Reverse genetics applied to immunobiology of tumor necrosis factor, a multifunctional cytokine (mini-review)

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Tumor necrosis factor (TNF) is one of many cytokines – protein molecules responsible for communication between cells of the immune system. TNF was discovered and given its grand name because of its striking antitumor effect in an experimental system, but its main physiological functions in the context of the whole organism turned out to be completely unrelated to tumor protection. This short review discusses “man-made” mouse models generated by early genome-editing technologies, which enabled us to establish the true functions of TNF in health and some diseases as well as to unravel potential strategies for improving the therapy of TNF-dependent diseases.

Full Text

Принятые сокращения: ЭСК – эмбриональные стволовые клетки; LT – лимфотоксин; TNF – фактор некроза опухолей; UTR – нетранслируемая область.

Введение

Почти 50 лет назад Ллойд Олд и его коллеги сообщили об интересном эксперименте, направленном на изучение противоопухолевого действия бактериального эндотоксина и других веществ, которые позже станут известны как активаторы рецепторов врожденного иммунитета [1]. Было обнаружено, что комбинация инфекции вакцинным штаммом микобактерий БЦЖ с последующей инъекцией липополисахарида (ЛПС) кишечной палочки приводит к появлению в сыворотке крови неизвестного «фактора» с яркой противоопухолевой активностью, названного фактором некроза опухолей или Tumor Necrosis Factor (TNF) [2]. Это открытие было воспринято как дальнейшее развитие идей Уильяма Коли, который еще в начале ХХ века указал на возможность использования живых бактерий или бактериальных лизатов для терапии некоторых опухолей [3]. Последующие исследования показали, что TNF имеет белковую природу, и что он может продуцироваться клетками иммунной системы в ответ на различные стимулы, в том числе миелоидными клетками, в ответ на ЛПС. Молекулярное клонирование и гетерологичная экспрессия генов Tnf человека и мыши позволили связать противоопухолевую активность с действием одного-единственного белка, который попадал под определение «цитокина» – быстрорастущего суперсемейства белковых медиаторов коммуникаций между клетками. Введение мышам рекомбинантного TNF, продуцированного в Escherichia coli, полностью воспроизводило противоопухолевую активность природного TNF [4], причем при больших дозах у мышей проявлялась токсичность, связанная с острой воспалительной реакцией (в экспериментах Л. Олда токсичности не наблюдалось [2], вероятно, вследствие невозможности достичь таких же высоких концентраций, как в опытах с рекомбинантным TNF).

TNF имеет молекулярную массу 17 кДа, но для реализации его физиологических (в том числе противоопухолевых) функций он должен образовать гомотример, который является высокоаффинным лигандом для двух разных рецепторов: TNFR1 (p55) и TNFR2 (p75) [5]. Эти рецепторы различаются как по типу передаваемого внутриклеточного сигнала, так и по паттернам тканеспецифичной экспрессии.

После молекулярного описания TNF и его рецепторов в 80-е гг. прошлого века довольно быстро были открыты другие члены больших семейств TNF-подобных цитокинов (большая часть которых являются мембраносвязанными молекулами) и TNFR-подобных рецепторов, которые способны передавать несколько типов внутриклеточных сигналов, что и определяет биологическую активность лигандов этого семейства [6]. Были опубликованы сотни статей, описывающих активность TNF в различных ситуациях in vitro и in vivo, однако физиологическая функция TNF в контексте целого организма была установлена в 90-е гг. в основном благодаря двум стратегиям обратной генетики, одна из которых заключается в создании мышей с нокаутом гена Tnf, а другая – в получении трансгенных мышей с его сверхэкспрессией. Кроме того, несколько интересных линий мышей были получены методами прямой генетики. Ниже будут обсуждены многочисленные мышиные модели, независимо созданные и охарактеризованные в различных лабораториях, a также так называемые «репортерные» мыши, которые являются дополнительными инструментами для исследования иммунобиологии и физиологии этого интересного цитокина.

Мыши с полным, частичным или регулируемым генетическим дефицитом TNF

Нокаутные технологии, появившиеся до эпохи геномных нуклеаз и получившие свое распространение в 80-х гг. прошлого столетия, основывались на таргетировании генов в линиях эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши (для других животных подобные линии были созданы значительно позже). Низкая эффективность процедуры в мышиных ЭСК приводила к необходимости отбора нокаутных клонов на антибиотике (обычно на неомицине), в результате чего экспрессионная кассета, содержащая ген устойчивости (так называемая «neo-кассета»), навсегда оставалась в составе таргетированного локуса и могла оказывать влияние на активность близлежащих генов. Примечательно, что с момента клонирования гена Tnf мыши до создания первых нокаутных по гену Tnf мышей прошло целых 10 лет. Не менее четырех лабораторий почти одновременно и независимо создали таких мышей (табл. 1), но пальма первенства однозначно досталась лаборатории Дж. Коллиаса в Греции. При создании мышей с нокаутом гена Tnf необходимо было принимать в расчет две его важных особенности. Во-первых, ген Tnf находится очень близко к родственным генам лимфотоксинов Ltα и Ltβ [7], поэтому комбинированные нокауты Tnf/Lt невозможно получить скрещиванием мышей с одиночными нокаутами. Во-вторых, локус Tnf/Lt находится внутри главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) [7], поэтому выведение конгенных линий мышей c модификациями гена Tnf и нужными аллелями генов ГКГ весьма затруднено, и при конструировании нокаутных мышей следует обращать особенное внимание на генетическую основу ЭСК и линий мышей, используемых для последующего возвратного скрещивания.

 

Таблица 1. Мышиные модели с дефицитом TNF

Генотип Tnf/Lt локуса

Описание

Ссылки

Мыши с полным генетическим нокаутом TNF, полученные методами обратной генетики

Tnf–/–

полный нокаут, созданный таргетированием в ЭСК линии EK.CCE из мышей линии 129/Sv, с одним возвратным скрещиванием на C57BL/6

[8]

Tnf–/–

полный нокаут, созданный таргетированием в ЭСК линии W9.5 из мышей линии 129/Sv, с одним возвратным скрещиванием на C57BL/6

[9]

Tnf–/–

полный нокаут, созданный таргетированием в ЭСК из гибрида первого поколения линий мышей C57BL/6 и CBA, с отбором нокаута гена Tnf в гаплотипе C57BL/6 и 5 раундами возвратного скрещивания на C57BL/6

[10, 11]

Tnf–/–

полный нокаут, созданный таргетированием в ЭСК линии BL/6-III на генетической основе C57BL/6

[12]

Tnf–/–

получен из линии мышей, созданной для кондиционного таргетирования TNF на генетической основе 129/Sv, с многократным возвратным скрещиванием на C57BL/6;

таргетированный локус не содержит neo-кассеты

[13, 14]

Мышиные модели с комбинированным нокаутом TNF/LT

Tnf–/–Lta–/–

(TNF/LTα double KO)

полный нокаут генов Lta и Tnf, созданный таргетированием в ЭСК линии s BL/6-III на генетической основе C57BL/6

[12]

Tnf–/–Lta–/–

(TNF/LTα double KO)

полный нокаут генов Lta и Tnf, созданный таргетированием в ЭСК из мышей линии 129/Sv, с одним возвратным скрещиванием на C57BL/6

[15]

Tnf–/–Lta–/–

(TNF/LTα double KO)

полный нокаут генов Lta и Tnf, созданный таргетированием в ЭСК из мышей линии 129/Sv, с одним возвратным скрещиванием на C57BL/6

[16]

Tnf–/–Ltb–/–

(TNF/LTβ double KO)

полный нокаут генов Ltb и Tnf, созданный таргетированием в ЭСК из мышей линии 129/Sv, с многократным возвратным скрещиванием на C57BL/6

[17]

Tnf–/–-Lta–/–Ltb–/–

(TNF/LTα/LTβ triple KO)

полный нокаут генов Lta, Tnf и Ltb, созданный таргетированием в ЭСК из мышей линии 129/Sv, с многократным возвратным скрещиванием на C57BL/6

[18]

Гипоморфный аллель гена Tnf, найденный при помощи прямой генетики

Tnf PanR1/PanR1,

Tnf PanR1/+

в эксперименте по случайному мутагенезу с N-этил-N-нитрозо-мочевиной найден доминантно-негативный мутант с аминокислотной заменой P138T в зрелом белке TNF;

мутация препятствует связыванию с рецептором TNFR1

[19]

Базовая «платформа» для получения кондиционных делеций гена Tnf в мышах

Tnf flox/flox

при помощи генетического нокаута в ЭСК из мышей линии 129/Sv, с многократным возвратным скрещиванием на C57BL/6, ген Tnf обрамлен сайтами LoxP («флоксирован»);

модификация не влияет на активность гена, но обеспечивает в последующем его удаление рекомбиназой Cre в определенных типах клеток и/или индуцируемо

[14]

 

В статье Pasparakis et al. [8] были описаны новые функции TNF, связанные с его ролью в структурно-функциональной организации лимфоидной ткани, о чем первооткрыватели TNF и не догадывались. Здесь следует разъяснить, что в течение 10 лет родственный цитокин, LTα, рассматривался как функциональный аналог TNF, который продуцировался не миелоидными, а лимфоидными клетками. Этот взгляд на лимфотоксин поддерживался тем фактом, что у рекомбинантного белка наблюдалась сходная с TNF противоопухолевая активность на модели перевиваемой саркомы у мышей, а также в культуре клеток, чувствительных к цитотоксическому действию TNF [20]. Эти результаты указывали на возможную вырожденность функций TNF и LTα, что делало интересным и практичным конструирование двойного нокаута обоих генов. В табл. 1 приведены некоторые линии мышей с такими двойными нокаутами. Отметим, что ранее реальную сенсацию принес фенотип нокаута по гену лимфотоксина [21] – у мышей полностью отсутствовали периферические лимфоидные органы, кроме селезенки. Дальнейшее сравнение фенотипов нокаутных мышей позволило разграничить функции TNF и лимфотоксина, например, как было показано в случае органогенеза Пейеровых бляшек [22], что объясняется передачей сигнала от мембранного лимфотоксинового комплекса LTα1/LTβ2 [23] через LTβR [24], а небольшой перекрест функций связан с тем, что растворимый лимфотоксин (LTα3) действительно способен запускать сигнальный каскад in vivo через TNFR1 и TNFR2 [17].

Развитая в начале 1990-х гг. технология кондиционной (тканеспецифичной или индуцируемой) генетической рекомбинации в культуре клеток млекопитающих [25] и затем в клетках трансгенных [26, 27] и нокаутных [28–30] мышей, основанная на системе рекомбинации LoxP/Cre бактериофага P1, совершила подлинную революцию в биологии. Стало возможным, во-первых, обойти проблему эмбриональной летальности, которая характерна для большого числа генов, даже для тех, для которых невырожденная функция в эмбриогенезе не была известна, а во-вторых, – связать отдельные функции генов и их продуктов с конкретным типом клеток-продуцентов. Эта стратегия оказалась особенно плодотворной для исследования генов, продукты которых проявляют плейотропные функции, что характерно для цитокинов и других регуляторных молекул.

Разработка кондиционной панели линий мышей для гена Tnf началась почти 20 лет назад [14], сначала для главных популяций иммуноцитов: миелоидных клеток и лимфоцитов. С помощью этих мышиных моделей было установлено, что конкретные гомеостатические или патогенные функции TNF связаны с определенным типом клеток-продуцентов этого цитокина. Так, миелоидные клетки (в первую очередь макрофаги и нейтрофилы) необходимы для защиты от внутриклеточных инфекций и образования гранулем, но при этом оказались основными источниками системного TNF при различных патологических состояниях, например, при ЛПС-индуцированной токсичности [14]. С другой стороны, TNF, продуцируемый Т- и В-лимфоцитами, проявляет важные гомеостатические функции, в том числе в организации лимфоидной ткани [31]. Позднее были созданы мыши с конститутивной или индуцируемой делецией гена Tnf в дендритных клетках, моноцитах, лимфоцитах [32–34], базофилах, микроглии, тучных клетках [35], клетках эпителия [36, 37], клетках гладких мышц [38, 39] и других. Интересно, что во всех случаях были найдены уникальные фенотипические особенности, связанные с продукцией TNF конкретным клеточным источником.

Мышиные модели, основанные на сверхэкспрессии и/или «гуманизации» TNF

Первая и наиболее известная трансгенная мышиная система, использующая механизм посттранскрипционной регуляции гена Tnf [40], подтвердившая гипотезу о связи сверхэкспрессии TNF c развитием артрита [41] и ставшая широко распространенной доклинической моделью для исследования блокаторов TNF, была создана в лаборатории Kollias [42] в 1991 г. Эта модель явилась важным дополнением к клиническим результатам Maini et al. [43] и Feldmann et al. [44] и позволила обосновать анти-TNF-терапию как инновационную стратегию лечения ревматоидного артрита. В первоначальной работе команды Kollias [42] число трансгенных вставок у мышей составляло несколько десятков, что приводило к проявлению TNF-зависимого полиартрита у всех мышей в возрасте нескольких месяцев. Поэтому к недостаткам этой модели можно отнести раннее развитие только одного вида TNF-зависимого заболевания, что не позволяло моделировать другие аутоиммунные болезни. Позднее, используя ту же генетическую конструкцию, были созданы трансгенные мыши с небольшим числом трансгенных вставок, что позволило «ослабить» патогенный фенотип и расширить спектр применений этой доклинической модели [45] (табл. 2).

 

Таблица 2. Мыши со сверхэкспрессией TNF

Название мышиной модели

Описание

Ссылки

Tgl278

трансгенная линия с геном Tnf человека под контролем сильного промотора, с модификацией 3′-нетранслируемой области (UTR), что приводило к высокой экспрессии TNF человека и вызывала у мышей тяжелый полиартрит;

доклиническая модель для изучения эффектов блокаторов TNF in vivo

[42]

B6.Cg-Tg(TNF)#Xen

то же, но с умеренной экспрессией TNF человека;

улучшенная доклиническая модель

[45]

BPSM1

линия со спонтанной вставкой ретротранспозона в 3′-UTR Tnf мыши, нарушающей ранее неизвестный механизм посттранскрипционной регуляции;

сверхэкспрессия TNF в этой линии мышей приводит не только к тяжелому полиартриту, но и к патологии сердечных клапанов

[46]

TNFdel4, TNFdel5, TNFdel6 и их комбинации

панель линий мышей с нарушением трех участков в 3′-UTR гена Tnf мыши, регулирующих стабильность мРНК;

показано, что нарушение этой системы может приводить к экстремально высокой продукции TNF, вызывающей гибель некоторых эмбрионов

[47]

TNFΔARE

мыши с удалением АТ-богатой области в 3′-UTR гена Tnf мыши при помощи технологии LoxP/Cre;

фенотипически похожи на линии Tgl278 и BPSM1, но, помимо артрита, развивают воспаление в подвздошной кишке тонкого кишечника

[48]

Трансгенные мыши с полным Tnf/ltα/ltβ-локусом человека

все три гена находятся под контролем собственных промоторов/энхансеров;

наблюдалась умеренная сверхэкспрессия генов локуса Tnf/Ltα/Ltβ человека;

у мышей происходила кортикальная атрофия тимуса

[49]

 

Отметим, что в работах Keffer et al. [42] и Hayward et al. [45] ген Tnf человека был подвержен сверхэкспрессии, при этом ген Tnf мыши не удалялся и мог экспрессироваться, а оба рецептора TNF оставались мышиными. По сути, это были частично «гуманизованные» доклинические модели, позволяющие при лечении экспериментальных TNF-опосредованных патологий использовать блокаторы TNF человека, большинство из которых (за исключением этанерцепта) являются видоспецифичными и не работают в системе с TNF мыши. Более продвинутой моделью «гуманизации» стали мыши, в которых ген Tnf человека был вставлен точно на место гена Tnf мыши (генетический «нок-ин»), с сохранением всех регуляторных элементов [50]. У этих мышей не наблюдалось никаких аномалий в развитии или микроархитектуре лимфоидной ткани, при этом TNF человека обеспечивал защитные функции при внутриклеточных инфекциях, что указывало на то, что сигналинг in vivo через рецептор TNFR1 мыши осуществлялся нормально. С другой стороны, TNF человека не способен эффективно активировать TNFR2 мыши [51], что являлось недостатком этой модели гуманизации. Для целого ряда экспериментальных патологий (артрит, острая гепатотоксичность и другие) такое ограничение модели не является проблемой, поскольку большинство биологических эффектов TNF опосредованы TNFR1. Тем не менее в ряде случаев TNFR2 может играть существенную роль, поэтому для устранения данного ограничения и уточнения роли TNFR2 были разработаны мыши с «гуманизацией» как TNF, так и внеклеточного домена TNFR2 с возможностью кондиционной инактивации TNFR2 [52]. С использованием трансгенных мышей, экспрессирующих рекомбиназу Cre одновременно с FoxP3, было показано, что передача сигнала через TNFR2 в Т-регуляторных клетках вносит вклад в защиту центральной нервной системы в модели аутоиммунной патологии [52]. Еще одна интересная линия содержала модифицированный ген Tnf, продукт которого имел аминокислотные вариации, в результате чего практически не образовывалось растворимого TNF [53]. Эксперименты с этой линией мышей позволили впервые установить, что многие in vivo функции TNF опосредованы мембраносвязанной, а не растворимой формой.

Описано несколько мышиных моделей со сверхэкспрессией эндогенного TNF мыши вследствие нарушения участков 3′-UTR гена Tnf, отвечающих за стабильность мРНК (табл. 2). У мышей линии BPSM1 в 3′-UTR произошла спонтанная интеграция ретротранспозона [46], вследствие чего развивается тяжелый полиартрит, а также патология сердечных клапанов. В панели линий мышей с комбинаторным повреждением нескольких участков 3′-UTR, участвующих в контроле стабильности мРНК, наблюдается не только полиартрит и патологии сердца, но в некоторых случаях и эмбриональная летальность вследствие чрезвычайно высокой продукции TNF [47]. Все эти участки затронуты Cre/LoxP-опосредованной делецией и в линии TNFΔARE, созданной в лаборатории Kollias [48] 25 лет назад, поэтому с точки зрения артрита эта модель эквивалентна линии BPSM1 и напоминает линию Tgl278, но с более выраженными признаками системного воспаления.

Учитывая сложность регуляции генов, кодирующих TNF и лимфотоксины, детальное выяснение механизма ускоренной атрофии тимуса у мышей, содержащих в виде трансгенной вставки целый локус Tnf/Lt человека (табл. 2), может потребовать дополнительных исследований [49].

«Репортерные» мыши – важный инструмент для исследования функций TNF

Использование генетических конструкций, кодирующих различные люминесцентные или флуоресцентные белки, существенно расширило возможности детекции и визуализации активности генов in vitro и in vivo [54]. Трансгенные мыши, у которых экспрессия изучаемого белка сопровождается экспрессией белка-репортера, стали широко распространенным инструментом для подобных исследований [55]. В большинстве случаев при трансгенезе используются бицистронные конструкции, направляющие конститутивную или кондиционную экспрессию изучаемого белка и флуоресцентного белка-репортера. Однако возможны и более сложные конструкции, позволяющие следить за клетками определенного ростка клеточной дифференцировки, причем в ходе дифференцировки свечение одного флуоресцентного белка переключается на свечение другого [56].

Известно несколько вариантов репортерных мышей для исследований TNF (табл. 3). В качестве репортерного белка использовали люциферазу, зеленый флуоресцентный белок GFP и дальнекрасный белок Katushka [57]. Возможность детекции репортерных белков используется не только для цитометрии и гистологической идентификации TNF-продуцирующих клеток, но и для прижизненной визуализации.

 

Таблица 3. Репортерные мыши для визуализации экспрессии TNF

Генетическое название мышиной модели

Описание

Ссылки

TNF-2A-Kat (B6.FRFPK +)

бицистронная экспрессия TNF и флуоресцентного белка Katushka с использованием последовательности вирусного 2А-пептида

[58, 59]

hTNF.LucBAC

рекомбинация клона TNF BAC человека, которая привела к замене экзона 1 гена Tnf геном люциферазы

[60]

FVB/N-Tg(CAG-EGFP,-Tnf)1Kul/J

геном мышей с «флоксированной» кассетой eGFP, которая предотвращает транскрипцию кДНК Tnf мыши;

TNF экспрессируется только после Cre-опосредованной рекомбинации

[61]

 

Заключение

TNF оказался удивительно сложным цитокином со множеством функций как в гомеостазе иммунной системы и некоторых неиммунных органов, так и при различных патологиях. Мышиные модели позволили связать как защитные и гомеостатические функции TNF, так и его провоспалительные эффекты, способствующие развитию некоторых патологий, с конкретными типами клеток, продуцирующих TNF. Один вывод, который можно сделать из большого числа работ, обсуждаемых в этом обзоре, состоит в том, что системная блокировка TNF in vivo неизбежно будет давать побочные эффекты за счет нейтрализации гомеостатических и защитных функций TNF. Следовательно, если научиться нейтрализовать TNF только из «патогенного» клеточного источника [62], то могут быть реализованы улучшенные терапевтические стратегии для целого ряда TNF-зависимых заболеваний.

Вклад авторов. САН – концепция; САН, ИВА и ДВК – написание текста; ААК, АВТ и МСД – редактирование текста и внесение важных дополнений. Все авторы участвовали в создании или исследовании линий мышей, обсуждаемых в обзоре.

Финансирование. Работа поддержана грантом Министерства науки и высшего образования РФ «Развитие биоресурсной коллекции “Коллекция лабораторных грызунов SPF-статуса для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований” ИБХ РАН» (Соглашение 075-15-2021-1067). Изучение фенотипа некоторых генетически-модифицированных линий мышей выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-75-30032).

Благодарности. Авторы благодарны своим коллегам С.И. Гривенникову, Л. Тессаролло, А.А. Кучмий, А.Р. Галимову, С.В. Козлову, И.Р. Муфазалову и Р. Науманну за их вклад в создание и изучение некоторых мышиных моделей, обсуждаемых в этом обзоре.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все манипуляции выполняли в соответствии с руководством Федерации европейских научных ассоциаций по лабораторным животным. Эксперименты были одобрены Комиссией по биоэтике ИМБ РАН.

×

About the authors

S. А. Nedospasov

Sirius University; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Division of Immunobiology and Biomedicine; Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, 354340, Federal Territory Sirius; 119991, Moscow

A. A. Kruglov

German Rheumatism Research Center (DRFZ), a Leibniz Institute

Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Laboratory of Systems Rheumatology

Germany, 10117, Berlin

A. V. Tumanov

University of Texas Health Science Center at San Antonio

Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics

United States, 79229, San Antonio, TX

M. S. Drutskaya

Sirius University; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Division of Immunobiology and Biomedicine, Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, 354340, Federal Territory Sirius; 119991, Moscow

I. V. Astrakhantseva

Sirius University

Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Division of Immunobiology and Biomedicine

Russian Federation, 354340, Federal Territory Sirius

D. V. Kuprash

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: sergei.nedospasov@gmail.com

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, 119991, Moscow

References

  1. Parr, I., Wheeler, E., and Alexander, P. (1973) Similarities of the anti-tumour actions of endotoxin, lipid A and double-stranded RNA, Br. J. Cancer, 27, 370-389, https://doi.org/10.1038/bjc.1973.45.
  2. Carswell, E. A., Old, L. J., Kassel, R. L., Green, S., Fiore, N., and Williamson, B. (1975) An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3666-3670, https://doi.org/10.1073/pnas.72.9.3666.
  3. Coley, W. B. (1910) The treatment of inoperable sarcoma by bacterial toxins (the mixed toxins of the Streptococcus erysipelas and the Bacillus prodigiosus), Proc. R. Soc. Med., 3, 1-48.
  4. Pennica, D., Nedwin, G. E., Hayflick, J. S., Seeburg, P. H., Derynck, R., Palladino, M. A., Kohr, W. J., Aggarwal, B. B., and Goeddel, D. V. (1984) Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin, Nature, 312, 724-729, https://doi.org/10.1038/312724a0.
  5. Brenner, D., Blaser, H., and Mak, T. W. (2015) Regulation of tumour necrosis factor signalling: live or let die, Nat. Rev. Immunol., 15, 362-374, https://doi.org/10.1038/nri3834.
  6. Locksley, R. M., Killeen, N., and Lenardo, M. J. (2001) The TNF and TNF receptor superfamilies, Cell, 104, 487-501, https://doi.org/10.1016/S0092-8674(01)00237-9.
  7. Недоспасов, С. А., Шахов, А. Н., Турецкая, Р. Л., Метт, В. А., Георгиев, Г. П. (1985) Молекулярное клонирование генов, кодирующих факторы некроза опухолей человека: тандемное расположение альфа и бета генов в коротком сегменте (6 тыс. пар нуклеодитов) генома человека, Докл. Акад. Наук СССР, 285, 1487-1490.
  8. Pasparakis, M., Alexopoulou, L., Episkopou, V., and Kollias, G. (1996) Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response, J. Exp. Med., 184, 1397-1411, https://doi.org/10.1084/jem.184.4.1397.
  9. Marino, M. W., Dunn, A., Grail, D., Inglese, M., Noguchi, Y., and Richards, E. (1997) Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8093-8098, https://doi.org/10.1073/pnas.94.15.8093
  10. Taniguchi, T., Takata, M., Ikeda, A., Momotani, E., and Sekikawa, K. (1997) Failure of germinal center formation and impairment of response to endotoxin in tumor necrosis factor alpha-deficient mice, Lab. Invest., 77, 647-658.
  11. Iraqi, F., Sekikawa, K., Rowlands, J., and Teale, A. (2001) Susceptibility of tumour necrosis factor-alpha genetically deficient mice to Trypanosoma congolense infection, Paras. Immunol., 23, 445-451, https://doi.org/10.1046/ j.1365-3024.2001.00401.x.
  12. Körner, H., Cook, M., and Riminton, D. S. (1997) Distinct roles for lymphotoxin-α and tumor necrosis factor in organogenesis and spatial organization of lymphoid tissue, Eur. J. Immunol., 27, 2600-2609, https://doi.org/10.1002/eji.1830271020.
  13. Kuprash, D. V., Tumanov, A. V., Liepinsh, D. J., Lemckert, F. A., Hoek, R. M., Ledermann, B., Köntgen, F., De St Groth, B. F., and Sedgwick, J. D. (2005) Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer’s patches, Eur. J. Immunol., 35, 1592-1600, https://doi.org/10.1002/eji.200526119.
  14. Grivennikov, S. I., Tumanov, A. V., Liepinsh, D. J., Kruglov, A. A., Marakusha, B. I., Shakhov, A. N., Murakami, T., Drutskaya, L. N., Förster, I., Clausen, B. E., Tessarollo, L., Ryffel, B., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2005) Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by T cells and macrophages/neutrophils, Immunity, 22, 93-104, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2004.11.016.
  15. Eugster, H.-P., Muller, M., Karrer, U., Car, B. D., Schnyder, B., Eng, V. M., Woerly, G., Hir, M. L., Padova, F. D., Aguet, M., Zinkernagel, R., Bluethmann, H., and Ryffel, B. (1996) Multiple immune abnormalities in tumor necrosis factor and lymphotoxin-α double-deficient mice, Int. Immunol., 8, 23-36, https://doi.org/10.1093/intimm/8.1.23.
  16. Amiot, F., Bellkaid, Y., Lebastard, M., Ave, P., Dautry, F., and Milon, G. (1996) Abnormal organisation of the splenic marginal zone and the correlated leukocytosis in lymphotoxin-alpha and tumor necrosis factor alpha double deficient mice, Eur. Cytokine Netw., 7, 733-739.
  17. Kuprash, D. V., Alimzhanov, M. B., Tumanov, A. V., Anderson, A. O., Pfeffer, K., and Nedospasov, S. A. (1999) TNF and lymphotoxin beta cooperate in the maintenance of secondary lymphoid tissue microarchitecture but not in the development of lymph nodes, J. Immunol., 15, 6575-6580.
  18. Kuprash, D. V., Alimzhanov, M. B., Tumanov, A. V., Grivennikov, S. I., Shakhov, A. N., Drutskaya, L. N., Marino, M. W., Turetskaya, R. L., Anderson, A. O., Rajewsky, K., Pfeffer, K., and Nedospasov, S. A. (2002) Redundancy in tumor necrosis factor (TNF) and lymphotoxin (LT) signaling in vivo: mice with inactivation of the entire TNF/LT locus versus single-knockout mice, Mol. Cell. Biol., 22, 8626-8634, https://doi.org/10.1128/MCB.22.24. 8626-8634.2002.
  19. Rutschmann, S., Hoebe, K., Zalevsky, J., Du, X., Mann, N., Dahiyat, B. I., Steed, P., and Beutler, B. (2006) PanR1, a dominant negative missense allele of the gene encoding TNF-α (Tnf), does not impair lymphoid development, J. Immunol., 176, 7525-7532, https://doi.org/10.4049/jimmunol.176.12.7525.
  20. Gray, P. W., Aggarwal, B. B., Benton, C. V., Bringman, T. S., Henzel, W. J., Jarrett, J. A., Leung, D. W., Moffat, B., Ng, P., Svedersky, L. P., Palladino, M. A., and Nedwin, G. E. (1984) Cloning and expression of cDNA for human lymphotoxin, a lymphokine with tumour necrosis activity, Nature, 312, 721-724, https://doi.org/10.1038/ 312721a0.
  21. De Togni, P., Goellner, J., Ruddle, N. H., Streeter, P. R., Fick, A., Mariathasan, S., Smith, S. C., Carlson, R., and Shornick, L. P. (1994) Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin, Science, 264, 703-707, https://doi.org/10.1126/science.8171322.
  22. Gogoleva, V. S., Kuprash, D. V., Grivennikov, S. I., Tumanov, A. V., Kruglov, A. A., and Nedospasov, S. A. (2022) LTα, TNF, and ILC3 in Peyer’s patch organogenesis, Cells, 11, 1970, https://doi.org/10.3390/cells11121970.
  23. Browning, J., Ngam-ek, A., Lawton, P., DeMarinis, J., Tizard, R., Chow, E. P., Hession, C., O’Brine-Greco, B., Foley, S. F., and Ware, C. F. (1993) Lymphotoxin beta, a novel member of the TNF family that forms a heteromeric complex with lymphotoxin on the cell surface, Cell, 72, 847-856, https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90574-A.
  24. Crowe, P. D., VanArsdale, T. L., Walter, B. N., Ware, C. F., Hession, C., Ehrenfels, B., Browning, J. L., Din, W. S., Goodwin, R. G., and Smith. C. A. (1994) A lymphotoxin-β-specific receptor, Science, 264, 707-710, https://doi.org/10.1126/science.8171323.
  25. Sauer, B., and Henderson, N. (1988) Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5166-5170, https://doi.org/10.1073/pnas.85.14.5166.
  26. Lakso, M., Sauer, B., Mosinger, B., Lee, E. J., Manning, R. W., Yu, S. H., Mulder, K. L., and Westphal, H. (1992) Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-6236, https://doi.org/10.1073/pnas.89.14.6232.
  27. Orban, P. C., Chui, D., and Marth, J. D. (1992) Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6861-6865, https://doi.org/10.1073/pnas.89.15.6861.
  28. Gu, H., Zou, Y. R., and Rajewsky, K. (1993) Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting, Cell, 73, 1155-1164, https:// doi.org/10.1016/0092-8674(93)90644-6.
  29. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., and Rajewsky, K. (1995) Inducible gene targeting in mice, Science, 269, 1427-1429, https://doi.org/10.1126/science.7660125.
  30. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., and Rajewsky, K. (1994) Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting, Science, 265, 103-106, https://doi.org/10.1126/ science.8016642.
  31. Tumanov, A. V., Grivennikov, S. I., Kruglov, A. A., Shebzukhov, Y. V., Koroleva, E. P., Piao, Y., Cui, C.-Y., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2010) Cellular source and molecular form of TNF specify its distinct functions in organization of secondary lymphoid organs, Blood, 116, 3456-3464, https://doi.org/10.1182/blood-2009-10-249177.
  32. Wolf, Y., Shemer, A., Polonsky, M., Gross, M., Mildner, A., Yona, S., David, E., Kim, K-W., Goldmann, T., Amit, I., Heikenwalder, M., Nedospasov, S., Prinz, M., Friedman, N., and Jung, S. (2017) Autonomous TNF is critical for in vivo monocyte survival in steady state and inflammation, J. Exp. Med., 214, 905-917, https://doi.org/10.1084/jem.20160499.
  33. Kruglov, A., Drutskaya, M., Schlienz, D., Gorshkova, E., Kurz, K., Morawietz, L., and Nedospasov, S. (2020) Contrasting contributions of TNF from distinct cellular sources in arthritis, Ann. Rheum. Dis., 79, 1453-1459, https://doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-216068.
  34. Wen, Y., Rudemiller, N. P., Zhang, J., Robinette, T., Lu, X., Ren, J., Privratsky, J. R., Nedospasov, S. A., and Crowley, S. D. (2020) TNF-α in T lymphocytes attenuates renal injury and fibrosis during nephrotoxic nephritis, Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 318, F107-F116, https://doi.org/10.1152/ajprenal.00347.2019.
  35. Dudeck, J., Kotrba, J., Immler, R., Hoffmann, A., Voss, M., Alexaki, V. I., Morton, L., Jahn, S. R., Katsoulis-Dimitriou, K., Winzer, S., Kollias, G., Fischer, T., Nedospasov, S. A., Dunay, I. R., Chavakis, T., Müller, A. J., Schraven, B., Sperandio, M., and Dudeck, A. (2021) Directional mast cell degranulation of tumor necrosis factor into blood vessels primes neutrophil extravasation, Immunity, 54, 468-483.e5, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.12.017.
  36. Ninnemann, J., Winsauer, C., Bondareva, M., Kühl, A. A., Lozza, L., Durek, P., Lissner, D., Siegmund, B., Kaufmann, S. H. E., Mashreghi, M-F., Nedospasov, S. A., and Kruglov, A. A. (2022) TNF hampers intestinal tissue repair in colitis by restricting IL-22 bioavailability, Mucosal. Immunol., 15, 698-716, https://doi.org/10.1038/s41385-022-00506-x.
  37. Lakin, R., Polidovitch, N., Yang, S., Parikh, M., Liu, X., Debi, R., Gao, X., Chen, W., Guzman, C., Yakobov, S., Izaddoustdar, F., Wauchop, M., Lei, Q., Xu, W., Nedospasov, S. A., Christoffels, V. M., and Backx, P. H. (2023) Cardiomyocyte and endothelial cells play distinct roles in the tumour necrosis factor (TNF)-dependent atrial responses and increased atrial fibrillation vulnerability induced by endurance exercise training in mice, Cardiovasc. Res., 119, 2607-2622, https://doi.org/10.1093/cvr/cvad144.
  38. Kroetsch, J. T., Levy, A. S., Zhang, H., Aschar-Sobbi, R., Lidington, D., Offermanns, S., Nedospasov, S. A., Backx, P. H., Heximer, S. P., and Bolz, S.-S. (2017) Constitutive smooth muscle tumour necrosis factor regulates microvascular myogenic responsiveness and systemic blood pressure, Nat. Commun., 8, 14805, https://doi.org/10.1038/ncomms14805.
  39. Dinh, D. D., Lidington, D., Kroetsch, J. T., Ng, C., Zhang, H., Nedospasov, S. A., Heximer, S. P., and Bolz, S-S. (2020) Experimental subarachnoid hemorrhage drives catecholamine-dependent cardiac and peripheral microvascular dysfunction, Front. Physiol., 11, 402, https://doi.org/10.3389/fphys.2020.00402.
  40. Han, J., Brown, T., and Beutler, B. (1990) Endotoxin-responsive sequences control cachectin/tumor necrosis factor biosynthesis at the translational level, J. Exp. Med., 171, 465-475, https://doi.org/10.1084/jem.171.2.465.
  41. Yocum, D. E., Esparza, L., Dubry, S., Benjamin, J. B., Volz, R., and Scuderi, P. (1989) Characteristics of tumor necrosis factor production in rheumatoid arthritis, Cell. Immunol., 122, 131-145, https://doi.org/10.1016/0008-8749(89)90154-8.
  42. Keffer, J., Probert, L., Cazlaris, H., Georgopoulos, S., Kaslaris, E., Kioussis, D., and Kollias, G. (1991) Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis, EMBO J., 10, 4025-4031, https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1991.tb04978.x.
  43. Maini, R. N., Elliott, M., Brennan, F. M., Williams, R. O., and Feldmann, M. (1994) Targeting TNF alpha for the therapy of rheumatoid arthritis, Clin. Exp. Rheumatol., 12 Suppl 11, S63-S66.
  44. Feldmann, M., Elliott, M. J., Maini, R. N., and Woody, J. N. (1997) Anti-tumor necrosis factor-α therapy of rheumatoid arthritis, Adv. Immunol., 64, 283-350, https://doi.org/10.1016/S0065-2776(08)60891-3.
  45. Hayward, M. D., Jones, B. K., Saparov, A., Hain, H. S., Trillat, A.-C., Bunzel, M. M., Corona, A., Li-Wang, B., Strenkowski, B., Giordano, C., Shen, H., Arcamone, E., Weidlick, J., Vilensky, M., Tugusheva, M., Felkner, R. H., Campbell, W., Rao, Y., Grass, D. S., and Buiakova, O. (2007) An extensive phenotypic characterization of the hTNFα transgenic mice, BMC Physiol., 7, 13, https://doi.org/10.1186/1472-6793-7-13.
  46. Lacey, D., Hickey, P., Arhatari, B. D., O’Reilly, L. A., Rohrbeck, L., Kiriazis, H., Du, X.-J, and Bouillet, P. (2015) Spontaneous retrotransposon insertion into TNF 3′UTR causes heart valve disease and chronic polyarthritis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 9698-9703, https://doi.org/10.1073/pnas.1508399112.
  47. Clayer, E., Dalseno, D., Kueh, A., Lacey, D., Tsai, M., Arvell, E. H., et al. (2020) Severe impairment of TNF post-transcriptional regulation leads to embryonic death, iScience, 23, 101726, https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101726.
  48. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., and Kollias, G. (1999) Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies, Immunity, 10, 387-398, https://doi.org/10.1016/s1074-7613(00)80038-2.
  49. Liepinsh, D. J., Kruglov, A. A., Galimov, A. R., Shakhov, A. N., Shebzukhov, Y. V., Kuchmiy, A. A., Grivennikov, S. I., Tumanov, A. V., Drutskaya, M. S., Feigenbaum, L., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2009) Accelerated thymic atrophy as a result of elevated homeostatic expression of the genes encoded by the TNF/lymphotoxin cytokine locus, Eur. J. Immunol., 39, 2906-2915, https://doi.org/10.1002/eji.200839191.
  50. Olleros, M. L., Chavez-Galan, L., Segueni, N., Bourigault, M. L., Vesin, D., Kruglov, A. A., Drutskaya, M. S., Bisig, R., Ehlers, S., Aly, S., Walter, K., Kuprash, D. V., Chouchkova, M., Kozlov, S. V., Erard, F., Ryffel, B., Quesniaux, V. F. J., Nedospasov, S. A., and Garcia, I. (2015) Control of mycobacterial infections in mice expressing human tumor necrosis factor (TNF) but not mouse TNF, Infect. Immun., 83, 3612-3623, https://doi.org/10.1128/IAI.00743-15.
  51. Ameloot, P., Fiers, W., De Bleser, P., Ware, C. F., Vandenabeele, P., and Brouckaert, P. (2001) Identification of tumor necrosis factor (TNF) amino acids crucial for binding to the murine p75 TNF receptor and construction of receptor-selective mutants, J. Biol. Chem., 276, 37426-37430, https://doi.org/10.1074/jbc.M102020200.
  52. Atretkhany, K-S. N., Mufazalov, I. A., Dunst, J., Kuchmiy, A., Gogoleva, V. S., Andruszewski, D., Drutskaya, M. S., Faustman, D. L., Schwabenland, M., Prinz, M., Kruglov, A. A., Waisman, A., and Nedospasov, S. A. (2018) Intrinsic TNFR2 signaling in T regulatory cells provides protection in CNS autoimmunity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 13051-13056, https://doi.org/10.1073/pnas.1807499115.
  53. Ruuls, S. R., Hoek, R. M., and Ngo, V. N. (2001) Membrane-bound TNF supports secondary lymphoid organ structure but is subservient to secreted TNF in driving autoimmune inflammation, Immunity, 15, 533-543, https:// doi.org/10.1016/s1074-7613(01)00215-1.
  54. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A., Zambito, G., and Mezzanotte, L. (2010) Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues, Physiol. Rev., 90, 1103-1163, https://doi.org/10.1152/physrev.00038.2009.
  55. Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., and Mezzanotte, L. (2022) Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models, Mol. Imaging Biol., 24, 250-263, https://doi.org/10.1007/s11307-021-01662-5.
  56. Rubtsov, Y. P., Niec, R. E., Josefowicz, S., Li, L., Darce, J., Mathis, D., Benoist, C., and Rudensky, A. Y. (2010) Stability of the regulatory T cell lineage in vivo, Science, 329, 1667-1671, https://doi.org/10.1126/science.1191996.
  57. Shcherbo, D., Merzlyak, E. M., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Ermakova, G. V., Solovieva, E. A., Lukyanov, K. A., Bogdanova, E. A., Zaraisky, A. G., Lukyanov, S., and Chudakov, D. M. (2007) Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging, Nat. Methods, 4, 741-746, https://doi.org/10.1038/nmeth1083.
  58. Shebzukhov, Y. V., Kuchmiy, A. A., Kruglov, A. A., Zipp, F., Siffrin, V., and Nedospasov, S. A. (2014) Experimental Applications of TNF-Reporter Mice with Far-Red Fluorescent Label, in The TNF Superfamily (Bayry, J., ed) New York, Springer New York, pp. 151-162, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0669-7_13.
  59. Кучмий А. А., Круглов А. А., Галимов А. Р., Шебзухов Ю. В., Чудаков Д. М., Лукьянов С. А., Недоспасов С. А. (2011) Новая линия трансгенных репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей, Росс. Иммунол. Журн., 5, 3-4.
  60. Minshawi, F., White, M. R. H., Muller, W., Humphreys, N., Jackson, D., Campbell, B. J., Adamson, A., and Papoutsopoulou, S. (2019) Human TNF-Luc reporter mouse: a new model to quantify inflammatory responses, Sci. Rep., 9, 193, https://doi.org/10.1038/s41598-018-36969-x.
  61. Hall, B. E., Zhang, L., Sun, Z. J., Utreras, E., Prochazkova, M., Cho, A., Terse, A., Arany, P., Dolan, J. C., Schmidt, B. L., and Kulkarni, A. B. (2016) Conditional TNF-α overexpression in the tooth and alveolar bone results in painful pulpitis and osteitis, J. Dent. Res., 95, 188-195, https://doi.org/10.1177/0022034515612022.
  62. Drutskaya, M. S., Efimov, G. A., Astrakhantseva, I. V., Kruglov, A. A., and Nedospasov, S. A. (2018) Making anti-cytokine therapy more selective: studies in mice, Cytokine, 101, 33-38, https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.08.022.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».