранзимом. Кроме литических гранул, NK-клетка может убивать клетку-мишень с помощью FasL и TRAIL, запуская ее программируемую гибель. Наконец, активированные NK-клетки выделяют ряд провоспалительных цитокинов, в частности интерферона γ (IFNγ) и фактора некроза опухолей (TNF) [14].

Выраженные цитотоксические свойства, а также отсутствие, в отличие от T-клеток, необходимости в представлении антигенов в контексте MHC для распознавания клеток-мишеней способствовали развитию противораковой терапии, основанной на генетически модифицированных NK-клетках, в том числе экспрессирующих CAR. В большинстве имеющихся исследований NK-клетки были трансдуцированы конструктами CAR, изначально разработанными для CAR-T-терапии. Помимо костимуляторных доменов CD28 и 4-1BB, некоторые из экспрессированных в NK-клетках CAR содержат костимуляторный домен 2B4 (рис. 2). Исходно рецептор 2B4 относится к числу активирующих рецепторов NK-клеток семейства SLAM (signaling lymphocytic activation molecule). Важно отметить, что конструкты CAR, изначально созданные для экспрессии в T-клетках, функционируют в NK-клетках благодаря общности сигнальных путей, контролирующих активацию клеток обеих групп. В частности, передача сигнала от некоторых активирующих рецепторов NK-клеток происходит при участии CD3ζ – сигнального домена CAR, предназначенных для T-клеток [18]. Отмечено, что NK-клетки, трансдуцированные CAR второго поколения с 2B4, направленным против CD5, отличаются от NK-клеток с CAR, содержащим CD28, повышенной цитотоксической активностью в отношении злокачественных клеток, быстрой пролиферацией и усиленной продукцией цитокинов [19]. Кроме того, в роли сигнального домена в составе CAR для NK-клеток, помимо домена CD3ζ, используют домены DAP10 и DAP12. Эти домены задействованы в передаче сигнала от ряда активирующих рецепторов NK-клеток. Показано, что конструкты с доменом CD3ζ превосходят таковые с DAP10 по силе индуцируемой противоопухолевой активности, но уступают конструктам с DAP12 [20, 21]. Cifaldi et al. [22] предложили использовать DNAM-1 в составе химерного рецептора, адаптированного под NK-клетки. DNAM-1 распознает лиганды PVR и нектин-2, присутствующие на инфицированных вирусами и многих злокачественных клетках. Рецепторы, включающие, помимо DNAM-1, домены 2B4 и CD3ζ, дополнительно активируют NK-клетки.

 

Рис. 2. Структура CAR, используемых при создании клеточного продукта из клеток различных типов. NK-Клетки – естественные киллеры, NKT-клетки – естественные киллерные T-клетки

 

Стоит подчеркнуть, что NK-клетки, трансдуцированные CAR, потенциально, могут проявлять цитотоксическую активность в отношении злокачественных клеток и CAR-независимым образом благодаря собственным активирующим рецепторам, а также способности к распознаванию клеток, опсонизированных антителами [20, 23]. Наличие CAR-независимой противоопухолевой активности может дополнительно усиливать эффективность CAR-NK-терапии. Более того, разнообразие активирующих рецепторов позволяет CAR-NK распознавать и уничтожать опухолевые клетки с измененным фенотипом, выжившие после продолжительного лечения [24]. Было показано, что под действием экзогенных IL-12 и IL-18 NK-клетки приобретают фенотип, подобный клеткам памяти. Такие клетки уже показали свою эффективность на первых этапах испытаний на пациентах с рецидивирующим или резистентным острым миелоидным лейкозом. Дополнительная экспрессия в них CAR, направленного против нуклеофозмина 1 (NPM1), увеличила эффективность терапии и снизила частоту побочных эффектов [25]. Повышенная чувствительность NK-клеток к активным формам кислорода, по сравнению с T- и B-клетками, может быть устранена за счет экспрессии в них пероксиредоксина-1, что может улучшить персистенцию CAR-NK-клеток в закисленной среде солидных опухолей [26].

Доклинические и клинические исследования показали, что CAR-NK-клетки лишены многих недостатков CAR-T. Поскольку NK-клетки не несут вариабельного Т-клеточного рецептора, их адоптивный перенос не приводит к развитию реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [27, 28]. Потенциально, это открывает дорогу к производству готовых («off the shelf») аллогенных клеточных препаратов, подходящих многим пациентам одновременно. Кроме того, перенос CAR-NK практически лишен риска СВЦ или нейротоксичности [29, 30]. Наконец, в доклинических исследованиях CAR-NK показали себя эффективными не только в случае онкогематологических заболеваний, но и при терапии солидных опухолей [31]. Более того, на данный момент многие разработки CAR-NK-терапии, в том числе и против солидных опухолей, вышли из доклинических в клинические испытания.

В настоящее время зарегистрировано несколько десятков клинических испытаний, посвященных возможности использования CAR-NK-клеток, направленных к разным опухолевым антигенам, как в виде самостоятельной терапии, так и в комбинации с другими терапевтическими подходами. Например, в одном исследовании испытуемые, наряду с CAR-NK против PD-L1, получают иммуностимулятор N-803, запускающий пролиферацию и активацию NK- и CD8+ T-клеток, и пембролизумаб – моноклональное антитело, ингибирующее PD-1 (NCT04847466). Было показано, что NK-клетки, в которые с помощью электропорации были последовательно введены рецептор хемокина CXCR4 и CAR, направленный против BCMA, эффективно уничтожают клетки множественной миеломы [32]. Все клинические испытания CAR-NK-терапии в настоящее время находятся на I/II фазах. В ряде зарегистрированных на данный момент испытаний исследуется CAR-NK-терапия онкогематологических заболеваний, таких как множественная миелома (мишень – BCMA; NCT05008536), B-клеточные лимфомы (мишень – CD19; NCT05379647) и острый лимфобластный лейкоз (мишень – CD19; NCT05563545). Кроме того, ведутся клинические испытания эффективности и безопасности применения CAR-NK при различных солидных опухолях: раке яичников (мишень – клаудин 6; NCT05410717), толстой кишки (мишень – NKGD2L; NCT05213195), поджелудочной железы (мишень – ROBO1; NCT03941457), простаты (мишень – PSMA; NCT03692663) и других. Сведения о клинических испытаниях CAR-NK-клеток, направленных против разных мишеней, представлены в таблице. Успешное прохождение первой фазы в нескольких клинических испытаниях CAR-NK показало высокую безопасность этого вида терапии и практически полное отсутствие побочных эффектов [33].

 

Некоторые зарегистрированные клинические испытания CAR-NK-клеток

Клиническое испытание	Год открытия	Фаза	Заболевание	Мишень
NCT02892695	2016	I/II	лимфомы и лейкозы	CD19
NCT03940833	2019	I/II	множественная миелома	BCMA
NCT02742727	2016	I/II	лимфомы и лейкозы	CD7
NCT02944162	2016	I/II	острый миелоидный лейкоз	CD33
NCT02839954	2016	I/II	солидные опухоли	MUCL
NCT03383978	2017	I	глиобластома	HER2
NCT03415100	2018	I	метастазирующие солидные опухоли	NKG2DL
NCT03941457	2019	I/II	рак поджелудочной железы	ROBO1
NCT03692663	2018	I	рак предстательной железы	PSMA
NCT05410717	2022	I/II	рак яичника	клаудин 6 (CLDN6)
NCT05194709	2021	I	развитые солидные опухоли	5T4
NCT05507593	2022	I	немелкоклеточный рак легкого	DLL3

 

Несмотря на многочисленные достоинства, в данный момент есть некоторые ограничения в использовании терапии CAR-NK. CAR-NK-клетки характеризуются низким уровнем персистенции после адоптивного переноса: если срок жизни CAR-T-клеток в организме пациента может составлять до 10 лет [34], то у CAR-NK-клеток он не превышает нескольких недель [35]. Кроме того, CAR-NK-клетки с трудом поддаются экспансии ex vivo, плохо переносят замораживание и хранение [36]. Тем не менее можно надеяться, что указанные сложности технического характера будут преодолены. В частности, было показано, что персистенция CAR-NK-клеток может быть увеличена вдвое за счет нокаута гена CISH, кодирующего белок CIS – негативный регулятор сигналинга IL-15. При отсутствии CIS в CAR-NK-клетках активируется секреция IL-15, и поскольку CAR-NK-клетки сами несут на своей поверхности рецепторы IL-15, это способствует аутокринному усилению сигнального пути IL-15. Высокая активность IL-15-опосредованного сигналинга, в свою очередь, способствует экспансии CAR-NK-клеток ex vivo, увеличивает персистенцию и повышает противоопухолевые свойства [37]. Вставка в конструкт CAR IL-15, кроме того, может повысить метаболический статус и активировать эффекторные функции CAR-NK-клеток, ослабленных взаимодействием с метаболически активными опухолями [38].

Еще одним фактором, способным снизить эффективность CAR-NK-терапии, является захват терапевтическими CAR-NK-клетками опухолевых антигенов по механизму трогоцитоза. Вследствие захвата опухолевого антигена CAR-NK-клетки сами становятся мишенью терапии и уничтожаются другими NK-клетками по пути фратрицида, а количество опухолевых антигенов на целевых злокачественных клетках падает. Снижению риска фратрицида среди CAR-NK-клеток способствует одновременная экспрессия в них активирующего CAR, направленного против опухолевого антигена, и ингибирующего CAR, распознающего специфичные для NK-клеток антигены [39].

γδ T-клетки. Примерно 3,7% циркулирующих в кровотоке T-клеток несут на поверхности TКР, образованный γ- и δ-цепями [40, 41]. Такие «неклассические» (в противовес «классическим» αβ Т-клеткам) γδ T-клетки значительно отличаются от αβ T-клеток, несущих ТКР из цепей α и β и составляющих преобладающую популяцию T-клеток кровотока. Так, распознавание антигенов αβ T-клетками возможно, только если антиген представлен в контексте MHC. γδ T-клетки не требуют участия классических молекул MHC в распознавании антигенов, и это обстоятельство значительно расширяет возможности для переноса γδ T-клеток между разными организмами и существенно снижает вероятность развития осложнений, таких как РТПХ. Относительно безопасный адоптивный перенос γδ T-клеток возможен еще и потому, что репертуары γ- и δ-цепей значительно менее разнообразны в популяции по сравнению с репертуарами цепей α и β. γδ T-клетки, как правило, распознают общие для разных людей молекулярные сигнатуры, свидетельствующие о развитии инфекционного процесса или появлении злокачественных клеток, поэтому их нередко сближают с клетками врожденного иммунитета. На клетки врожденного иммунитета γδ T-клетки похожи экспрессией Toll-подобных рецепторов и рецепторов, близких к активирующим рецепторам NK-клеток, в частности, уже упоминавшегося NKG2D [42]. Однако γδ T-клетки способны и к формированию иммунологической памяти, что заставляет причислять их к компонентам адаптивного иммунитета [43]. Отмечается, γδ T-клетки могут дифференцироваться в Th-подобные клетки и продуцировать широкий спектр цитокинов [44].

Большинство γδ T-клеток крови относится к числу Vγ9Vδ2 T-клеток. В состав ТКР этих клеток входят сегменты Vγ9 и Vδ2, относящиеся к цепям γ и δ соответственно. Vγ9Vδ2 T-клетки распознают фосфоантигены, поэтому для экспансии Vγ9Vδ2 T-клеток ex vivo используют их синтетические аналоги, такие как золедроновая кислота [45]. γδ T-клетки, имеющие сегмент Vδ1 в составе ТКР, локализованы преимущественно в слизистых оболочках [23].

Роль γδ T-клеток в обеспечении противоопухолевой защиты впервые была показана у мышей, лишенных γδ T-клеток. Под воздействием химических мутагенов у таких мышей наблюдается раннее развитие плоскоклеточного рака кожи [46]. Впоследствии важная роль γδ T-клеток в работе противоопухолевого иммунитета была продемонстрирована на разных моделях опухолевого роста. В частности, было показано, что уровень инфильтрации злокачественных опухолей γδ T-клетками коррелирует с хорошим прогнозом в случае многих видов рака, например меланомы [47] и рака желудка [48]. Считается, что активность γδ T-клеток в отношении злокачественных клеток обеспечивается их цитотоксическими свойствами, а также продукцией IFNγ и TNF [33]. Цитотоксичность γδ T-клеток обусловлена действием перфорина и гранзимов, кроме того, клетки способны к антителозависимой клеточной цитотоксичности. Противоопухолевая активность присуща как Vγ9Vδ2, так и Vδ1 T-клеткам [45, 48, 49].

Стоит отметить, что γδ T-клетки не во всех случаях оказывают противоопухолевое действие: они могут проявлять и проопухолевые свойства. Как правило, проопухолевое действие γδ T-клеток обусловлено продукцией ими интерлейкина 17 (IL-17) и ряда других цитокинов. Например, при раке поджелудочной железы γδ T-клетки могут подавлять активность αβ T-клеток, выделяя IL-10 и IL-17 и способствуя повышению уровня экспрессии PD-L1 в клетках опухоли [50].

Выраженная собственная противоопухолевая активность вкупе с высокой безопасностью адоптивного переноса делает γδ T-клетки перспективным инструментом в иммунотерапии онкологических заболеваний. Перенос пациенту немодифицированных γδ T-клеток после экспансии ex vivo оказался безопасным, но неэффективным [45], поэтому в последнее время активно исследуется возможность усиления противоопухолевой активности γδ T-клеток посредством экспрессии в них CAR. Показано, что CAR-γδ T-клетки, направленные против CD19, эффективно распознают и уничтожают малигнизированные клетки, в том числе утратившие CD19, причем цитотоксические свойства CAR-γδ T-клеток усиливаются после их обработки золедроновой кислотой [51, 52]. Способность CAR-γδ T-лимфоцитов убивать злокачественные клетки крови, утратившие антиген, обусловлена высокой неспецифической цитотоксичностью γδ T-клеток по отношению к клеткам лейкоза, которая дополнительно усиливается под действием золедроновой кислоты в ходе экспансии CAR-γδ T-клеток ex vivo. Сохранение цитотоксических свойств в отношении злокачественных клеток крови, потерявших антиген, дает CAR-γδ T-клеткам важное преимущество [52].

CAR-γδ T-клетки могут быть эффективны и против солидных опухолей. Так, продемонстрировано, что CAR-γδ T-клетки, направленные на антиген нейробластомы дисиалоганглиозид (GD2), не только лизируют злокачественные клетки, но и презентируют антигены αβ T-клеткам, активируя их в условиях in vitro. Возможно, CAR-γδ T-клетки могут эффективно представлять антигены и активировать αβ T-клетки in vivo, однако для прояснения этого вопроса необходимы дальнейшие эксперименты [23].

Большинство CAR, которые на данный момент удалось успешно экспрессировать в γδ T-клетках, относятся к числу рецепторов второго поколения и содержат домены CD28 и CD3ζ в качестве костимуляторного и сигнального доменов соответственно [23] (рис. 2). В одном исследовании в γδ T-клетки была внесена генетическая конструкция CAR первого поколения, имеющего единственный внутриклеточный домен DAP10 и распознающего GD2 [53]. Отметим, что в γδ T-клетках экспрессируются такие костимулирующие молекулы, как CD28, CD27 и 4-1BB, которые способствуют активации этих клеток при передаче сигналов от CAR [54].

В ряде исследований в γδ T-клетках была создана система комбинаторного распознавания антигена, функционирующая как логические операторы. Например, Fisher et al. [53] получили CAR-γδ T-клетки, у которых упомянутый DAP10-CAR распознает GD2, а γδ-ТКР связывается с фосфоантигенами, которые экспрессируются злокачественными клетками и почти не экспрессируются нормальными клетками. Активация таких CAR-γδ T-клеток достигается только при взаимодействии с клетками-мишенями, экспонирующими оба антигена, которые распознаются CAR и ТКР, что снижает вероятность уничтожения нецелевых клеток.

Fleischer et al. [53] получили γδ T-клетки, экспрессирующие несигнализирующий CAR (NSCAR), лишенный внутриклеточных активационных доменов, и потому не способный запускать цитотоксическую реакцию при распознавании антигена. γδ T-клетки, экспрессирующие NSCAR, могут с его помощью распознавать опухолевые антигены CD19 и CD5 и благодаря этому взаимодействию сближаться со злокачественными клетками в пространстве. Тем не менее для прямой противоопухолевой активности необходима эндогенная MHC-независимая цитотоксичность γδ T-клеток. Показано, что γδ T-клетки, экспрессирующие NSCAR, отличаются более выраженной цитотоксичностью в отношении клеток B- и T-клеточного острого лимфобластного лейкоза соответственно по сравнению с γδ T-клетками, экспрессирующими CAR против тех же антигенов (CD19 и CD5). Примечательно, что в случае αβ T-клеток экспрессия NSCAR вместо CAR не привела к значимому усилению цитотоксических свойств, из чего можно сделать вывод, что молекулярные механизмы, которые лежат в основе увеличения противоопухолевой активности γδ T-клеток при экспрессии NSCAR, фундаментально отличаются от таковых у αβ T-клеток [55].

В настоящее время проходит несколько клинических испытаний, посвященных возможностям использования CAR-γδ T-клеток в иммунотерапии онкологических заболеваний, а именно: острого миелоидного лейкоза (мишени – CD33, CD123; NCT03885076, NCT04796441), рецидивирующего или резистентного CD7+ T-клеточного лейкоза (мишень – CD7; NCT04702841), различных B-клеточных онкогематологических заболеваний (мишени – CD20, CD19; NCT04735471, NCT02656147, NCT04911478), а также рецидивирующих или резистентных солидных опухолей различного генеза (мишень – NKG2DL; NCT04107142, NCT05302037). На данный момент все перечисленные клинические испытания находятся на I фазе, поэтому судить о клинической эффективности CAR-γδ T-клеток пока преждевременно. Предполагается, что терапия на основе CAR-γδ T-клеток будет иметь преимущество, по сравнению с традиционной CAR-T-терапией, в плане пониженного риска развития таких побочных эффектов, как СВЦ и нейротоксичность [49]. Стоит отметить, что исследования функционирования CAR-γδ T-клеток in vivo показали, что эти клетки могут лишь недолго персистировать в организме [52], что может быть существенным ограничением их применения в клинике.

NKT-Клетки (от natural killer T cells), как и γδ T-клетки, объединяют в себе свойства клеток адаптивного и врожденного иммунитета. NKT-Клетки составляют менее 1% от T-клеток крови [56] и экспрессируют αβ ТКР, а также молекулы, характерные для NK-клеток, такие как CD16 (FcγR) и CD56 [57]. В отличие от T-лимфоцитов, NKT-клетки распознают антигены только в контексте CD1d – неклассической молекулы MHC, близкой к MHC I класса. NKT-Клетки принято подразделять на инвариантные NKT-клетки (iNKT), или NKT-клетки I типа, и NKT-клетки II типа. iNKT-Клетки характеризуются ограниченным репертуаром ТКР и распознают α-галактозилцерамид (α-GalCer), а NKT-клетки II типа отличаются более широким репертуаром ТКР и не распознают α-GalCer [58].

Отмечено, что у пациентов с различными злокачественными новообразованиями, в частности, онкогематологическими, зачастую снижается количество NKT-клеток в крови [59], а также нарушаются их функции, например продукция IFNγ [60]. Кроме того, повышенное количество NKT-клеток в периферической крови, как и инфильтрация NKT-клеток в опухоль, как правило, коррелируют с благоприятным прогнозом для пациента [61, 62]. Выраженным противоопухолевым эффектом обладают только iNKT, а NKT-клетки II типа могут даже подавлять иммунный ответ против злокачественных клеток. Цитотоксичность iNKT, опосредованная гранзимами или FasL, активируется в результате распознавания липидного антигена, связанного с CD1d [63]. Помимо прямого лизиса опухолевых клеток, iNKT-клетки могут модулировать активность других иммунных клеток (в частности, DC, NK-, B- и T-клеток) посредством секреции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, таких как IFNγ, TNF, IL-4, IL-10 и IL-13 [64, 65]. Цитокины, выделяемые iNKT-клетками, могут также влиять на опухолевое микроокружение, непрямым образом воздействуя на противоопухолевый иммунный ответ [64]. Показано, что NKT-клетки с транзиентной экспрессией CAR продуцируют меньше IL-6, чем трансдуцированные CD8+ CAR-T-лимфоциты, и при этом сохраняют цитотоксическую активность. По этой причине предполагается, что риск развития СВЦ при терапии CAR-NKT будет ниже, чем в случае CAR-T, но для прояснения этого вопроса необходимы дальнейшие исследования [66].

Ряд свойств NKT-клеток делает их особенно привлекательными эффекторами CAR-терапии. Собственная противоопухолевая активность, включающая не только цитотоксические свойства, но и способность к перестройке опухолевого окружения, может дополнять CAR-опосредованное действие против злокачественных клеток. Поскольку NKT-клетки распознают антигены в контексте неполиморфного CD1d, их аллогенный адоптивный перенос не вызывает РТПХ, благодаря чему становится возможным создание аллогенных CAR-iNKT из клеток здоровых доноров [23]. Кроме того, NKT-клетки способны к быстрой пролиферации ex vivo, благодаря чему необходимое для создания клинического продукта количество клеток может быть получено сравнительно легко [56].

В первой работе, посвященной получению CAR-iNKT-клеток, в iNKT-клетках был экспрессирован CAR против антигена нейробластомы GD2 с сигнальными доменами 4-1BB и CD3ζ (рис. 2). Было показано, что 4-1BB обеспечивает поляризацию CAR-iNKT в фенотип Th1, поэтому CAR-iNKT в условиях in vivo эффективно уничтожали клетки нейробластомы, при этом длительно персистируя в организме [67]. Впоследствии было показано, что экспрессия CD62L является маркером повышенной персистенции и противоопухолевой активности NKT-клеток, в том числе несущих CAR. Введение анти-CD19 CAR-NKT-клеток, экспрессирующих CD62L, мышам с B-клеточной лимфомой позволило добиться значительной регрессии заболевания [68]. Исследование эффективности CAR-NKT-клеток, распознающих антиген клеток меланомы хондроитинсульфатпротеогликан 4 (CSPG4), показало, что CAR-NKT уничтожают клетки меланомы in vitro не менее эффективно, чем CAR-T [69]. Недавно было объявлено о получении NKT-клеток, экспрессирующих CAR третьего поколения, направленный против глипикана-3 (антигена клеток гепатоцеллюлярной карциномы) и содержащий два костимуляторных домена – CD28 и 4-1BB [70].

Успехи в доклиническом применении CAR-NKT-клеток привели к запуску клинических испытаний CAR-NKT в терапии нейробластомы (мишень – GD2; NCT03294954, NCT02439788), а также рецидивирующей или резистентной B-клеточной лимфомы (мишень – CD19; NCT03774654) и других B-клеточных неоплазий (мишень – CD19; NCT05487651). Малое количество клинических испытаний CAR-NKT на данный момент, вероятно, связано с недостаточным объемом доклинических исследований. Также стоит отметить, что существенным ограничением для получения клинического продукта из CAR-NKT-клеток является малая численность NKT-клеток в периферической крови.

Регуляторные T-клетки (regulatory T cells, Tregs) – специализированная подгруппа CD4+ T-лимфоцитов, выполняющих иммуносупрессивную функцию. На долю регуляторных T-клеток приходится от 5 до 10% CD4+ T-клеток в кровотоке [71]. Ингибирующее действие регуляторных T-клеток на эффекторные T-клетки или антигенпрезентирующие клетки может быть прямым или непрямым. В первом случае регуляторная T-клетка воздействует на клетку-мишень с помощью выделения противовоспалительных цитокинов, таких как IL-35, IL-10 или TGF-β, или высвобождения гранзима из литических гранул, что приводит к гибели мишени. Непрямые механизмы включают воздействие на мишень не самой регуляторной T-клетки, а других клеток, подвергшихся действию регуляторных T-клеток [72].

Способность регуляторных T-клеток ингибировать эффекторные иммунные клетки делает потенциально возможным их использование в терапии заболеваний и состояний, связанных с избыточной иммунной реакцией, например, при трансплантации. Однако первые исследования терапевтических свойств поликлональных регуляторных T-клеток показали, что их адоптивный перенос индуцирует неспецифическую толерантность, снижает сопротивляемость организма инфекциям и повышает риск развития злокачественных новообразований [73]. Экспрессия CAR дает возможность направить регуляторные T-клетки прицельно в ткань-мишень, сохраняя исходную ингибирующую активность этих клеток, но в то же время избегая индукции нежелательной иммунологической толерантности. Первые созданные CAR-Treg были предназначены для терапии колита в мышиной модели [74], а вскоре было сообщено о получении первых CAR-Treg человека [75].

В большинстве исследований CAR-Treg, опубликованных на данный момент, регуляторные T-клетки экспрессируют CAR второго поколения, и в качестве костимуляторного домена выступают CD28 или 4-1BB. Систематический анализ активности CAR второго поколения, направленных против человеческого лейкоцитарного антигена HLA-A2, с различными костимуляторными доменами в регуляторных T-клетках показал, что в этих клетках лучше всего функционирует CAR с CD28 в своем составе. Дополнительно увеличивает супрессивные свойства таких клеток экспрессия в них IL-10 [76]. Установлено, что, в отличие от классических CAR-T, CAR-Treg с доменом CD28 отличаются лучшей персистенцией, чем с 4-1BB [77, 78]. Кроме того, в настоящее время исследуются регуляторные T-клетки, экспрессирующие CAR третьего поколения, которые содержат и CD28, и 4-1BB костимуляторные домены [79–81].

За более чем 10 лет, прошедших с момента создания первых CAR-Treg, были получены CAR-Treg разной специфичности, характеризующиеся высокой эффективностью, стабильностью и увеличенной персистенцией в мышиных моделях [82]. Кроме того, по сравнению с CAR-T, CAR-Treg отличаются сниженной потребностью в IL-2 [83]. В мышиных моделях показан эффект CAR-Treg в предотвращении или уменьшении симптомов РТПХ, заболеваний, связанных с чрезмерной активностью иммунной системы, гемофилии и других болезней [73]. На данный момент только одно исследование, посвященное CAR-Treg, перешло на стадию клинических испытаний (NCT04817774). В рамках этого исследования оценивается эффективность и безопасность использования CAR-Treg при пересадке почки. В этом исследовании CAR распознает HLA-A2 в органе-реципиенте, и за счет этого CAR-Treg привлекаются к нему, подавляя иммунный ответ.

T-Лимфоциты, ассоциированные со слизистыми. Ассоциированные со слизистыми инвариантные T-клетки (mucosal-associated invariant T cells, MAIT) в качестве антигенов распознают метаболиты витаминов B2 и B9 бактериального происхождения в комплексе с неклассической молекулой MHC MR1 [84]. На долю MAIT может приходиться от 1 до 8% T-клеток периферической крови [85]; также эти клетки локализуются в слизистых оболочках и лимфоидной ткани. ТКР MAIT состоит из практически неполиморфных цепей α и β, и большая часть MAIT экспрессирует CD8. Эти клетки содержат гранулы с гранзимами и обладают цитотоксическими свойствами [86], а в активированном состоянии секретируют провоспалительные цитокины IFNγ, TNF и IL-17 [87].

MAIT участвуют в защите от инфекций преимущественно бактериальной природы, а также вовлечены в патогенез многих неинфекционных болезней, таких как аутоиммунные заболевания, воспалительное заболевание кишечника, целиакия, а также злокачественные заболевания [84]. Отмечено, что уровень MAIT в кровотоке снижается при раке толстой кишки, причем клетки мигрируют в опухоль и оказывают противоопухолевое цитотоксическое действие, выделяя гранзимы [88]. Уменьшение количества MAIT наблюдается и у пациентов с множественной миеломой [89]. В некоторых случаях MAIT, активно мигрирующие в опухоль, подвергаются иммуносупрессивному влиянию опухолевого микроокружения и утрачивают способность к секреции IFNγ [90].

Тот факт, что MAIT сами по себе активно инфильтрируют опухолевую микросреду, кроме того, их цитотоксические свойства могут быть использованы в разработке иммунотерапии опухолей. Поскольку MAIT распознают только антигены, связанные с неклассической молекулой MHC I класса MR1, вероятность развития РТПХ при использовании CAR-MAIT будет ниже, чем в случае цитотоксических CAR-T [23]. Dogan et al. [86] экспрессировали CAR против антигенов CD19 или HER2 в первичных MAIT человека. Полученные CAR-MAIT демонстрировали цитотоксические свойства по отношению к клеткам B-клеточной лимфомы и рака молочной железы соответственно. Показано, что активированные CAR-MAIT по цитотоксичности в отношении клеток-мишеней не уступали CD8+ CAR-T-лимфоцитам, однако продуцировали значительно меньше IFNγ и других провоспалительных цитокинов. Последнее наблюдение дает основания полагать, что вероятность развития СВЦ и нейротоксичности при введении CAR-MAIT в организм пациента будет ниже, чем в случае CAR-T [87]. Тем не менее для дальнейшей оценки безопасности и противоопухолевых свойств CAR-MAIT необходимы их исследования in vivo с использованием лабораторных животных, а также клинические испытания.

Двойные негативные T-клетки. DN T-клетки характеризуются экспрессией CD3 при отсутствии экспрессии как CD4, так и CD8. Для DN T-клеток также характерна экспрессия CD25 [91], который на высоком уровне экспрессируют Treg. ТКР DN T-клеток могут быть представлены как αβ-, так и γδ-цепями. На долю DN T-клеток приходится от 3 до 5% T-клеток крови [92]. DN T-клетки обладают выраженным супрессивным действием в отношении различных групп иммунных клеток (CD4+ и CD8+ T-клеток, B-клеток и NK-клеток), которое было отмечено как in vitro, так и in vivo. Благодаря этому DN T-клетки играют важную роль в предотвращении РТПХ и поддержании толерантности в отношении алло- или ксенотрансплантата [93–95]. Таким образом, DN T-клетки можно рассматривать как неканоническую подгруппу Treg.

Несмотря на иммуносупрессивное действие в отношении многих иммунных клеток, DN T-клетки обладают собственными MHC-независимыми цитотоксическими свойствами. DN T-клетки могут запускать гибель злокачественных клеток через FasL [96], TRAIL и другие поверхностные белки, ассоциированные с цитотоксичностью [97]. Кроме того, они экспрессируют перфорин и гранзим, а также продуцируют TNF и IFNγ [97]. Помимо MHC-независимой цитотоксичности, DN T-клетки обладают и другими свойствами, которые делают потенциально возможным их использование в иммунотерапии злокачественных заболеваний: легкость экспансии ex vivo [98], отсутствие внеопухолевой цитотоксической активности и сниженный риск отторжения после аллогенного переноса [99].

Возможность экспрессии CAR в DN T-клетках исследована слабо. В 2022 г. Vasic et al. [99] сообщили о получении DN T-клеток, несущих CAR против CD19, и сравнили их противоопухолевые свойства с таковыми у традиционных CAR-T-клеток, также направленных против CD19. Авторы заявили, что CAR-DN T-клетки по противоопухолевым свойствам как in vitro, так и in vivo не уступали традиционным CAR-T-клеткам, однако не вызывали РТПХ [99]. Тем не менее полученные результаты требуют независимого подтверждения в других исследованиях.

Цитокин-индуцированные киллеры (CIK от cytokine induced killers) – гетерогенная группа CD8+ T-клеток, фенотипически и функционально близких к NK-клеткам [100, 101]. CIK происходят из CD3+ T-лимфоцитов, которые в процессе экспансии начинают экспрессировать CD56. Исходно CIK были получены из лимфокин-ассоциированных киллеров (лимфоцитов, приобретающих способность к лизису опухолевых клеток после инкубации с IL-2 [102]) в ходе оптимизации протокола их экспансии. Лимфокин-ассоциированные киллеры (lymphokine associated killer, LAK) были получены еще в 1980-х гг. [103], однако, несмотря на их выраженные цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток, затрудненная экспансия ex vivo ограничила возможности их применения. Строго регулируемое по времени добавление к LAK IFNγ, IL-2 и моноклонального антитела к CD3, обладающего митогенным действием, привело к получению CIK [104]. В настоящее время эти клетки можно относительно дешево получить из Т-клеток периферической или пуповинной крови.

Цитотоксическое действие CIK требует участия рецептора NKG2D и проявляется в высвобождении содержимого литических гранул с гранзимом. С помощью NKG2D CIK распознают на поверхности клетки-мишени стресс-индуцируемые молекулы, такие как UL16BP и MICA/MICB [105]. Сигналинг через ТКР также остается возможным, поэтому долгое время использование CIK ограничивалось аутологичной терапией из опасения острой РТПХ. Однако недавно была показана относительная безопасность применения CIK на базе донорских клеток после аллотрансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Предполагается, что это связано с короткой персистенцией терминально дифференцированных CD3+ CD56+-клеток, а также с пониженной экспрессией некоторых хоминговых рецепторов [106].

Благодаря выраженным цитотоксическим свойствам, способности к быстрой экспансии ex vivo и распознаванию опухолевых клеток с помощью NKG2D, а также безопасности при аллогенном адоптивном переносе CIK рассматриваются как перспективные эффекторы CAR-клеточной терапии [107]. В нескольких доклинических исследованиях была показана эффективность CAR-CIK против гематологических и солидных опухолей. Например, продемонстрировано, что CIK, экспрессирующие CAR против CD19, содержащий домены CD28/4-1BB и CD3ζ, эффективно уничтожают клетки B-клеточного острого лимфобластного лейкоза [108, 109]. CIK, несущие CAR к соответствующим опухолевым антигенам, эффективно уничтожали клетки рака толстой кишки, острого миелобластного лейкоза, саркомы мягких тканей и других видов опухолей [107]. Для некоторых CAR было отмечено, что их экспрессия в CIK приводит к увеличению продукции IFNγ и TNF по сравнению с CIK, не экспрессирующими CAR [110, 111].

По состоянию на 2022 г. зарегистрировано одно клиническое испытание CAR-CIK, в котором исследуется эффективность и безопасность CD19-CAR-CIK при остром лимфобластном лейкозе (NCT03389035). Таким образом, для получения информации об эффективности CAR-CIK требуется дальнейшее изучение.

Макрофаги. Специализированные фагоцитирующие клетки тканей, макрофаги, интенсивно инфильтрируют строму солидных опухолей и являются важным компонентом опухолевого микроокружения. Распознавая чужеродные агенты с помощью рецепторов врожденного иммунитета, в первую очередь Toll-подобных и NOD-подобных рецепторов, макрофаги активируются и продуцируют провоспалительные цитокины, такие как TNF, IL-1β, IL-6, IL-12 и IL-23, которые воздействуют на многие клетки в микроокружении опухоли и, в частности, способствуют противоопухолевой активности T- и NK-клеток. Описанные макрофаги с провоспалительными свойствами имеют так называемый M1-фенотип. Макрофаги фенотипа M2, напротив, препятствуют воспалению и развитию противоопухолевого T-клеточного иммунитета и способствуют росту опухоли, продуцируя цитокины IL-4, IL-5 и IL-13. Основная физиологическая роль M2-макрофагов заключается в заживлении ран [112]. Макрофаги, находящиеся в опухолевом микроокружении, известны как ассоциированные с опухолями макрофаги (tumor associated macrophages, TAM). TAM с фенотипом M2 способствуют росту и метастазированию опухоли, а также обладают иммуносупрессивными свойствами [66]. Таким образом, важной задачей противоопухолевой иммунотерапии, задействующей TAM, является их поляризация в направлении фенотипа M1, способствующего уничтожению неоплазии.

Способность макрофагов к фагоцитозу может быть усилена за счет экспрессии в них CAR, несущих внутриклеточные домены, которые запускают сигнальные пути активации фагоцитоза. В одном из первых исследований, посвященных CAR-макрофагам (CAR-M), первичные моноциты человека были трансдуцированы CAR против карциноэмбрионального антигена (CEA) с CD64 (FcγRI) в качестве сигнального домена. Полученные CAR-M обладали противоопухолевой активностью in vitro и in vivo, однако ее молекулярный механизм был неясен [113]. Дальнейшие исследования показали, что экспрессия CAR, содержащих рецептор фагоцитоза Megf10 или FcγR в качестве сигнальных доменов, усиливает фагоцитарную активность макрофагов [114, 115]. На интенсивности фагоцитоза положительно сказывается и экспрессия CAR с сигнальным доменом CD3ζ, гомологичным FcγRI.

Продемонстрировано, что макрофаги, экспрессирующие CAR против CD19 с доменами Megf10 или FcγR, эффективно уничтожают CD19-положительные опухолевые клетки, причем полный фагоцитоз клеток имеет место лишь в небольшой доле случаев, и большую часть злокачественных клеток макрофаги уничтожают посредством трогоцитоза [116]. Zhang et al. [116] получили макрофаги, экспрессирующие анти-CD19 CAR второго поколения с сигнальным доменом CD3ζ и костимулирующим доменом 4-1BB, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Такие макрофаги фагоцитировали опухолевые клетки в культуре и продуцировали провоспалительные цитокины, однако in vivo оказывали лишь минимальный эффект на рост опухоли [117].

Установлено, что сама процедура создания CAR-М запускает их поляризацию в провоспалительные клетки. В частности, показано, что трансдукция аденовирусным вектором, кодирующим CAR, и последующая экспрессия CAR поляризует макрофаги в направлении фенотипа M1, который сохраняется в опухолевом микроокружении [118]. Более того, CAR-M способны к кросс-презентации опухолевых антигенов после фагоцитоза. Установлено, что макрофаги, экспрессирующие CAR против HER2 (антиген клеток рака молочной железы), фагоцитируют опухолевые клетки и презентируют процессированные антигены. Показано, что CAR-M запускают системный противоопухолевый иммунитет [119]. На мышиной модели рака яичника было показано, что однократное введение CAR-M существенно повышает выживаемость и замедляет развитие опухоли, однако у всех мышей в конечном итоге рост опухоли возобновлялся [115]. Тем не менее способность CAR-М превращать микроокружение опухоли в провоспалительную среду делает потенциально возможным их применение в качестве дополнения к CAR-T или другим видам иммунотерапии.

Макрофаги могут продуцировать матриксные металлопротеиназы, которые вызывают значительные перестройки межклеточного матрикса опухоли и влияют на архитектуру новообразования, и это их свойство также может быть использовано в CAR-терапии. Было показано, что экспрессия CAR со специфичностью к HER2 и с CD147 в качестве трансмембранного и внутриклеточного домена в макрофагах стимулирует секрецию ими матриксных металлопротеиназ. На мышиной модели рака молочной железы было продемонстрировано, что введение указанных CAR-M приводит к перестройке опухолевого матрикса, которая способствует инфильтрации T-клеток в опухоль. Отмечается, что в крови больных мышей, участвующих в эксперименте, были снижены уровни провоспалительных цитокинов, ассоциированных с СВЦ (IFNγ, TNF и IL-6), в то время как в самой опухоли уровни IL-12 и IFNγ были повышены [120]. Можно предположить, что терапия CAR-М будет сопряжена с пониженным риском развития СВЦ.

Имеющихся на данный момент сведений недостаточно, чтобы делать выводы об эффективности и безопасности CAR-М-терапии для человека. То обстоятельство, что макрофаги являются одним из основных типов клеток, запускающих СВЦ, делает необходимой более детальную проверку безопасности CAR-M. Кроме того, моноциты периферической крови отличаются гетерогенностью, и есть вероятность, что полученные из них CAR-M при системном применении будут чаще перемещаться не в опухоль, а в здоровые ткани [23], что может привести к выраженным побочным эффектам со стороны различных систем органов. На данный момент в клинические испытания вышла только одна разработка CAR-М, направленных против солидных опухолей со сверхэкспрессией HER2 (NCT04660929).

Дендритные клетки. Будучи профессиональными антигенпрезентирующими клетками, DC задействованы как в созревании наивных T-клеток, так и в реактивации T-клеток памяти. Во время презентации антигена T-клеткам DC продуцируют цитокины, модулирующие активность T-клеток. DC, находясь в микроокружении опухоли, могут как вызывать иммунную толерантность, так и способствовать развитию противоопухолевого иммунного ответа [121, 122]. Кроме того, DC способны к кросс-презентации опухолевых антигенов цитотоксическим CD8+ T-клеткам, тем самым усиливая противоопухолевый ответ [123].

Потенциал DC, экспрессирующих CAR, как способа управления противоопухолевой активностью CAR-T-клеток изучен слабо. Suh et al. [123] исследовали возможность использования DC, экспрессирующих CAR (CAR-DC), для привлечения в опухолевую микросреду и активации CAR-T-клеток посредством секреции цитокинов. Показано, что экспрессия CAR к CD33 в DC способствует их перемещению в костный мозг у мышей с острым миелоидным лейкозом. Кроме того, у мышей, получивших CAR-DC и CAR-T, также направленных против CD33, значительно повышались уровни IL-12, IFNγ и TNF, кроме того, возросла общая выживаемость по сравнению с мышами, получившими только CAR-T. Таким образом, одновременное введение CAR-DC и CAR-T существенно увеличивает эффективность уничтожения злокачественных клеток [124]. Стоит отметить, что безопасность возможного клинического применения CAR-DC должна быть особенно тщательно изучена, поскольку секретируемый IL-12 в высокой концентрации может обладать системным токсическим действием [125]. На сегодняшний день нет ни одного зарегистрированного клинического испытания, посвященного CAR-DC.

B-Клетки. Помимо T-клеток и клеток врожденного иммунитета, интерес для CAR-технологии представляют и B-клетки. Благодаря способности дифференцироваться в долгоживущие плазматические клетки, секретирующие антитела, B-лимфоциты могут стать безопасным и контролируемым источником терапевтических моноклональных антител, а экспрессия в них CAR к определенным опухолевым антигенам делает возможной таргетную доставку антител, лишенную побочных эффектов системного введения последних.

Несмотря на привлекательную перспективу, исследования экспрессирующих CAR B-клеток и их терапевтического применения на данный момент ограничены. Возможность лентивирусной трансдукции B-клеток и последующей экспрессии CAR в них была показана в 2018 г., когда был описан пациент с рецидивом B-клеточной лимфомы, возникшей от единственного B-клеточного клона, случайно трансдуцированного CAR [126]. Вскоре Pesch et al. [126] продемонстрировали, что гены, кодирующие химерные B-клеточные рецепторы (CBCR), можно внедрять в B-клетки с помощью геномного редактирования методом CRISPR/Cas9. Структура CBCR, использованного в этой работе, включала трансмембранный участок CD28 и CD79β, сигнальный домен BCR вместо классического CD3ζ. Внедрение гена, кодирующего CBCR указанного состава, в первичные B-клетки мыши привело к обильному представлению CBCR на их поверхности и дало им возможность распознавать антигены без участия собственных В-клеточных рецепторов [127]. На данный момент противоопухолевая активность и терапевтическая эффективность B-клеток, экспрессирующих химерные рецепторы, остается неизвестной, равно как и их безопасность для человека.

Одна мишень – несколько типов CAR-клеток

В первых исследованиях, посвященных противоопухолевому действию лейкоцитов разных типов, экспрессирующих CAR, в качестве мишеней для химерных рецепторов использовался небольшой набор опухолеассоциированных антигенов, среди которых CD19, GD2 и другие. На сегодняшний день CAR-клетки, эффективно распознающие некоторые опухолевые антигены, были получены из разных типов лейкоцитов. Полученные из разных источников CAR-клетки, распознающие один и тот же опухолевый антиген, потенциально, создают пространство для маневра при выборе оптимальной терапии для каждого пациента, поскольку эффекторные свойства разных групп лейкоцитов отличаются.

Четыре из шести препаратов CAR-T, одобренных FDA на данный момент, направлены против антигена CD19 и предназначены для терапии B-клеточных неоплазий. Несмотря на продемонстрированную высокую эффективность, анти-CD19 CAR-T-терапия дает опасные побочные эффекты, в первую очередь СВЦ и нейротоксичность, у значимой доли пациентов. Так, применение препарата Axicabtagene ciloleucel, представляющего собой CAR-T-клетки с костимуляторным доменом CD28 и сигнальным доменом CD3ζ, вызывает СВЦ у 93% и нейротоксичность – у 67% пациентов [128, 129]. К настоящему моменту CAR-клетки, эффективно распознающие CD19-положительные злокачественные клетки и уничтожающие их, были получены из γδ T-клеток [52], MAIT-клеток [87], NKT-клеток [68], NK-клеток [29], DN T-клеток [100], CIK [108] и макрофагов [114, 115]. Регуляторные T-клетки, экспрессирующие CD19, были созданы для подавления продукции антител и предотвращения РТПХ [130].

Доклинические исследования, а также исследования на небольших группах пациентов показали, что анти-CD19 CAR-клетки, отличные от цитотоксических T-клеток, демонстрируют выраженный противоопухолевый эффект при меньшей, чем при CAR-T, частоте побочных эффектов. Однако многие из упомянутых клеточных продуктов пока не вышли на полномасштабные клинические испытания, а те продукты, для которых запущены клинические испытания, на данный момент находятся только на начальных фазах, поэтому делать выводы относительно их безопасности и эффективности преждевременно.

Еще два препарата CAR-T, одобренных FDA, Idecabtagene vicleucel и Ciltacabtagene autoleucel, направлены против антигена BCMA и предназначены для терапии множественной миеломы. Как и в случае с терапией анти-CD19 CAR-T, высокая эффективность этих препаратов сочетается со значительным риском СВЦ или нейротоксичности: в случае Idecabtagene vicleucel эти риски составляют 76% и 42%, в случае Ciltacabtagene autoleucel – 92% и 20% соответственно [131, 132]. Заявлено о получении CAR-NK-клеток, нацеленных на распознавание BCMA [133], однако разработка пока не поступила в клинические исследования.

В случае терапии солидных опухолей также существуют примеры получения CAR-клеток из разных лейкоцитов, направленных на один опухолеассоциированный антиген. Так, CAR-клетки, распознающие GD2 (антиген нейробластомы), были получены из γδ T-клеток и NKT-клеток. На данный момент на этапе клинических испытаний находятся только CAR-NKT-клетки, распознающие GD2, но и это испытание находится только на первой фазе, поэтому безопасность и эффективность обоих клеточных продуктов еще нуждается в проверке.

Заключение

Последние 20 лет ознаменовались громкими успехами подхода CAR-T в терапии онкогематологических заболеваний, и уже шесть CAR-T-препаратов были одобрены FDA для клинического использования. Несмотря на недостатки «традиционных» CAR-T, долгое время исследование возможностей получения CAR-клеток из других лейкоцитов не получало должного внимания. Результаты доклинических исследований эффективности и безопасности CAR-клеток, проведенных на культурах клеток и мышиных моделях, свидетельствуют о потенциальной возможности использования широкого спектра CAR-клеток для терапии онкологических заболеваний у человека, включая солидные опухоли. Систематический обзор накопленных данных по экспрессии в разных группах лейкоцитов CAR к различным мишеням приводится в таблице в статье Qin et al. [33]. Тем не менее на данный момент даже клеточные продукты, которые проходят клинические исследования, находятся только на I/II фазах испытаний, при том что подавляющее большинство разработок терапевтических препаратов на основе CAR-экспрессирующих иммунных клеток пока не продвинулось дальше доклинических исследований.

Хотя альтернативные CAR-клеточные продукты могут обладать важными преимуществами перед традиционными CAR-T, такими как сниженный риск развития СВЦ и нейротоксичности в ходе терапии, по ряду параметров CAR-T пока остается впереди. Поскольку сигнальные пути, стоящие за активностью CAR, отличаются в разных группах клеток адаптивного и врожденного иммунитета, при создании CAR для экспрессии в иммунных клетках разных типов критически важное значение имеет выбор костимуляторных и сигнальных доменов. Включение в состав CAR домена, который недостаточно функционален в клетках данного типа, может привести к снижению активности CAR и, как следствие, уменьшению терапевтической эффективности. Например, в случае макрофагов сигнальный домен Megf10 в составе CAR оказывается эффективнее, чем CD3ζ, который оптимально функционирует в T-клетках. Таким образом, под каждый новый вид клеток, в которых экспрессируют CAR, может потребоваться «адаптация» рецептора и определение доменов, обеспечивающих передачу сигналов от активированного рецептора на необходимом уровне. В случае традиционных CAR-T выбор доменов для включения в состав CAR исследован значительно лучше. Кроме того, некоторые иммунные клетки подвергаются экспансии ex vivo с большим трудом, и получение достаточного их количества может потребовать немало времени и средств, что существенно ограничивает возможности получения из них клинически релевантного продукта. Впрочем, в некоторых случаях удается найти альтернативные источники для получения лейкоцитов, которые позволяют по меньшей мере частично решить проблему затрудненной экспансии. Например, CAR-NK-клетки удалось получить из клеточных линий или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток [20], а CAR-макрофаги – из моноцитов или iPSC [116]. В то же время такой способ получения клеток может быть связан с потенциальным риском возникновения опухолей из CAR-клеточного продукта в связи с большим онкогенным потенциалом iPSC и, соответственно, требует прицельного изучения с точки зрения безопасности.

Несмотря на существенные ограничения, связанные с созданием CAR-терапии на основе разных типов лейкоцитов, в иммунотерапии солидных опухолей альтернативные CAR-клетки имеют хорошие перспективы. Использование CAR-T в лечении солидных опухолей оказалось в значительной степени неэффективным из-за затрудненной инфильтрации CAR-T-клеток в опухоль, супрессорного влияния опухолевого микроокружения, а также гетерогенности опухолевых антигенов и их частой утраты. Доклинические исследования показали, что многие альтернативные иммунные клетки, экспрессирующие CAR, способны успешно уничтожать солидные опухоли, а некоторые, в частности CAR-M, могут превращать опухолевое микроокружение в воспалительную среду, способствующую элиминации опухоли. Вопрос инфильтрации опухоли иммунными клетками, экспрессирующими CAR, в солидные опухоли также не решен до конца. Возможность эффективного проникновения CAR-клеток в опухоль пока была показана только для NK-клеток и макрофагов [117]. Тем не менее можно предположить, что в комбинации с другими терапевтическими подходами CAR-лейкоциты станут эффективным методом лечения солидных опухолей.

Подводя итог, можно сказать, что CAR-терапия на основе разных типов иммунных клеток уверенно движется в сторону клинического применения. Однако потребуются годы, чтобы альтернативные CAR-клетки стали эффективным, безопасным и широко используемым подходом в терапии онкологических и некоторых других заболеваний.

Вклад авторов. Е.П. Минина и А.В. Боголюбова – концепция обзора; Е.П. Минина – написание текста; С.А. Шитиков – создание иллюстраций; Д.В. Дианов и А.В. Боголюбова – редактирование текста статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

Е. P. Minina

National Research Center for Hematology

Email: apollinariya.bogolyubova@gmail.com
Russian Federation, 125167, Moscow

D. V. Dianov

National Research Center for Hematology

Email: apollinariya.bogolyubova@gmail.com
Russian Federation, 125167, Moscow

S. А. Sheetikov

National Research Center for Hematology

Email: apollinariya.bogolyubova@gmail.com
Russian Federation, 125167, Moscow

A. V. Bogolyubova

National Research Center for Hematology

Author for correspondence.
Email: apollinariya.bogolyubova@gmail.com
Russian Federation, 125167, Moscow

References

Supplementary files