In vitro and in vivo evaluation of antifibrotic properties of verteporfin as a composition of a collagen scaffold

Full Text

Принятые сокращения: ВП – вертепорфин; BrdU – 5-бромо-2′-дезоксиуридин; BSA – бычий сывороточный альбумин; DPBS – фосфатный солевой буфер; PFA – параформальдегид.

Введение

Заживление раны представляет собой сложный процесс, который в общих чертах подразделяется на последовательные, но отчасти перекрывающиеся четыре фазы: гемостаз, воспаление, пролиферация (клеточная инфильтрация, ангиогенез и реэпителизация) и созревание/ремоделирование [1]. На стадии воспаления активация иммунных клеток стимулирует секрецию цитокинов, которые, в свою очередь, активируют миграцию в область повреждения фибробластов, эпителиальных и эндотелиальных клеток. В ложе раны фибробласты приобретают активированный фенотип и преобразуются в миофибробласты, экспрессирующие Sm22α, – клетки, отвечающие за контракцию раны и производство основных компонентов внеклеточного матрикса, таких как фибронектин с экстра-доменом A, CD26, коллаген I и III, необходимых для заполнения дефекта соединительной ткани и формирования рубца [2–4]. Финальной фазой раневого заживления является фаза ремоделирования, которая у человека может длиться годами. На этом этапе в норме архитектура восстановленной ткани приближается к архитектуре нормальной кожи [1].

При обширных повреждениях используют специализированные агенты для стимуляции процессов регенерации. В медицинскую практику успешно входят тканевые эквиваленты, создаваемые на основе коллагенового геля [5]. Биоразлагаемость коллагена и его низкая иммуногенность делают его оптимальной основой не только для создания тканеинженерных конструкций, содержащих живые клетки, но и для самостоятельного применения в качестве раневого покрытия [6–8]. Коллаген как ключевой элемент внеклеточного матрикса влияет на все этапы раневого заживления [9–11]. Коллагеновые гидрогели частично воспроизводят свойства внеклеточного матрикса, имеют пористую структуру и сеть протофибрилл, облегчают миграцию и колонизацию клеток, способствуя ремоделированию новообразованной ткани, и способствуют заживлению ран [12]. В некоторых случаях в состав коллагеновых заменителей кожи вносят биологически-активные молекулы: факторы роста, цитокины или их аналоги, стимулирующие процесс интеграции эквивалента в поврежденный орган, процесс регенерации окружающих тканей и модулирующие иммунный ответ.

Одним из частых осложнений регенерации кожи, особенно при крупных повреждениях, требующих специализированной терапии, таких как ожоги, является формирование гипертрофических рубцов [13]. Помимо явных косметических недостатков, рубец нарушает механические взаимодействия в коже, делая ее более хрупкой и легкой на разрыв. Рубец не содержит волосяных фолликулов и сопряженных с ними сальных желез, что приводит к высыханию эпидермиса. Одним из новейших перспективных терапевтических препаратов, рассматриваемых в контексте противорубцовой терапии, является вертепорфин (ВП) [14–17].

Однократное введение ВП на ранних этапах регенерации лабораторным мышам инициировало процесс регенерации по бесшрамному типу [18]. ВП также обладает бактерицидной активностью, что благотворно сказывается на ранозаживлении [16]. Доставка в область повреждения ВП для стимуляции процессов ранозаживления была успешной при использовании носителей из фиброина [15], поливинила [17] и полилактата [14]. Мы исследовали возможность использования коллагенового геля в качестве носителя ВП для внесения его в рану, как одного из возможных средств предотвращения формирования рубцов после полного ранозаживления.

Противорубцовые свойства ВП связывают с его способностью ингибировать взаимодействие транскрипционного кофактора YAP1 и его мишеней, белков семейства TEAD. Активация сигнального каскада YAP1 происходит при ранозаживлении как в эпидермисе, так и в дерме [19]. В эпидермисе он стимулирует миграцию и пролиферацию кератиноцитов в раневом ложе. Активный ядерный YAP1 ассоциирован с пролиферацией фибробластов и повышением их контрактирующей способности, что важно при закрытии раны. На стадии ремоделирования активность этого сигнального каскада снижается. Увеличение времени активности сигнального каскада YAP1 у мыши приводит к формированию обычных или гипертрофических рубцов, в то же время его ингибирование в фибробластах на ранних этапах ранозаживления стимулирует восстановление полноценной кожи со всеми дериватами [20].

Влияние ВП на процессы рубцевания рассматривали in vitro и in vivo. В условиях культивирования мы использовали фибробласты человека, изолированные из гипертрофического кожного рубца, как аналог миофибробластов раневого ложа. Оценили влияние ВП на жизнеспособность, экспрессию сократительных маркеров и контрактирующие способности фибробластов. In vivo на лабораторных мышах исследовали эффективность внесения ВП в составе коллагенового геля для стимуляции регенерации кожи. В качестве анализируемых характеристик мы сравнили скорость закрытия раны, структуру внеклеточного матрикса и общую морфологию регенерирующей кожи.

Материалы и методы

Выделение и культивирование фибробластов дермы. Использованные в работе клеточные линии были изолированы из биоптатов кожи человека, полученных в результате реконструктивных операций в ФГБУ «НМИЦ ВМТ им. А.А. Вишневского» с информированного согласия доноров. Работу с биоптатами кожи проводили в соответствии с протоколом, одобренным Комиссией по биоэтике института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР) (№ 51 от 09.09.2021). Биоптаты промывали раствором Хэнкса с добавлением 0,4 мг/мл гентамицина для дезинфицирования, затем механически удаляли подкожный жир и ретикулярный слой дермы таким образом, чтобы верхний слой кожи с эпидермисом был толщиной не более 2 мм. Дерму с эпидермисом нарезали полосками шириной 2–3 мм и инкубировали в 2%-ном растворе диспазы («Gibco», США) в течение 1 ч при температуре 37 °С; далее, эпидермис удаляли, дерму измельчали ножницами до гомогенной консистенции и инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы I типа («Gibco») в течение 24 ч при 37 °С. Полученную массу центрифугировали при 140 g в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в DPBS (фосфатный солевой буфер; «ПанЭко»,Россия); процедуру повторяли 3 раза.

Для выделения фибробластов рубца биоптат очищали от прилегающих нормальных тканей, оставляя только участки с выраженной рубцовой деформацией, затем инкубировали в течение 1 ч в 2%-ном растворе диспазы при температуре 37 °С. После удаления эпидермиса дерму измельчали до гомогенной консистенции и инкубировали в 0,1%-ном растворе либеразы («Roche», США) в течение 24 ч при температуре 37 °С. Полученную массу центрифугировали при 140 g в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в DPBS; процедуру повторяли 3 раза.

Изолированные фибробласты культивировали в среде Amniomax-II («Gibco») в атмосфере 5% СО₂ при температуре 37 °С. Смену культуральной среды проводили каждые 2–3 дня. При достижении конфлуэнтности клетки пассировали 0,05%-ным раствором трипсин-ЭДТА («Capricorn», Германия) и далее культивировали в среде DMEM («ПанЭко») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Capricorn»), 1% Glutamax («Cibco»), 1% пенницилина/стрептомицина («Gibco»). В работе использовали клетки 2–3 пассажей.

В работе были использованы образцы, полученные от трех доноров здоровой кожи в возрасте 42–55 лет, и образцы, полученные от трех доноров с рубцовой тканью в возрасте 33–45 лет. Клеточные линии были депонированы в Коллекции клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований (общебиологического и биомедицинского направления) ИБР РАН.

Выявление апоптоза. Для определения профиля гибели клеток фибробласты на 1, 3 и 5 сутки после обработки ВП диссоциировали, центрифугировали при 140 g в течение 5 мин, однократно промывали DPBS, после чего инкубировали в течение 15 мин в растворе аннексина V и пропидий йодида с использованием набора для обнаружения апоптоза PI-AV («BD Pharmingen™», США), согласно инструкции производителя. Для введения в анализ коэффициента компенсации использовали пробы, отдельно окрашенные аннексином V и пропидий йодидом. Проточную цитометрию проводили с использованием проточного цитометра Attune® NxT («Life Technologies», США).

Культивирование фибробластов в коллагеновом геле. Для приготовления геля на льду смешивали: 0,34 М р-р NaOH («Химмед», Россия) – 6,5%; 7,5% р-р Na₂CO₃ («ПанЭко») – 3,42%; 10× среда M199 («Gibco») – 9,77%; Glutamax («Gibco») – 0,39%; Hepes («ПанЭко») – 1,95% и раствор коллагена I типа – 77,97%. Раствор коллагена получали из сухожилий хвостов белых лабораторных крыс породы «стандарт» путем механического отсоединения отдельных волокон и растворения их в 0,1%-ной уксусной кислоте, конечная концентрация коллагена в растворе – 2 мкг/мл. По 400 мкл геля, содержащего клеточную суспензию в концентрации 150 × 103 клеток на мл, вносили в лунки 24-луночного планшета («Corning», США) и инкубировали при температуре 37 °С для полимеризации. Сверху геля вносили 500 мкл культуральной среды. Гель отделяли от стенок культуральной посуды, что позволяло клеткам неограниченно его сжимать.

Через сутки после формирования геля в экспериментальные лунки вносили ВП («Sigma-Aldrich»), растворенный в питательной среде в концентрации 0,1 мкг/мл, и инкубировали гель с клетками в присутствии ВП в течение 24 ч, после чего гель однократно промывали раствором Хэнкса и заливали гель обычной культуральной средой.

Количественный ПЦР-анализ. РНК выделяли с применением реактива RNAzol («Sigma-Aldrich», Германия), согласно инструкции производителя. Для удаления геномной ДНК и проведения реакции обратной транскрипции использовали набор QuantiTect Reverse Transcription Kit («Qiagen», США). На реакцию обратной транскрипции использовали 1 мкг РНК. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени проводили с использованием набора 5× qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген», Россия) и амплификатора LightCycler96 («Roche», США). Протокол реакции: 10 мин при 95 °C, 1 цикл; далее 45 циклов, включающих 20 с при 95 °C, 20 с при 60 °C, 30 с при 72 °C. Все эксперименты были проведены в трех биологических и технических повторах. Количество продукта в каждом образце рассчитывали по методу 2–ΔΔCq и нормализовали на экспрессию GAPDH и HPRT. Данные на графиках представлены в виде среднего с разбросом в виде стандартного отклонения. Последовательности использованных в работе праймеров указаны в табл. 1.

 

Таблица 1. Использованные в работе праймеры

Название гена	Прямой праймер	Обратный праймер
GAPDH	CCATGTTCGTCATGGGTGTG	GGTGCTAAGCAGTTGGTGGTG
HPRT	ACCAGGTTATGACCTTGATT	AAGTTGGCCTAGTTTATGTT
YAP	AGAGAATCAGTCAGAGTGCTCCA	TTCAGCCGCAGCCTCTCC
TAZ	GGCAATGATTAAACTGGCAACA	AGTGAGCCCTTTCTAACCTGG
CTGF	TGTGCACCGCCAAAGATG	CAGACGAACGTCCATGCTG
CYR61	AAGGAGGCCGTCCTGGTC	GGGCTGCATTCCTCTGTGT
EDA-FN	CCCTAAAGGACTGGCATTCA	CATCCTCAGGGCTCGAGTAG
CD26	AGAAGGAGTATTCAATAAGTGGGAC	TACTCTGCTCTGTGGTGGTCT
COL1	AGAAAGGGGTCTCCATGGTG	AGGACCTCGGCTTCCAATAG
COL3	CCAGGAGCTAACGGTCTCAG	TGATCCAGGGTTTCCATCTC

 

Включение метки BrdU и определение стадий клеточного цикла. Фибробласты (500 × 103 клеток) высеивали в культуральные флаконы («Corning») с площадью 25 см2. Через 1 день вносили ВП в концентрации 0,1 мкг/мл. Концентрация ВП была определена ранее (неопубликованные данные) с учетом литературных данных [18]. Через 24 ч ВП удаляли, вносили свежую культуральную среду. Далее, на 1, 3 и 5 сутки культивирования вносили метку BrdU (5-бромо-2′-дезоксиуридин; «Sigma-Aldrich») в конечной концентрации 30 мкМ и инкубировали еще 2 ч. Клетки диссоциировали, промывали DPBS и фиксировали 70%-ным раствором этанола в течение 1 ч при +4 °C. Затем центрифугировали 2 мин при 1000 g, к осадку добавляли 0,5 мл 2 М HCl («Химреактив», Россия), содержащей 0,5% Triton X-100 («MP Biomedicals», США), и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Далее, клетки осаждали, удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в 0,5 мл 0,1 М тетрабората натрия («Химмед»). Инкубировали 2 мин, затем промывали однократно 150 мкл DPBS/1% BSA (бычий сывороточный альбумин; «PAA», Австрия). Далее, инкубировали с 50 мкл раствора первичных антител против BrdU, приготовленного на основе DPBS с добавлением 0,5% Tween 20 («MP Biomedicals») и 1% BSA, в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки промывали DPBS однократно и инкубировали в растворе вторичных антител в течение 30 мин при комнатной температуре (данные о производителях и разведении антител приведены в табл. 2). Далее, клетки осаждали и ресуспендировали осадок в 0,5 мл DPBS, содержащем 10 мкг/мл РНКазы А («Fermentas», Канада) и 20 мкг/мл раствора пропидий йодида («Sigma-Aldrich»), и инкубировали в течение 30 мин в темноте. Окрашивание проводили с надлежащими контролями вторичных антител и неокрашенными клетками. Проточную цитометрию проводили с использованием проточного цитометра Attune® NxT.

 

Таблица 2. Использованные в работе антитела

Антитела	Производитель, кат. номер	Разведение	Флюорофор
Первичные IgG крысы к BrdU	Abcam, ab6326	1/100	–
Первичные IgG козы к Sm22α	Abcam, ab10135	1/100	–
Первичные IgG кролика к YAP1	Abcam, ab52771	1/100	–
Первичные IgG кролика к YAP1	Cell Signaling Technology, D8H1X	1/100	–
Первичные IgG кролика к коллагену I + III	Имтек, RAP c13	1/20	–
Первичные IgG козы к P-кадгерину	R&D Systems, AF761	1/20	–
Первичные IgG крысы к E-кадгерину	Abcam, ab11512	1/20	–
Вторичные IgG осла против IgG кролика	Invitrogen, 32790	1/1000	Alexa 488
Вторичные IgG осла против IgG козы	Life Technologies, A11056	1/1000	Alexa 546
Вторичные IgG козы против IgG крысы	Life Technologies, A11081	1/1000	Alexa 546

 

Иммунофлуоресцентное окрашивание коллагеновых гелей. Препараты фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида (PFA) («Sigma-Aldrich») в течение 40 мин, далее однократно промывали DPBS и пермеабилизовали в растворе DPBS, содержащем 1% Tween 20, 1% Triton X-100, 5% BSA, в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее, вносили раствор первичных антител в соответствующих концентрациях (табл. 2) и инкубировали в течение 12 ч при температуре +4 °C. Далее, образцы промывали пермеабилизирующим раствором в течение 2 ч, после чего вносили соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с флюорофорами (табл. 2), и инкубировали в течение 12 ч при температуре +4 °C. Ядра окрашивали DAPI («Biotium», США) в концентрации 1 мкг/мл. Фотосъемку и исследования препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus IX 73 («Olympus», Япония).

Хирургические операции. В работе использовали 24 самца мышей линии C57Bl6 в возрасте 8 недель. Все манипуляции с животными проводили под общей анестезией в соответствии с Международными руководящими принципами биомедицинских исследований с участием животных [21]; строго соблюдались этические принципы Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых в экспериментальных и других конкретных целях [22]. Животных содержали со свободным доступом к пище и воде.

Мыши были разделены на следующие группы: «Контроль» (n = 6), «ВП» (n = 6), «Гель» (n = 6) и «Гель + ВП» (n = 6). Животных наркотизировали изофлураном («ВетФарм», Россия). Между лопаток шерсть удаляли, операционное поле дезинфицировали 70%-ным спиртом. В область операции инъецировали раствор кетопрофена 50 мг/мл («Эллара», Россия). В коже вырезали круглое полнослойное отверстие диаметром 5 мм. Для предотвращения быстрой контракции ран выполняли наложение силиконовой шины в форме кольца, соответствующего размеру раны, подклеивали шину клеем БФ-6 («Тульская Фармацевтическая фабрика», Россия) и закрепляли по периметру, делая 8 хирургических швов нерассасывающейся нитью («Resolon», Германия). Рану промывали, в экспериментальных группах вносили в раны 250 мкл коллагенового геля (группа «Гель»), 100 мкл раствора ВП с концентрацией 1 мг/мл в PBS (группа «ВП») и 250 мкл коллагенового геля с ВП (группа «Гель + ВП» из расчета 100 мкг ВП на мышь). В группе «Контроль» в рану капали 100 мкл раствора PBS с добавлением DMSO (разведение 1/1). Сверху на рану накладывали пластырь Tagaderm film («3М», Германия) и закрепляли все лейкопластырем («Omniplast», Германия).

Коллагеновый гель для внесения в рану готовили, как и для культивирования фибробластов. Гель вносили в лунки 48-луночного планшета («Corning») по 250 мкл и инкубировали при температуре 37 °С для полимеризации.

Состояние ран у животных проверяли через день, при необходимости шинирующее кольцо дополнительно подшивали. Фотографирование ран проводили один раз в 7 дней.

Через 3 дня в раны мышей повторно вносили все вышеперечисленные агенты. На 21 день животные были выведены из эксперимента, у всех была взята некропсия на всю толщину кожи из области раны диаметром 7–8 мм.

Подготовка биопсий ран и гистологическое окрашивание. Биопсии ран заключали в среду Tissue-Tek («Sakura», Япония) и формировали криоблоки, инкубируя образцы сначала в парах азота, затем – погружая в жидкий азот несколько раз по 3–5 с до полной заморозки; хранили при –70 °C. Криосрезы толщиной 8 мкм получали на криостате Leica CM1950 («Leica», Германия).

Срезы фиксировали в 4%-ном PFA, окрашивали гематоксилин-эозином («BioVitrum», Россия), согласно инструкции производителя, и заключали в среду Bio Mount («BioOptica», Италия). Съемку окрашенных препаратов проводили на микроскопе Keyence BZ-9000 («Keyence», Япония).

Для иммунофлуоресцентного анализа срезы фиксировали в 4%-ном PFA, инкубировали с раствором первичных антител с добавлением 5% BSA, 1% Triton Х-100, 1% Tween 20 в течение 18 ч, промывали от первичных антител в DPBS и инкубировали с раствором вторичных антител в течение 1,5 ч. Съемку проводили на микроскопе Leica Thunder («Leica»). Cписок использованных антител и концентрации приведены в табл. 2.

Анализ архитектуры коллагеновых волокон. Архитектуру коллагеновых волокон анализировали на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Дерму в области раны фотографировали на увеличении 40×, полученные фотографии анализировали при помощи алгоритмов CurveAlign и CT-FIRE [23, 24].

Алгоритм CurveAlign анализирует степень выравнивания коллагеновых волокон на изображении и конструирует тепловую карту выравнивания волокон; CT-FIRE использует курвлет-преобразование для подавления шума в изображении и определения границ коллагеновых волокон, а затем извлекает и анализирует индивидуальные параметры каждого коллагенового волокна (длина, ширина, прямизна, угол) [23, 24]. Полученные данные статистически обрабатывали.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prism 9. Перед выбором статистического критерия выборку проверяли на нормальность (критерий Шапиро–Уилка, тест Колмогорова–Смирнова, обобщенный тест Д’Агостино–Пирсона, критерий Андерсона–Дарлинга). В случае соответствия распределения данных в выборке нормальному наличие отличий между группами выявляли при помощи однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Тьюки на множественные сравнения или, при необходимости, двухфакторным дисперсионным анализом, дополненным тестом Шидака для парных сравнений. При отклонении гипотезы о нормальности распределения наличие отличий между группами выявляли при помощи критерия Краскелла–Уоллиса с поправкой Данна на множественные сравнения. При анализе данных определяли наличие выбросов при помощи Q-критерия Диксона.

Данные, полученные при помощи алгоритмов анализа архитектуры коллагеновых волокон, обрабатывали в программе OriginPro 2022. На основе результатов, полученных с использованием этих алгоритмов, был выполнен анализ главных компонент. На графиках изображена 95%-ная доверительная область для каждой группы данных. Для определения наличия сходных групп данных проводили кластерный анализ методом k-средних.

Результаты исследования

Влияние ВП на жизнеспособность нормальных и рубцовых фибробластов. На первом этапе работы мы оценили влияние ВП на жизнеспособность нормальных и рубцовых фибробластов кожи человека. Для этого клеточную культуру обрабатывали раствором ВП в течение 24 ч, далее, оценивали количество живых и гибнущих клеток при помощи окрашивания пропидий йодидом и аннексином V на 1, 3 и 5 сутки (рис. 1, а и б). Живые клетки определяли по отсутствию окрашивания пропидий иодидом и аннексином V. Уровень пролиферации оценивали путем подсчета количества клеток, включивших метку BrdU (рис. 1, в).

 

Рис. 1. Оценка гибели и пролиферации разных типов фибробластов (норма и рубец) под воздействием ВП. а – Доля живых клеток после обработки ВП. б – Доля гибнущих клеток после обработки ВП. в – Количество пролиферирующих клеток. Данные на графиках представлены в виде среднего с разбросом в виде стандартного отклонения. Статистически значимые отличия: ** p ≤ 0,01 и **** p ≤ 0,0001

 

Мы не обнаружили статистически значимых изменений количества живых/гибнущих клеток после воздействия. Однако ВП значительно снижал пролиферацию как в нормальных, так и в рубцовых фибробластах через 1 день после обработки. Через 3 дня после обработки уровень пролиферации между контрольными (норма, рубец) и экспериментальными (норма + ВП, рубец + ВП) группами отличался не настолько значимо, хотя наблюдалась тенденция к снижению. На пятый день у фибробластов рубца наблюдалась тенденция к повышению уровня пролиферации в группе «ВП» по сравнению с контрольной. Интересно отметить, что пролиферация снижается в группах без воздействия ВП от 1 до 5 дня. Это связано с контактным ингибированием по мере достижения клеточной культурой конфлуэнтного монослоя. Поскольку анализ не выявил отличий в гибели клеток, но определил изменения в пролиферации, мы провели анализ клеточного цикла (рис. 2).

 

Рис. 2. Анализ клеточного цикла нормальных (норма) и рубцовых (рубец) фибробластов после воздействия ВП. Данные на графиках представлены в виде среднего с разбросом в виде стандартного отклонения

 

Статистически значимых изменений в распределении клеток по стадиям цикла после воздействия ВП выявлено не было. Тем не менее данная диаграмма позволяет сделать предположение, что снижение пролиферации происходит из-за задержки в фазе G1.

Влияние ВП на поведение дермальных фибробластов в коллагеновом геле. Фибробласты, помещенные в коллагеновый гель, в течение суток вытягиваются в толще геля, образуя контакты с фибриллами коллагена, и уже через сутки культивирования приобретают вытянутый фенотип, характерный для этого типа клеток в норме в структуре соединительной ткани. В это же время фибробласты начинают активно контрактировать гель. Инкубирование в присутствии 0,1 мкг/мл ВП проводили в течение 24 ч в половине приготовленных гелей, в качестве контроля использовали культуральную среду с добавлением ДМСО. Оценку размера геля проводили на 3, 5 и 7 сутки после воздействия (рис. 3, а). Результаты анализа показали, что ВП значительно снижает степень контракции коллагенового геля в обеих исследуемых типах фибробластов. Фибробласты рубца сохранили свои фибротические свойства при культивировании и контрактировали гель в большей степени в сравнении с нормальными фибробластами. Анализируемые гели визуально содержали равное количество клеток, следовательно, интенсивность контракции определялась характеристиками фибробластов.

 

Рис. 3. Влияние воздействия ВП на контрактирующие способности и фенотип разных типов фибробластов (норма и рубец) в коллагеновом геле. а – Динамика контракции коллагеновых гелей. б – Иммунофлуоресцентное выявление Sm22α (зеленое окрашивание) и YAP1 (красное окрашивание). На вставках крупно показаны клетки с цитоплазматической локализацией YAP1. Ядра докрашены DAPI. Конфокальная микроскопия. Масштабный отрезок – 100 мкм

 

Исследовали иммунофлуоресцентным методом экспрессию Sm22α, одного из характерных маркеров миофибробластов, обеспечивающего их контрактирующие способности [25–27]. Также оценили экспрессию элементов сигнального пути YAP1, поскольку ВП является ингибитором этого каскада [28, 29] (рис. 3).

Рубцовые фибробласты содержали большую долю клеток, положительных по Sm22α, особенно это отличие становилось выраженным на 5 сутки. ВП значительно снижал экспрессию Sm22α в обеих исследуемых группах. Экспрессия YAP1 после воздействия ВП также снижалась на 3 и 5 сутки. На 3 сутки в культурах, обработанных ВП, были обнаружены клетки, не содержащие ядерной формы YAP1. На 5 сутки все культуры снова содержали клетки с ядерной активной формой YAP1 (рис. 3, б).

Экспрессию маркеров миофибробластов, белков внеклеточного матрикса: коллагенов I и III типов (COL1, COL3) и фибронектина, содержащего экстра-домен А (EDA-FN), а также CD26, оценивали на 5 сутки после воздействия ВП на фибробласты в коллагеновом геле (рис. 4). На этом же сроке были исследованы YAP1 и его паралог TAZ, поскольку повышение их экспрессии происходит в ходе регенерации кожи и при формировании гипертрофических рубцов, и их типичные мишени CTGF и CYR61. Анализ данных, полученных методом ПЦР в реальном времени, не выявил статистически значимых отличий в группах фибробластов, подвергавшихся воздействию ВП. Однако разница между фибробластами нормальной кожи и фибробластами рубца была статистически значимой (рис. 4).

 

Рис. 4. Количественный ПЦР-анализ фибротических маркеров, экспрессируемых фибробластами разных типов (норма и рубец) в коллагеновом геле на 5 сутки после воздействия ВП. Графики представлены в виде среднего с разбросом в виде стандартного отклонения. Результаты нормировали на уровень экспрессии GAPDH. Статистически значимое отличие рубца от нормы: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Статистически значимое отличие от группы «Норма + ВП»: # p < 0,05; ## p < 0,01

 

Влияние ВП на морфологию кожи в ходе посттравматической регенерации. ВП вносили мышам после создания шинированной раны в составе коллагенового геля или в растворе на ранних этапах ранозаживления. Протокол был основан на ранее опубликованных работах, в которых описано однократное внесение ВП в область раны [17, 18, 20]. Раны фотографировали один раз в 7 дней для оценки скорости их закрытия (рис. 5, а).

 

Рис. 5. Анализ динамики ранозаживления на основании морфометрических параметров. а – Внешний вид раны в разных группах на 0, 7, 14 и 22 послеоперационный день; б – динамика закрытия ран в течение 22 дней эксперимента; в – скорость закрытия раны за первую неделю. *** p < 0,001 относительно контрольной группы; ### p < 0,001 относительно группы «ВП». г – Измерение толщины эпидермиса в области раны. д – Измерение толщины дермы в области раны, * p < 0,05. Данные на графиках представлены в виде среднего с разбросом в виде стандартного отклонения

 

Большая часть ран полностью закрылась на 14 день. На 22 послеоперационный день зажившая область была уже визуально неотличима от нормальной кожи (рис. 5, а и б). Наиболее выраженные отличия в скорости закрытия ран наблюдали на седьмой день после операции. Раны, заживающие в присутствии коллагенового геля (группы «Гель» и «Гель + ВП»), в течение первой недели закрывались медленнее по сравнению с группами без геля («Контроль» и «ВП») (рис. 5, в). При этом не было выявлено отличий в скорости заживления раны в присутствии ВП («Гель + ВП» и «ВП») от соответствующей группы мышей без ВП («Гель» и «Контроль») (рис. 5, б и в).

При гистологическом исследовании криосрезов кожи обнаружили уменьшение толщины дермы (рис. 5, д) в группе «ВП». Толщина эпидермиса (рис. 5, г) в области раны при этом не различается между группами.

Иммунофлуоресцентный анализ выявил уменьшение содержания коллагенов I + III в группе «ВП» (рис. 6). Несмотря на свойство ВП ингибировать сигнальный каскад YAP1 [28, 29], активная ядерная форма этого белка была выявлена в одинаковой степени во всех образцах в дерме, а также в части клеток базального слоя эпидермиса независимо от присутствия ВП.

 

Рис. 6. Иммунофлуоресцентное выявление маркеров раневого заживления: коллагенов I + III, P-кадгерина, E-кадгерина, YAP на срезах кожных ран мышей на 22 послеоперационный день в разных группах. Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок – 100 мкм

 

Для анализа состояния регенерирующей дермы на 22 послеоперационный день проводили анализ коллагеновых волокон в гистологических препаратах кожных ран при помощи алгоритмов CT-FIRE и CurveAlign (рис. 7, а). Увеличение длины, ширины и выпрямленности индивидуальных волокон, а также степени выравнивания коллагеновых волокон друг относительно друга свойственно коже с выраженным фиброзом и говорит о замедлении процесса ремоделирования. Значительное отклонение от контрольной группы характеризует ход регенерации кожи как патологический.

 

Рис. 7. Цифровой анализ коллагеновых волокон на гистологических препаратах кожных ран мышей на 22 послеоперационный день. а – Визуализация этапов анализа структуры коллагеновых волокон на гистологических препаратах с использованием тепловых карт, построенных при помощи алгоритмов CT-FIRE и CurveAlign. б – Анализ главных компонент на основе данных CT-FIRE и CurveAlign для групп «Контроль» и «ВП». в – Направления исходных осей координат в пространстве главных компонент. г – Анализ главных компонент на основе данных CT-FIRE и CurveAlign для групп «Гель» и «Гель + ВП». д – Направления исходных осей координат в пространстве главных компонент. е – Анализ главных компонент на основе данных CT-FIRE и CurveAlign для всех экспериментальных групп. ж – Направления исходных осей координат в пространстве главных компонент

 

Данные, полученные при помощи CurveAlign и CT-FIRE, обрабатывали с использованием анализа главных компонент для уменьшения размерности. Значительных различий в морфологии коллагена между группами «Контроль» и «ВП» после оценки всех параметров выявлено не было (рис. 7, б и в). Как среди образцов группы «Контроль», так и среди образцов из группы «ВП» присутствовали более выпрямленные длинные волокна, которые могут быть характерны для фиброзной стадии нормального раневого заживления [30]. Такие образцы с более выраженным фибротическим фенотипом формировали отдельный кластер (рис. 7, б; Кластер 1).

При внесении ВП в составе коллагенового геля (группа «Гель + ВП») наблюдали увеличение ширины, длины, выпрямленности и степени выравнивания коллагеновых волокон по сравнению с ранами, куда вносили просто коллагеновый гель (группа «Гель»; рис. 7, г и д).

При совмещении четырех групп в общем пространстве главных компонент (рис. 7, е и ж) группы «Контроль», «ВП» и «Гель» практически не разделяются, при этом группа «Гель + ВП» наиболее отклоняется от остальных. Большая часть наблюдений из группы «Гель + ВП» попадает в отдельный кластер (рис. 7, е; Кластер 1). Коллагеновые волокна из этого кластера характеризуются большей длиной, шириной, выпрямленностью и степенью выравнивания, что может свидетельствовать о большей степени фибротических изменений в дерме.

Обсуждение результатов

В ходе работы оценили потенциальное влияние ВП в составе коллагенового геля на механизмы посттравматической регенерации кожи.

Сохранение рубцовыми фибробластами фибротических свойств при культивировании подтверждается иммуногистохимическим окрашиванием (рис. 3, б) и количественным ПЦР-анализом (рис. 4), которые указывают на значительно более высокую экспрессию маркеров миофибробластов в сравнении с контрольной группой. Механизм действия ВП в ране мыши связывают с элиминированием миофибробластов, положительных по Engrailed 1 и CD26, из области повреждения посредством ингибирования сигнального каскада YAP/TAZ [18, 20, 29]. In vitro мы показали, что ВП не вызывает гибель клеток, в том числе изолированных из рубца и имеющих выраженный фибротический фенотип. ВП снижает пролиферацию в первые сутки, после чего ее уровень восстанавливается до контрольных значений (рис. 1), следовательно, воздействие ВП приводит к исчезновению миофибробластов не в результате их гибели, а путем смены профиля экспрессии фибротических маркеров на типичные для кожи в нормальном состоянии.

ВП значительно снижает контрактирующие свойства фибробластов (рис. 3, а). Это сопряжено с уменьшением доли клеток, положительных по экспрессии сократительного белка Sm22α, уже на 3 сутки после воздействия ВП (рис. 3, б).

Именно на этом сроке мы обнаружили клетки, не содержащие активной ядерной формы белка YAP1. На 5 день мы проанализировали профиль экспрессии специализированных маркеров миофибробластов методом количественного ПЦР-анализа (рис. 4). К данному сроку мы не наблюдали статистически значимых отличий между группами с воздействием и без воздействия ВП по экспрессии как белков внеклеточного матрикса, так и других фибротических маркеров, CD26 и белков YAP/TAZ. Восстанавливалась активность сигнального каскада YAP1, о чем свидетельствует отсутствие отличий в экспрессии его типичных мишеней CTGF и CYR61. Таким образом, ВП оказывал наиболее выраженное влияние на фибробласты дермы в культуре именно на ранних сроках, подавляя экспрессию сократительных белков, что приводило к снижению контракции до 7 суток, тем самым пролонгируя его антифибротическое действие.

Ранозаживление у мышей значительно отличается от процессов, протекающих у человека [31]. В коже мыши более выражена контракция, за счет которой даже обширные раны смыкаются за считанные дни. Мы использовали модель шинированной раны для предотвращения контракции, что сближает процесс регенерации кожи мыши с аналогичным у человека [32]. ВП вносили в рану самостоятельно и в коллагеновом геле. Оценивали состояние регенерирующей кожи на 22 день на стадии ремоделирования для детальной характеристики процесса.

На ранних этапах коллагеновый гель замедлял процесс закрытия раны, однако с 14 суток область повреждения сокращалась с одинаковой интенсивностью независимо от принадлежности к определенной группе (рис. 5). В дерме и эпидермисе на 22 сутки был выявлен ядерный YAP1, что указывает на восстановление активности его сигнального каскада (рис. 6). Добавление ВП и коллагенового геля отдельно и совместно не приводило к изменению большинства морфологических параметров кожи, однако ВП, вносимый в рану отдельно, снижал толщину дермы регенерирующей кожи (рис. 5) и интенсивность экспрессии в ней коллагена I и III типов (рис. 6), что указывает на его противорубцовое воздействие [33]. Для оценки проявления фибротических признаков в ходе регенерации кожи мы использовали современные протоколы компьютерного анализа морфометрических параметров сформированных волокон внеклеточного матрикса [23, 24]. Внесение ВП в составе коллагенового геля (группа «Гель + ВП») приводило к формированию волокон с большей длиной, шириной, выпрямленностью (рис. 7, б и в). Формирование подобных волокон свидетельствует о приобретении фибротической направленности у процесса ранозаживления [34]. При этом в группах «ВП» и «Гель» не наблюдалось статистически значимых отличий от группы «Контроль» при рассмотрении комплекса признаков, характеризующих морфологию коллагеновых волокон. Хотя ВП и коллагеновый гель не меняют морфологию коллагеновых волокон, важно, что их применение не приводит к активации фиброза. Таким образом, несмотря на положительный эффект от добавления ВП, его сочетание с коллагеновым гелем патологически сказывалось на процессах регенерации. В отличие от проведенной нами работы, успешного внесения ВП в составе специализированных носителей добивались, только если носители представляли собой не единый пласт, закрывающий область раны, а микрочастицы, содержащие ВП [12, 14, 15]. Наш результат может быть обусловлен разными механизмами, за счет которых коллагеновый гель и ВП влияют на ранозаживление. ВП модулирует поведение фибробластов, препятствуя контракции коллагенового геля (рис. 3, а) и уменьшая экспрессию фибротических маркеров (рис. 4). Коллагеновый гель, в свою очередь, стимулирует более интенсивное формирование грануляционной ткани, за счет чего ускоряется процесс регенерации [35, 36]. Вероятно, ВП ингибировал формирование пула миофибробластов, что при добавлении коллагена замедлило стадию пролиферации и ремоделирования и стало причиной наблюдаемых фибротических проявлений.

Заключение

Разработка тканеинженерных конструкций, стимулирующих процессы ранозаживления, но не приводящих к появлению рубцов, актуальна для пациентов с ожоговыми поражениями кожи, а также при других патологиях. ВП является одним из наиболее перспективных противофибротических препаратов, поэтому рассматривается возможность добавления его в состав терапевтических средств, стимулирующих процессы регенерации [18, 20, 29]. Коллагеновые гели также применяются для закрытия кожных ран [6–8]. В нашем исследовании при комбинировании коллагенового геля и ВП фибротические проявления в ране усиливались. Таким образом, исследованный нами вариант внесения ВП в область раны не позволяет ускорить регенерацию, а значит, возможные носители ВП для терапии ранозаживения требуют дальнейшего изучения. Применение конструкций, содержащих дермальные фибробласты и эпидермальные кератиноциты, стимулировало процессы регенерации кожи более эффективно в сравнении с применением только носителя [37], поэтому добавление клеточного компонента позволило бы оптимизировать свойства геля, сохранив регенеративный потенциал. Как показали проведенные нами исследования in vitro, ВП не вызывал клеточную гибель, но предотвращал фибротические изменения в клеточном компоненте в составе коллагенового геля. Следовательно, дермальные фибробласты в составе носителей после воздействия ВП могут сохранять нормальный фенотип и после трансплантации в область повреждения. Эту возможность стоит проанализировать в будущих исследованиях, как и оптимизацию состава специализированного носителя.

Вклад авторов. О.С. Роговая, Д.С. Аболин, Е.П. Калабушева отвечали за проведение экспериментов in vitro; А.Д. Смыслов – постановка количественного ПЦР-анализа; О.С. Роговая, Д.С. Аболин, О.Л. Черкашина, Е.П. Калабушева – проведение экспериментов на лабораторных животных; О.Л. Черкашина – биоинформатический анализ распределения волокон внеклеточного матрикса в области повреждения; О.С. Роговая, Е.А. Воротеляк, Е.П. Калабушева – разработка дизайна исследования; О.С. Роговая, О.Л. Черкашина, Е.П. Калабушева – подготовка текста статьи; Е.А. Воротеляк – редактирование текста.

Финансирование Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-74-30015). Ссылка на информацию о проекте: https://rscf.ru/en/project/21-74-30015/.

Благодарности. Использованные в работе клеточные линии были предоставлены УНУ «Коллекция клеточных культур» ЦКП ИБР РАН. Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП ИБР РАН.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья содержит описание исследований влияния ВП на процессы посттравматической регенерации кожи с использованием лабораторных мышей в качестве объектов. Все процедуры, выполненные в исследованиях с использованием животных, соответствовали этическим стандартам ИБР РАН (протокол № 74 от 14.09.23), в котором проводились исследования, и в соответствии с Международными руководящими принципами биомедицинских исследований с участием животных [21]; строго соблюдались этические принципы Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых в экспериментальных и других конкретных целях [22]. Настоящая статья содержит описание экспериментов, выполненных на первичных линиях фибробластов, полученных из биоптатов кожи, оставшихся в качестве биоотходов в результате реконструктивных операций и использованных для выделения клеток с информированного согласия доноров в соответствии с протоколом, одобренным Комиссией по биоэтике ИБР (протокол № 51 от 09.09.2021).

About the authors

O. S. Rogovaya

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

D. S. Abolin

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

O. L. Cherkashina

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

A. D. Smyslov

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

E. A. Vorotelyak

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

Е. P. Kalabusheva

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: rogovaya26f@yandex.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

References

Supplementary files