Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein (LPAP) as CD45 protein stability regulator

Full Text

Принятые сокращения: LPAP – ассоциированный с фосфатазой лимфоцитарный фосфопротеин; mKO – моноклональная культура с нокаутом гена интереса; pKO – поликлональная культура с нокаутом гена интереса.

Введение

Ассоциированный с фосфатазой лимфоцитарный фосфопротеин (LPAP) впервые был описан как молекула, тесно связанная с фосфатазой CD45 [1]. Белок CD45 играет важную роль в активации лимфоцитов, и он исследован довольно хорошо [2]. LPAP, в отличие от своего партнёра, изучен недостаточно полно. LPAP не имеет гомологов в протеоме человека и его функция до сих пор неизвестна. В литературе имеются лишь косвенные данные о его роли в активации Т-клеток и в развитии В-клеток [3]. Тесная связь LPAP с фосфатазой CD45 и его множественное фосфорилирование, в том числе ERK-зависимое фосфорилирование по Ser163, позволяют предположить, что этот белок – один из участников активационного каскада [4, 5]. Молекула CD45 способна регулировать киназу Lck, необходимую для запуска активационного каскада лимфоцитов после стимуляции Т-клеточного антигенспецифического рецептора (TCR). Взаимодействуя с CD45, LPAP может влиять на передачу сигнала от TCR лимфоцитов.

Образование прочного комплекса между LPAP и CD45 позволяет предположить, что эти белки связаны функционально. Поскольку LPAP не имеет фосфорилированных тирозинов, он не является непосредственным субстратом фосфатазы CD45, которая дефосфорилирует только модифицированные тирозины. Имеются некоторые указания на то, что LPAP препятствует образованию димеров CD45, которые характеризуются сниженной по сравнению с мономерной формой фосфатазной активностью, и, таким образом, опосредованно регулирует активность CD45 [6].

В ряде наблюдений было показано, что молекула CD45 важна для поддержания стабильности LPAP и его мышиного гомолога CD45-AP. Во-первых, в лимфоцитарных клеточных линиях с нокдауном фосфатазы CD45 белок LPAP синтезируется, но быстро деградирует [1]. Во-вторых, в экспериментах на линии T-клеток с индуцируемой экспрессией CD45 установлено, что накопление белка LPAP в клетке начинается только после активации синтеза CD45 [7]. Нокдаун CD45 с помощью короткой шпилечной РНК (shRNA) снижает уровень белка LPAP [8]. Данные об обратном влиянии LPAP на CD45 ограничены и противоречивы. В лимфоцитах двух линий мышей с нокаутом LPAP уровень белка CD45 снижен [9, 10], в третьей нокаутной по LPAP линии мышей такого эффекта не наблюдалось [11], как и в клетках Jurkat с нокдауном LPAP [12].

Данные литературы указывают на то, что влияние CD45 на уровень белка LPAP осуществляется на посттранскрипционном уровне [1, 13]. Так, в клетках Jurkat WT (CD45+) и J45.01 (CD45−) детектируется высокий уровень мРНК LPAP, но белок обнаруживается только в клетках Jurkat дикого типа. При трансфекции конструкции, кодирующей CD45, в клетки J45.01 уровень белка LPAP восстанавливался [1]. Транскрипционный анализ CD45+ и CD45− вариантов Т-лимфоцитов показал, что продукция мРНК LPAP и CD45 регулируется независимо друг от друга [13].

Таким образом, совокупность опубликованных данных указывает на связь между уровнями белков LPAP и CD45. Мы предположили, что LPAP для CD45 выполняет роль шаперона, который контролирует стабильность и уровень белка CD45. Для проверки этого предположения были получены клетки Jurkat, нокаутные по CD45 или по LPAP, а также серия линий с различным уровнем белка LPAP. На этих линиях показана корреляция между уровнями белков LPAP и CD45. Существование корреляции подтверждено на клональных и поликлональных популяциях. Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что функция LPAP состоит в регуляции экспрессии CD45 в клетке.

Материалы и методы

Культивирование клеток, антитела и проточная цитометрия. Клетки линий Jurkat и K562 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота, L-глутамина (4 мМ) и гентамицина (80 мг/л) (все реагенты – «ПанЭко», Россия) в увлажнённой атмосфере с 5%-ным СО₂ при 37 °С. Мышиные моноклональные антитела CL7 (IgG2a, анти-LPAP), LT45 (IgG2a, анти-CD45), EC101 (IgG1, анти-CD59), MC7E7 (IgG1, анти-CD98) были получены ранее в нашей лаборатории [4]. Были также использованы антитела анти-CD69-PE («BioLegend», США), OKT3 («eBioscience», США), анти-Flag М2 («Sigma-Aldrich», США).

При внутриклеточном окрашивании к осадку клеток добавляли 1 мл PBS с 1%-ным параформальдегидом и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки два раза отмывали в PBS, осадок ресуспендировали в буфере для пермеабилизации (PBS, содержащий 0,1%-ный сапонин, 0,1%-ный БСА, 0,05%-ный NaN₃). Клетки в пермеабилизирующем буфере смешивали с антителом CL7-Alexa 594 или LT45-Alexa 594 и инкубировали 30 мин, после чего два раза отмывали в пермеабилизирующем буфере. При поверхностном окрашивании реакцию и отмывки вели в PBS. Флуоресценцию окрашенных клеток измеряли на приборе CytoFLEX S («Beckman Coulter», США). Клетки сортировали с помощью прибора FACSAria II («Becton Dickinson Biosciences», США).

Создание клеточных линий Jurkat с нокаутом по LPAP или CD45 с помощью CRISPR/Cas9 методом double-nicking. Две таргетные последовательности для генов PTPRCAP и PTPRC, кодирующих LPAP и CD45 соответственно, выбирали с помощью онлайн-ресурса www.genome-engineering.org [14]. Олигонуклеотиды синтезировали в компании «Евроген» (таблица).

 

Олигонуклеотиды для гидовых РНК (gRNA) PTPRCAP и PTPRC

Название	Последовательность
5′-gR-LPAP-1	CACCGCATCCCGAGCCCTAAGGTGC
3′-gR-LPAP-1	AAACGCACCTTAGGGCTCGGGATGC
5′-gR-LPAP-3	CACCGCGCTGCCACCCGAGCCCAAG
3′-gR-LPAP-3	AAACCTTGGGCTCGGGTGGCAGCGC
5′-gRNA-CD45-1	CACCGAAATGACAGCGCTTCCAGAA
3′-gRNA-CD45-1	AAACTTCTGGAAGCGCTGTCATTTC
5′-gRNA-CD45-2	CACCGAGGTGATATTACCCTCAGTC
3′-gRNA-CD45-2	AAACGACTGAGGGTAATATCACCTC
5′-2A-LPAP	CGAAAGTGGTCTTGGTCACCCAGCCTGCCCCACACCAGGCCCCACCCCAGGTGCTGAGCCCTCTGAGCCCCTGCCTGTCTCCCACAGGCTCTGCCCTGCGGATCCGGCGCAACAAAC
3′-2A-LPAP	GGCGGCGCCAGGCCAGTGCTAGGCCAGTGGCCAGCAGTAGGAGCAGCAGCAGCAGCAGGACAACGGTGACAGAGCTGGAGCCCACGCTGTCCTCCGCACACAAAAAACCAACACAC

Примечание. Последовательности плеч гомологии подчёркнуты, а жирным выделены области комплементарности к матричной плазмиде.

 

Олигонуклеотиды отжигали и клонировали в вектор pKS-gRNA-BB по рестрикционному сайту BbsI [15, 16]. Для осуществления нокаута клетки Jurkat (1,5 × 106) трансфицировали с помощью системы для электропорации Neon («Thermo Fisher Scientific», США) по протоколу производителя. Смесь для электропорации в буфере R содержала по 0,5 мкг плазмид, кодирующих гидовые РНК gR-LPAP-1 и gR-LPAP-3 для нокаута LPAP или gRNA-CD45-1 и gRNA-CD45-2 для нокаута CD45, и 3 мкг плазмиды pcDNA3.3-Cas9 D10A (#41816, «Addgene», США). В случае нокаутирования LPAP через 24 ч после трансфекции клетки клонировали в 96-луночный планшет, через три недели тестировали на экспрессию LPAP и выбирали нокаутные клоны. В случае нокаутирования CD45 через 5 суток после трансфекции оценивали экспрессию CD45 в клетках, наращивали и сортировали популяцию, негативную по CD45.

Создание клеточных линий Jurkat с нокаутом по LPAP методом SORTS. Нокаутирование проводили по методу SORTS (Surface Oligopeptide knock-in for Rapid Target Selection) [17]. Кратко, принцип метода состоял в следующем. С помощью технологии CRISPR/Cas9 в ген целевого белка вставлялась короткая ДНК-конструкция (процесс, который также называется нокин), которая блокировала экспрессию эндогенного белка. При этом в клетках с нокаутом на плазматической мембране экспрессировался маркерный пептид. Наличие метки позволяло отбирать клетки с нокаутом, а использование двух меток – клетки с нокаутом по двум аллелям. С этой целью в компании «Евроген» заказывали синтез двух олигонуклеотидов с плечами гомологии: 5′-2A-LPAP и 3′-2A-LPAP (таблица).

Полученные олигонуклеотиды использовали в качестве праймеров для получения донорной ДНК. Матрицей для ПЦР служили плазмиды pUCHR-mClover-AID-P2A-CD5HA2-bglpA и pUCHR-mClover-AID-P2A-CD5Flag2-bglpA, предназначенные для введения в геном клеток конструкций, кодирующих пептидную метку НА или Flag соответственно [17]. ПЦР-Продукты разгоняли в 1%-ном агарозном геле, вырезали фрагмент размером около 450 п.о., который затем выделяли из геля с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit (#K0692, «Thermo Fisher Scientific») по инструкции производителей. Концентрацию продуктов измеряли на приборе NanoDrop-2000 («Thermo Fisher Scientific»).

Для осуществления нокаута клетки Jurkat (1,5 × 106) трансфицировали с помощью системы для электропорации Neon, как описано выше. Смесь для электропорации в буфере R содержала по 0,5 мкг плазмид, кодирующих гидовые РНК gR-LPAP-1 и gR-LPAP-3, 3 мкг плазмиды pcDNA3.3-Cas9 D10A (#41816, «Addgene»), 0,4 мкг донорной ДНК (очищенный ПЦР-продукт, см. выше), кодирующей метку НА, и 0,7 мкг донорной ДНК, кодирующей метку Flag. Через 5 суток после трансфекции клетки тестировали на эффективность моно- и биаллельного нокина по экспрессии эпитопных тагов HA и Flag, используя проточную цитометрию. Клетки наращивали и проводили несколько раундов сортировки позитивных популяций. Полученные клетки для простоты назвали LPAPpKO (KO – нокаут, pKO – поликлональная культура с нокаутом гена интереса).

Получение клеточных линий со стабильной экспрессией LPAP. Клетки HEK293Т сеяли по 0,1 млн на лунку 24-луночного планшета, через день культивирования проводили трансфекцию с помощью реагента Lipofectamine 2000 («Invitrogen», США). Для этого использовали три плазмиды: 0,87 мкг упаковочного вектора ВИЧ-1 pCMVΔ8.2R (#12263, «Addgene»), 1,3 мкг вектора переноса pUCHR-LPAP-wt, 0,27 мкг плазмиды pCMV VSVG (#8454, «Addgene»), кодирующей белок G из вируса везикулярного стоматита. Через 6 ч меняли среду, через 48 ч отбирали супернатант и фильтровали его через 0,45-мкм фильтр. Для трансдукции клетки-мишени сеяли по 0,1 млн на лунку 24-луночного планшета и добавляли по 250 мкл супернатанта, содержащего лентивирус. Через 2 суток оценивали эффективность трансдукции с помощью проточной цитометрии. Пул трансдуцированных клеток клонировали, клоны тестировали методом проточной цитометрии.

Активация клеток. Клетки активировали с помощью 10 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA, «Sigma-Aldrich»), культивируя в течение 4 ч. Альтернативно клетки активировали путём культивирования 24 ч в планшетах, лунки которых были предварительно покрыты анти-CD3 антителом OKT3 («eBioscience», США) в концентрации от 0,1 до 10 мкг/мл. Активацию останавливали путём добавления к клеткам холодного PBS.

Иммунопреципитация (IP). Клетки суспендировали на холоду в лизирующем буфере, содержавшем 1% (w/v) Triton Х-100, 20 мM Tris-HCl (pH 8,0), 150 мM NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мМ NaF и 1 мМ ортованадата натрия (все реагенты – «Merck», США). После 30 мин инкубации на льду ядра и нерастворимые клеточные мембраны удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 4 °C (20 000 g). IP проводили с помощью антител CL7 или LT45, ковалентно иммобилизованных на носителе AffiGel-Hz («Bio-Rad», США). Иммунопреципитаты трижды отмывали в лизирующем буфере, белок элюировали в буфере образца для SDS-PAGE (62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 10%-ный глицерин, 2%-ный SDS, 1%-ный 2-меркаптоэтанол и 0,05%-ный бромфеноловый синий) прогреванием в течение 5 мин при 80 °С.

Электрофорез и Вестерн-блоттинг (WB). Элюированные белки разделяли электрофорезом в 10- или 18%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях в буферной системе Лэммли. После SDS-PAGE белки переносили на PVDF-мембрану полусухим методом. Мембрану блокировали 5%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS с 0,1%-ным Tween-20. Антигены проявляли с помощью первичных, а затем вторичных антител против мышиного IgG, меченных пероксидазой хрена («GE Healthcare», США). Сигнал детектировали на приборе ChemiDoc XRS («Bio-Rad») с использованием реагентов для хемилюминесценции фирмы «Millipore» (США).

Статистическая обработка данных. Для статистического анализа и визуализации данных использовали программу GraphPad Prism 8 («GraphPad Software», США). Данные сравнивались с помощью одновыборочного t-критерия. На рисунках приведены средние значения ± стандартное отклонение (SD). Корреляцию оценивали с использованием непараметрического критерия Спирмена.

Результаты исследований

Уровень белков LPAP и CD45 падает в отсутствии белка-партнёра. Ранее было обнаружено, что в отсутствии фосфатазы CD45 уровень LPAP в клетке падает [1]. В то же время данные об обратном влиянии LPAP на экспрессию CD45 противоречивы. Для того чтобы оценить взаимное влияние этих двух белков, мы, используя технологию CRISPR/Cas9, получили клетки Jurkat, нокаутные по CD45 или LPAP.

Мы обнаружили, что в T-клеточной линии Jurkat, нокаутной по CD45, уровень LPAP составлял лишь 10% от количества белка на родительской линии, что соответствовало уровню аутофлуоресценции клеток дикого типа (рис. 1, а, б). Чтобы более полно изучить взаимосвязь между экспрессией LPAP и CD45, мы создали панель сублиний Jurkat LPAPKO с помощью двух различных подходов. Во-первых, мы использовали «традиционный» способ нокаутирования гена LPAP с помощью технологии CRISPR/Cas9 и путём последующего клонирования получили серию моноклональных культур Jurkat LPAPKO (далее обозначены LPAPmKO, mKO – моноклональная культура с нокаутом гена интереса). Во-вторых, с помощью недавно разработанного метода SORTS [18] мы получили поликлональную линию Jurkat, нокаутную по гену LPAP (далее обозначена LPAPpKO). Второй подход имеет некоторые преимущества. Во-первых, клеточная линия Jurkat является гетерогенной и при работе с отдельными клонами этой линии велик риск того, что наблюдаемый фенотип обусловлен особенностями конкретного клона, а не экспериментальным воздействием. Во-вторых, было показано, что клоны могут сильно отличаться от родительской популяции и поликлональной популяции нокаутов, полученных методом сортировки, из-за закрепления нецелевых изменений генома [17–19].

 

Рис. 1. Уровень белков LPAP и CD45 падает в отсутствии белка-партнёра. а – Репрезентативные цитограммы экспрессии LPAP на клетках Jurkat дикого типа (WT), а также на клетках CD45KO или LPAPKO; б – экспрессия LPAP по результатам тестирования 7 клонов CD45KO; в, г – экспрессия CD45 и «посторонних» белков CD59 и CD98 в культурах Jurkat LPAPmKО (в) или в LPAPpKO (г). Уровни экспрессии белков LPAP, CD45, CD59 и CD98 определяли с помощью проточной цитометрии. Нормализованный уровень экспрессии CD45 сравнивали с контрольным значением 100 с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (б). Для сравнения уровня белков в клетках дикого типа и нокаутных использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки (в, г), **** p < 0,0001

 

Во всех культурах Jurkat LPAPmKO экспрессия CD45 оказалась сниженной и в среднем составила 30% от уровня дикого типа (рис. 1, в). Уровень CD45 в клетках Jurkat LPAPpKO составлял 37% от уровня CD45 в клетках дикого типа (рис. 1, г). Согласие между данными, полученными на отдельных клонах и на поликлональной популяции, позволяет исключить вклад межклональной вариабельности в наблюдаемый нами фенотип снижения уровня CD45. В контроле в качестве «посторонних» белков мы использовали молекулы CD59 и CD98, для которых отсутствуют данные об их взаимодействии с LPAP. Уровень «посторонних» белков CD59 и CD98 также снижался, но в значительно меньшей степени, чем CD45 (рис. 1, в; p < 0,0001). Это указывает на специфичный характер снижения уровня белка CD45 при нокауте LPAP.

Экспрессия CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP. Обнаружив, что нокаут LPAP приводит к падению уровня белка CD45, мы решили выяснить, способно ли восстановление в клетке уровня LPAP повысить экспрессию фосфатазы. С этой целью мы выбрали один из клонов Jurkat LPAPmKO и с помощью стабильной лентивирусной трансдукции ввели в него ген, кодирующий LPAPWT (LPAP дикого типа). Затем полученную популяцию клонировали и эффект восстановления экспрессии белков LPAP и CD45 оценили с помощью проточной цитометрии. При тестировании 21 субклона Jurkat мы обнаружили высокий уровень корреляции между экспрессией CD45 и LPAP (коэффициент корреляции Спирмена r = 0,77, p < 0,0001) (рис. 2, a). В противоположность этому для тестированных клонов не наблюдалось заметной корреляции между LPAP и посторонним белком CD98 (r = 0,02) (рис. 2, б). В качестве дополнительного контроля мы использовали клоны Jurkat WT, в которых также не прослеживалась корреляция между уровнем LPAP и CD45 (рис. 2, в). Этот контроль показывает, что корреляция, проявляющаяся на рис. 2, а, не является результатом процедуры клонирования.

 

Рис. 2. Уровень CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP. а, б – Корреляция между уровнями LPAP и CD45 (а) или LPAP и CD98 (б) в клонах Jurkat LPAPKO с реэкспрессией LPAPWT; в – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPWT; г, д – уровень LPAP (г) и CD45 (д) на клетках Jurkat LPAPpKO, стабильно трансдуцированных возрастающей дозой вируса для реэкспрессии LPAPWT (#1, #2, #3) или экспрессии GFP. Экспрессия LPAP нормирована относительно клеток Jurkat LPAPWT. Для CD45 показаны значения для поверхностного (sCD45) и общего (tCD45) уровня; е – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPKO, стабильно трансфицированных LPAPWT. Уровни экспрессии определяли по значениям MFI, которые были нормализованы относительно среднего значения для Jurkat WT после вычитания фонового уровня в клетках Jurkat CD45KO или Jurkat LPAPKO. Приведены индивидуальные значения, а также среднее ± SD. Нормализованный уровень экспрессии LPAP в трансдуцированных клетках сравнивали со значением ноль в клетках, экспрессирующих GFP, с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (г). Для сравнения уровня поверхностного (s) и общего (t) CD45 в клетках Jurkat LPAPpKO и трансдуцентах использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки. *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Средние значения для уровня LPAP и sCD45 из панели д использованы для расчёта корреляции (е)

 

Поскольку описанный результат был показан на клетках, полученных из единственного клона Jurkat LPAPKO, и мог быть обусловлен особенностями случайно выбранного клона, мы решили подкрепить его с помощью данных, полученных на поликлональном нокауте. Для этого в клетки Jurkat LPAPрKO путём лентивирусной трансдукции был введён ген, кодирующий LPAPWT, или ген GFP в случае контроля. При трансдукции использовали три возрастающие дозы вируса (#1, #2, #3), после чего в полученных культурах анализировали экспрессию LPAP и CD45 с помощью проточной цитометрии. При увеличении уровня LPAP (рис. 2, г) количество CD45 в клетках также возрастало (рис. 2, д, е). Различие между уровнем поверхностного и общего CD45, наблюдаемое в клетках рKO, не исчезало при реэкспрессии LPAP (рис. 2, д). Это свидетельствует о том, что в отсутствии LPAP происходит именно деградация CD45, а не задержка и накопление зрелой фосфатазы в везикулярной системе клетки.

В клетках с повышенной экспрессией LPAP уровень CD45 возрастает. На предыдущем этапе мы обнаружили корреляцию между уровнями LPAP и CD45 в клетках Jurkat, когда уровень LPAP варьировался от 0% до 100%, а уровень CD45 – от 30% до 100% в перерасчёте на их эндогенные уровни экспрессии. Закономерно возникал вопрос, сохранится ли эта корреляция при дальнейшем увеличении уровня LPAP в клетках. С помощью лентивирусной трансдукции в клетки Jurkat была введена конструкция, которая содержала кассету LPAP-Flag-IRES-GFP. После двух раундов сортировки клеток GFPhi уровень LPAP заметно увеличивался (рис. 3, а). Для того чтобы различить эндогенный LPAP и экзогенный LPAP-Flag, был проведён электрофорез в 18%-ном геле. При этом наблюдалось увеличение интенсивности полосы с повышенной молекулярной массой, которая соответствовала белку LPAP с пептидной меткой Flag, по сравнению с интенсивностью полос эндогенного LPAP (рис. 3, б).

 

Рис. 3. В клетках с повышенной экспрессией LPAP уровень CD45 возрастает. а, б – Уровень белка LPAP анализировали в клеточных линиях Jurkat и Jurkat LPAP-Flag после первой и второй сортировки (sort 1 и sort 2). Клетки лизировали (а, б), белок LPAP или CD45 выделяли с помощью иммунопреципитации (IP) (б), образцы разделяли методом электрофореза в 12%-ном (а) или 18%-ном (б) геле, проводили Вестерн-блоттинг с указанными антителами. Нижний блот (б) окрашивали антителами против Flag и LPAP. Формы LPAP и LPAP-Flag указаны стрелками; в, г – экспрессия LPAP и CD45 на поверхности клеток K562 дикого типа, а также стабильно трансдуцированных LPAP-Flag

 

Мы предположили, что в лимфоидных клетках Jurkat существует особый механизм гомеостатической регуляции уровня LPAP, который невозможно обойти путём лентивирусной трансдукции. С учётом этого мы обратили внимание на клетки К562 эритромиелоидной линии дифференцировки, которые несут на поверхности CD45, но практически лишены эндогенного LPAP (MFI = 3000). После лентивирусной трансдукции клетки K562 экспрессировали LPAP-Flag на высоком уровне (MFI = 116 000) (рис. 3, в). Одновременно с этим в 3,1 раза возрастал и уровень белка CD45 (рис. 3, г). Таким образом, как повышение экспрессии LPAP, так и его эктопическая экспрессия приводят к увеличению экспрессии CD45.

Нокаут LPAP снижает CD3-индуцированную экспрессию активационной молекулы CD69. Одним из ранних проявлений активации клеток является выход на поверхностную мембрану белка CD69. Для того чтобы оценить возможный вклад LPAP в проведение внутриклеточного сигнала, мы сравнили экспрессию молекулы CD69 на клетках Jurkat WT и Jurkat LPAPpKO при активации под действием РМА или антител против рецептора CD3. При стимуляции РМА клетки pKO экспрессировали на 40% меньше молекул CD69, чем клетки дикого типа (рис. 4, а). Затем мы использовали более физиологический стимул – кросс-линкирование CD3 с помощью антитела ОKТ3. Поскольку экспрессия CD69 на клетках Jurkat, активированных OKT3, имеет бимодальное распределение (рис. 4, б, левая панель), мы сравнили нокаутные по LPAP клетки и клетки дикого типа по двум параметрам: проценту активированных клеток и MFI CD69+ клеток из популяции с высоким уровнем CD69 (гейтирование на соответствующие популяции приведено на рис. 4, б, средняя и правая панели).

 

Рис. 4. Сравнение экспрессии молекул CD69 и CD3 на клетках Jurkat дикого типа и с нокаутом по LPAP. а – Экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью РМА; б – экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3; в – экспрессия CD3 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3. Уровни CD69 (б) и CD3 (в) сравнивали с помощью двухвыборочного t-критерия. * p < 0,05, ** p < 0,001, **** p < 0,0001.

 

Клетки Jurkat характеризуются довольно низким уровнем экспрессии CD3, который детектируется только на части клеток. Мы предполагаем, что именно эти клетки отвечают на стимуляцию антителом OKT3, что приводит к бимодальному характеру распределения CD69. При активации через CD3 значимая разница между Jurkat WT и клетками LPAPрKO наблюдалась в образцах с высокой концентрацией OKT3 (10 и 1 мкг/мл). При этом в случае популяции рKO активировались практически все клетки, но уровень CD69 на них был снижен по сравнению с клетками дикого типа (рис. 4, б, левая панель). Эта разница могла быть связана с неодинаковым уровнем CD3 на двух типах клеток (рис. 4, в, левая панель). В популяции pKO процент CD3+-клеток был выше (рис. 4, в, средняя панель), в то время как MFI CD3+-популяции – ниже по сравнению с клетками дикого типа (рис. 4, в, правая панель), что соответствовало результату по экспрессии CD69.

Обсуждение результатов

Роль белка LPAP в клетке остаётся неизвестной, однако образование прочного комплекса с CD45 указывает на то, что функция LPAP может быть связана с регуляцией фосфатазы. Изменение статуса фосфорилирования LPAP при активации клеток позволяет предположить, что LPAP является участником сигнального каскада Т-клеточного рецептора лимфоцитов [5].

Некоторые исследования показывают, что фосфатаза CD45 необходима для поддержания стабильности LPAP [7, 13]. С этим хорошо согласуются полученные нами данные о том, что в клетках Jurkat, нокаутных по CD45, уровень LPAP падает на 90%. Ранее мы показали, что при нокдауне CD45 с помощью shRNA экспрессия LPAP снижалась более чем в два раза [8]. Наконец, клеточная линия J45.01, полученная на основе Jurkat и экспрессирующая лишь 5–8% CD45 по сравнению с диким типом [20], экспрессирует LPAP в три раза меньше, чем дикий тип [8]. Таким образом, имеются согласующиеся между собой данные о том, что при уменьшении уровня CD45 количество LPAP в клетке существенно снижается.

Чтобы ответить на вопрос о возможном влиянии LPAP на уровень белка CD45, мы получили панель сублиний Jurkat, нокаутных по LPAP. Было обнаружено, что в популяции нокаутов уровень CD45 оказался сниженным до 30% от уровня дикого типа. Это наиболее выраженный эффект из всех описанных в литературе [9–11]. Можно было бы предположить, что LPAP влияет не на стабильность фосфатазы CD45, а на её локализацию. Однако наши данные о влиянии LPAP на общий и поверхностный уровень CD45 (рис. 2, д, е) не поддерживают это предположение. Далее мы показали, что при восстановлении экспрессии LPAP уровень CD45 повышался, при этом наблюдалась корреляция между уровнями этих белков. С помощью лентивирусной трансдукции клеток Jurkat нам не удалось добиться существенного превышения уровня LPAP по сравнению с клетками дикого типа. В отличие от этого, клетки эритромиелоидной линии K562, не несущие эндогенного LPAP, были способны к стабильной гиперэкспрессии этого белка. Мы предполагаем, что в лимфоидных клетках существует жёсткий механизм, контролирующий уровень LPAP, который отсутствует в нелимфоидных клетках. Следует отметить, что на клетках Jurkat преимущественно представлена изоформа CD45RB, а на клетках K562 – изоформа CD45R0. Ранее нами было показано, что LPAP ассоциируется со всеми изоформами примерно в равной мере [8], следовательно, различное поведение LPAP на клетках Jurkat и K562 не может быть объяснено связью с различными изоформами CD45.

Данные, которые мы получили ранее, а также результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что фосфатаза CD45 поддерживает стабильность LPAP и влияет на его статус фосфорилирования, а белок LPAP, в свою очередь, способен регулировать уровень CD45. Стабильность белка CD45, вероятно, не полностью определяется молекулой LPAP. Это приводит к тому, что даже при полном нокауте LPAP детектируется не менее 30% белка CD45 от уровня в клетках дикого типа. Косвенные данные показывают, что LPAP может влиять на силу ответа Т-клеток на низкоаффинные лиганды [21], а также участвовать в регуляции дифференцировки В-клеток [3]. Можно предположить, что всё это происходит опосредованно, путём регуляции уровня CD45.

Группой Schraven et al. (1991) было показано, что без CD45 белок LPAP синтезируется, но быстро деградирует [7]. Можно предположить, что верно и обратное утверждение в отношении стабильности CD45. Возможно, что в отсутствии белка-партнёра в молекулах CD45 и LPAP остаются открытыми участки, ответственные за распознавание системой деградации. Баланс активности убиквитин-лигаз и деубиквитинилирующих белков важен для регуляции сигнальных путей, включая каскад от Т-клеточного рецептора [22]. Например, убиквитинилирование цепей TCR под действием CBL-b необходимо для деградации рецептора и ослабления сигнального каскада на поздних этапах активации Т-клеток. Другим примером белка, чья главная функция заключается в связывании и поддержании стабильности партнёра, является трансмембранный полипептид типа 6 (CMTM6), который взаимодействует с лигандом программируемого клеточного рецептора смерти [23].

Биоинформатический анализ предсказывает, что большая часть цитоплазматического участка LPAP не имеет выраженной структуры [24], и LPAP можно отнести к внутренне неупорядоченным белкам (intrinsically disordered protein, IDP). Такие белки могут приобретать определённую конформацию при взаимодействии с молекулой-партнёром [25]. Внутренне неупорядоченные белки благодаря своей способности взаимодействовать с различными партнёрами часто выступают в роли белков-адаптеров или белков-платформ для сборки многокомпонентных комплексов. Они могут вступать во взаимодействия с высокой специфичностью и умеренной аффинностью, что необходимо для строго регулируемых во времени процессов и делает их важными участниками сигнальных каскадов [26]. Возможно, LPAP опосредует взаимодействия CD45 с другими белками.

Вопрос о вкладе LPAP в активационный сигнальный каскад Т-лимфоцитов пока остаётся открытым. В нашей работе нокаутные по LPAP популяции Jurkat экспрессировали меньше молекул CD69 при активации с помощью PMA и OKT3. Исходя из этих данных, можно было бы сделать предположение о прямом влиянии LPAP на сигнальный каскад, однако такая интерпретация осложняется возможным действием LPAP опосредованно через регуляцию экспрессии CD45. Косвенным указанием на возможное участие LPAP в активации Т-лимфоцитов является наблюдение того, что сниженная экспрессия LPAP на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах является потенциальным маркером трижды негативного рака молочной железы [27].

Заключение

Полученные нами данные позволяют предположить, что основная функция LPAP сводится к модуляции уровня белка CD45. Это порождает ряд вопросов для дальнейших исследований. Каким образом взаимодействие этих двух белков поддерживает их стабильность и каков механизм деградации CD45 и LPAP в отсутствии белка-партнёра? Почему в миелоидных клетках, которые конститутивно не экспрессируют LPAP, белок CD45 стабилен? Существует ли особый механизм регуляции CD45 в лимфоидных клетках, связанный с LPAP? Ответы на эти вопросы помогут открыть новые детали активации лимфоцитов.

Вклад авторов. Н.А. Круглова, Д.В. Мазуров, А.В. Филатов – концепция работы; Н.А. Круглова – проведение экспериментов; Н.А. Круглова, Д.В. Мазуров, А.В. Филатов – обсуждение результатов исследования; Н.А. Круглова – написание текста; Д.В. Мазуров, А.В. Филатов – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-15-00289).

Благодарности. В работе использовали оборудование, предоставленное Центром высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины (Институт биологии гена), развиваемым при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

N. А. Kruglova

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Russian Federation, 119334, Moscow

D. V. Mazurov

National Research Center Institute of Immunology, Federal Medical Biological Agency of Russia

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, 115522, Moscow

A. V. Filatov

National Research Center Institute of Immunology, Federal Medical Biological Agency of Russia; Lomonosov Moscow State University

Email: avfilat@yandex.ru

Department of Immunology, Faculty of Biology

Russian Federation, 115522, Moscow; 119234, Moscow

References

Supplementary files