Irreducible Complexity of Hox Gene: A Path to the Canonical Function of the Hox Cluster (Review)

Full Text

Принятые сокращения: ANTP – Antennapedia; GRN – генная регуляторная сеть; Hox – Homeotic Homeobox; Ubx – Ultrabithorax.

ВВЕДЕНИЕ

История возникновения многоклеточных животных прочно связана с появлением нового класса транскрипционных факторов – ANTP (Antennapedia), принадлежащего к суперклассу гомеодоменных белков [1]. Быстрая структурная и функциональная эволюция генов ANTP привела к появлению самой многочисленной и разнообразной клады животного мира, которую сейчас называют ParaHoxozoa [2]. В эту кладу входит приблизительно 7 млн видов билатеральных животных (Bilateria), примерно 10 тысяч видов кишечнополостных (Cnidaria) и несколько видов пластинчатых (Placozoa). Название клады указывает на эволюционную границу внутри Metazoa, которая обособляет таксоны с Hox/ParaHox-генами (Hox – Homeotic Homeobox) от гребневиков и губок, у которых этих генов нет [2–5].

Hox-гены были первыми генами, для которых показали участие в развитии и эволюции [6]. Их открытие привело к появлению новой науки – эволюционной биологии развития (EvoDevo), и сделало Hox-гены самой изучаемой группой среди всех гомеобоксных генов у животных. Гомеобокс – консервативный участок первичной последовательности, который кодирует ДНК-связывающий мотив гомеодомен, нужный Hox-белку для взаимодействия с энхансерами подконтрольных генов-мишеней [7, 8]. Hox-гены организованы в кластер, т.е. физически сцеплены. Традиционно их подразделяют на 9 паралогических групп (PG1–8 и PG9/14). Принцип классификации по паралогическим группам основан на различиях в последовательностях Hox-белков и их относительных позициях в кластерах. Уровень эволюционной консервативности внутри паралогической группы (например, между lab (PG1) мухи и Hox1 (PG1) ланцетника) всегда выше, чем по сравнению с геном вне неё (между lab (PG1) и pb (PG2) мухи). В целом, структурная экспансия Hox-кластера и формирование большинства паралогических групп произошли до появления трёх крупных клад Bilateria [9, 10].

Главная черта Hox-кластера – способность к коллинеарной экспрессии. Коллинеарность – это соответствие между расположением генов на хромосоме и порядком их экспрессии вдоль передне-задней оси тела [11, 12]. Чем ближе Hox-ген к 3′-концу кластера, тем ближе к переднему концу эмбриона он будет работать. Такую коллинеарность называют пространственной. Коллинеарность также может быть временной (темпоральной), когда гены экспрессируются последовательно во времени, начиная с 3′-конца кластера [13].

Кластер Hox-генов – результат тандемных cis-дупликаций предковой последовательности, начиная с единственного прото-Hox-гена, который принадлежал к семейству NK [14, 15]. Это событие произошло до того, как образовались сестринские ветви Bilateria и Cnidaria, потому что Hox-гены, принадлежащие к паралогическим группам PG1, PG2 и PG4/14, уже есть в обеих ветвях [16]. Эти паралогические группы появились в результате диверсификации cis-дупликатов по двум сценариям: неофункционализации и субфункционализации. В первом случае копия приобретает новую функцию, а во втором – предковая функция разделяется между копиями [17]. Кластер может быть целым (компактным или релаксированным) или содержать перестройки и разрывы (поломки), вплоть до полной атомизации [18–21]. Целостность Hox-кластера принципиальна для поддержания темпоральной коллинеарности, но не важна для пространственной [22].

Парадоксальным образом Hox-гены одновременно консервативны и функционально пластичны. Они универсальны на этапе становления билатерального плана организации и видоспецифичны на уровне локальных паттернов, например, при формировании щетинок на ногах у разных видов Drosophila [23]. Это системное свойство известно как масштабируемость. В случае Hox-генов оно проявляется на онтогенетическом и филогенетическом уровнях.

Ошеломляющее многообразие билатеральных животных – результат быстрой эволюции программ развития, одновременно устойчивых и пластичных. Билатеральные животные сохраняют общий план организации за счёт консервативных участников и «участков» генных регуляторных сетей, которые начинают работать вскоре после завершения дробления и нужны для регионализации и паттернирования. Особенно ярко это видно на примере позвоночных и других сегментированных животных, для которых выделяют филотипический период или стадию «зоотипа» [24]. В этот период представители одного типа (или подтипа) максимально похожи друг на друга морфологически (например, все позвоночные на стадии фарингулы). На уровне молекулярной регуляции сходство ещё шире, поскольку сегментированные животные из разных типов (позвоночные, членистоногие, аннелиды) незадолго до или во время гаструляции начинают упорядоченно экспрессировать Hox-гены [25–27]. Графическое выражение концепции зоотипа – песочные часы, где уровень перетяжки соответствует началу коллинеарной транскрипции Hox-кластеров вдоль передне-задней оси тела. Такая экспрессия концептуально сходна у любых сегментированных Bilateria, несмотря на существенные различия в механизмах реализации. Hox-белки детерминируют судьбу клеток в широких пространственных доменах эмбриона вдоль передне-задней оси тела. В этот ранний период их мишенями становятся гены сигнальных путей и факторов транскрипции, наборы которых будут качественно и количественно различаться в зависимости от Hox-кода. Такая разница в конечном счёте приведёт к морфологическим и функциональным различиям между участками эмбриона.

Эту функцию традиционно рассматривают как базовую, то есть каноническую. Именно её подразумевают, когда речь заходит о роли Hox-генов в развитии, и для этого есть несколько причин. Во-первых, животные, у которых мы наблюдаем раннюю коллинеарную транскрипцию Hox-генов в широких пространственных доменах (т.е. регионализующую функцию), принадлежат к трём надтипам – Deuterostomia, Ecdysozoa и Lophotrochozoa, которые объединяются в кладу Nephrozoa. Вероятность того, что такая функция Hox-генов возникла в этих группах независимым (конвергентным) образом, выглядит ниже вероятности её прямого наследования от общего предка всех Nephrozoa. Во-вторых, последовательная во времени ранняя активация генов Hox-кластера всегда связана с регионализацией, а такой способ включения зависит от целостного или минимально повреждённого кластера [22, 28]. Если структура кластера определяет его регионализующую функцию и при этом целый кластер априори считается первичным, то логично предположить, что и сама эта функция неразрывно связана с возникновением Hox-кластера.

Узкое место в «песочных часах» – показатель отсутствия изменчивости, доступной для отбора, поэтому можно смело говорить, что работа Hox-генов определяет план организации, по крайней мере, сегментированных Bilateria. Однако при таком подходе остаются неразрешимые вопросы к начальным этапам эволюции системы. Координированная во времени и пространстве ранняя векторная экспрессия Hox-кластеров выглядит очень сложной. Трудно представить начальные и промежуточные шаги, сформировавшие эту гиперсеть. Кроме того, если каноническая функция Hox-генов первична, то последний общий предок Nephrozoa – сложное животное, не уступающее по уровню организации ланцетнику, дрозофиле или платинереису, что уводит нас к старому парадоксу о неупрощаемой сложности. Возможно, среди множества функций Hox-генов, которые не входят в число канонических, существуют такие, которые дают подсказку о первичном состоянии Hox-регуляции в линии ParaHoxozoa и её последующей эволюции. В нашем обзоре рассмотрены некоторые из них.

HOX-ГЕНЫ И НЕЙРОГЕНЕЗ

Чем древнее признак, тем с большей вероятностью его можно встретить у филогенетически удалённых друг от друга потомков вида, который этот признак приобрёл. Впервые идею о том, что анцестральная функция Hox-генов – паттернирование нервной системы, высказал Хорди Гарсиа Фернандес [29], и не без основания. Если вынести за скобки каноническую функцию Hox-генов, то остаётся самая распространённая и самая устойчивая к поломкам функция – контроль над нейрогенезом [30–32]. Контроль сохраняется даже у тех животных, которые отказались от ранней регионализующей функции (пиявки, аппендикулярии, коловратки) или используют её в отрыве от спецификации передне-задней оси (моллюски) [19–21, 33–36]. Примечательно, что у большинства изученных моллюсков именно в ганглиях нервной системы прослеживаются признаки Hox-коллинеарности [21, 35, 36].

Современные экспериментальные методы позволяют локально включать или выключать избранные гены на разных стадиях развития модельных животных (нематода, дрозофила, мышь). Эти эксперименты обнаружили важную закономерность. Оказалось, что Hox-гены не просто определяют клеточные территории, в которых закладываются нейробласты. Они контролируют пути их дифференцировки и, что особенно любопытно, устанавливают терминальную специфичность зрелых постмитотических нейронов [32]. Терминальная специфичность (neuronal terminal identity) приводит нейрон к функциональному состоянию. Он начинает формировать нейриты, синтезировать нейропептиды, белки, необходимые для производства нейротрансмиттеров, рецепторы к ним и компоненты ионных каналов. Все эти и многие другие изменения в постмитотических нейронах происходят за счёт не родственных друг другу регуляторных белков, которые называются терминальными селекторами. Один из таких селекторов у нематоды Caenorhabditis elegans – Unc-3 (ортолог EBF/Olf/Collier) – определяет терминальную дифференцировку холинергических двигательных нейронов (мотонейронов). Белок Unc-3 напрямую связывается с цис-регуляторными сайтами генов биосинтеза ацетилхолина, ионных каналов и множества других генов, но работает он не один, а в содружестве с разными Hox-белками, которые действуют как его кофакторы. Разные Hox-белки (в зависимости от участка тела) задают разницу в количестве и длине нейритов, синаптических связях и электрической активности мотонейронов. Эта общая схема справедлива и для других типов нейронов (сенсорных, двигательных и промежуточных) с другими терминальными селекторами [37]. Важно, что Hox-белки нужны червю не только для верной настройки нейрона в момент его терминальной дифференцировки, но и для его дальнейшей работы. Показано, что Hox-белок C. elegans Lin-39 (PG4/5) необходим во взрослой жизни для поддержания терминальной специфичности подконтрольных мотонейронов [38, 39].

Нематода просто устроена, и у взрослого червя (гермафродита) всего 302 зрелых нейрона [40]. Мозг взрослой Drosophila содержит порядка 200 тыс. нервных клеток [41], но их дифференцировка, нацеленность на мишени и количество синапсов определяются сходными процессами. Нейробласты мухи приобретают уникальные судьбы под действием Hox-белков [42], и, что более удивительно, под Hox-контролем находится формирование нервно-мышечных синапсов [31, 43]. Существует гипотеза, согласно которой сборка синаптического контакта между нейроном и мышечной клеткой возможна в том случае, если они экспрессируют один и тот же Hox-белок (или набор Hox-белков). Это справедливо по крайней мере для одной модельной системы, где Hox-белок Dfd (PG4) напрямую включает экспрессию анкирина (Ankyrin2-XL; синаптический белок) и выключает экспрессию Con (адгезивный белок, селективно работающий в нейромышечных синапсах другого типа) в мотонейронах и мышцах, которые они иннервируют [43].

Наконец, у Drosophila описан тип нейронов (leucokinergic neurons), для которых Hox-белки из комплекса BX-C (Ubx (Ultrabithorax), abd-A (abdominal A), Abd-B (abdominal B)) являются прямыми терминальными селекторами, поскольку включают (Ubx, abd-A) и выключают (Abd-B) синтез нейропептида лейкокинина [44].

Не вдаваясь в подробности, заметим, что у млекопитающих (мышь, человек) обнаружены принципиально сходные правила установления пронейральных территорий, дифференцировки нейронов и их постмитотических настроек под контролем Hox-генов [30]. Показано, что у млекопитающих тоже есть Hox-белки, которые работают терминальными селекторами мотонейронов [45] и нужны во взрослом состоянии. Развитие заднего мозга контролируют 24 Hox-гена, и они продолжают работать в сформированном мозге взрослых мышей [46]. Развитие переднего мозга у позвоночных – Hox-независимый процесс. Тем удивительней, что в постнатальном неокортексе и таламусе мыши начинают экспрессироваться Hox-гены из нескольких передних паралогических групп (PG1, 3-5) [46].

Итак, современные экспериментальные данные, полученные на разных модельных животных, подводят нас к мысли, что предковая функция Hox-генов – терминальная дифференцировка нейронов, вероятнее всего двигательных. У этой гипотезы есть сильная теоретическая и доказательная базы. Во-первых, недавно стало известно, что гомеобокс-содержащие факторы в целом имеют тенденцию запускать и поддерживать нейрогенные дифференцировки. В геноме C. elegans закодированы 102 гомеодомен-содержащих белка из разных семейств, которые селективно и комбинаторно работают терминальными селекторами или их партнёрами в зрелых нейронах [47, 48]. Поэтому спецификация нейронов при помощи Hox-белков – частный случай общего принципа.

Во-вторых, в генных регуляторных сетях (Gene Regulatory Networks; GRNs) прямая связь между высокоуровневыми регуляторными генами и генами терминальных дифференцировок может указывать на предковое состояние системы. Согласно гипотезе интеркалярной эволюции, регуляторные гены-посредники, которые формируют сложную архитектуру GRNs, разворачивающуюся в период регионализации и паттернирования – результат эволюционных интеркаляций (вставок) между исходным мастер-геном и его мишенью, например, между гомеобоксным геном Pax6 и светочувствительным трансмембранным белком родопсином [49–51]. Hox-гены универсальным образом причастны к установлению и поддержанию терминальной спецификации нейронов у первичноротых и вторичноротых животных, что допускает существование просто организованного предка всех Nephrozoa, который использовал Hox-гены с той же целью. Изначально простые GRNs такого предка постепенно и независимо друг от друга усложнялись в разных эволюционных линиях за счёт вовлечения новых кладоспецифичных генов под контроль Hox-кластера, а гетерохронные сдвиги сместили начало активности всех участников к более ранним срокам развития и привели их экспрессию к каноническому виду. Возможно, уже на первых этапах этого эволюционного процесса Hox-гены координировали формирование синапсов между двигательными нейронами и мышцами. Поэтому общий принцип коллинеарной транскрипции Hox-генов роднит Drosophila и млекопитающих на уровне двух зародышевых листков – эктодермального и мезодермального. Важно, что принцип интеркалярной эволюции допускает прирастание GRNs путём дупликации мастер-гена и субфункциолизации генов-потомков с частичным сохранением предковой функции [51].

У этой привлекательной гипотезы есть внутренние противоречия. Во-первых, для того, чтобы специфицировать нейроны, не нужна физическая сцепленность терминальных селекторов. Большинство гомеобоксных генов, которые создают нейральный код у нематоды, не собраны в кластеры [47, 48].

Во-вторых, уровень сложности последнего общего предка всех Nephrozoa остаётся под вопросом, потому что его Hox-кластер уже состоял по меньшей мере из 7 или 8 генов, а именно из пяти передних (PG1–5), одного или двух серединных (PG6/8) и одного постериорного (PG9/14) [9]. Известно, что функции генов из разных паралогических групп существенно перекрываются [52], а это значит, что предковый кластер сформировался очень быстро, до того, как его участники начали сильно различаться спектрами своих мишеней. Если количественная информация, реализуемая Hox-белками, была в какой-то момент важнее качественной (паралог-специфичной), это могло подтолкнуть Hox-кластер к быстрой структурной экспансии с минимальной дивергенцией участников. При этом паралог-специфические функции стали появляться позже. Такое объяснение выглядит логичным, но оставляет вопросы: почему Hox-белки из разных паралогических групп качественно важны для спецификации нейронов и почему эти белки различаются структурно, а некоторые из их паралог-специфических функций консервативны (общие для Nephrozoa)? Создаётся впечатление, что отбор двигал эволюцию Hox-кластера сразу в нескольких направлениях, и это объяснимо, если нейрогенная функция не была единственной. Так это или нет, можно выяснить, обратившись к базальным таксонам.

За пределами группы Nephrozoa экспрессия Hox-генов изучена менее подробно, но известно, что маленькие и разорванные кластеры Acoelomorpha (сестринская ветвь Nephrozoa, ранее относимая к плоским червям) работают в нервной, мышечной и репродуктивной системах [53–56]. В единственном исследовании на эмбрионах [53] показано, что три Hox-гена Convolutriloba longifissura (PG1, PG5 и PG9/14) коллинеарно включаются в пронейральных территориях вскоре после гаструляции. Два гена из трёх чуть позже или одновременно с этим событием работают в паренхиматозных внутренних доменах.

Hox-гены книдарий изучены довольно подробно [57–59] и экспрессию некоторых из них можно ассоциировать с нервной системой, например, Hox1 (PG1) Clytia hemisphaerica работает в статоцистах, а Anthox1 (PG9-подобный) – в апикальном султанчике у планул Nematostella vectensis. Однако на фоне разнообразных нейральных дифференцировок, в которых участвуют другие гомеобоксные гены книдарий, это очень скромный результат [60, 61]. Удивительно, что многие нейротрансмиттеры (в том числе ацетилхолин) и ферменты их биогенеза синтезируются у книдарий не в нейронах, а в клетках кишки [62]. Трудность анализа экспрессионных данных заключена ещё и в том, что прямое соответствие генов из Hox/ParaHox-классов у книдарий и билатерий неочевидно из-за сильной дивергенции или утраты ортологов [63]. И всё же среди генов, которые устойчиво попадают в категорию «PG1-подобные» или «PG2-подобные», нет прямых регуляторов нейрогенеза, зато есть гены с широкими доменами экспрессии на уровне эктодермы и энтомезодермы.

Итак, до появления последнего общего предка Nephrozoa, на уровне Acoelomorpha, Hox-гены уже были заняты в нескольких разных программах развития. Их функции у книдарий тоже не унифицируются до единственной и не завязаны на терминальную спецификацию нейронов. Путь от общего предка книдарий и билатерий до современных Nephrozoa сопровождался структурной экспансией Hox-кластера и сложными, скрытыми для нас перестройками регуляторных отношений между древними программами развития. Часть этих программ могла опираться на общие паралог-неспецифические функции Hox-генов, которые работают в отрыве от пространственной коллинеарной транскрипции. Мы предполагаем, что эти функции остались у современных животных, и чтобы их исследовать, нужно обратить внимание на общебиологические процессы, в которых задействованы Hox-гены. Существует некоторое количество примеров, где особенно ярко реализуется паралог-неспецифическая функция Hox-генов. Рассмотрим их в следующих разделах.

HOX-БЕЛКИ КОНТРОЛИРУЮТ ТАЙМИНГ РАЗВИТИЯ ПРИ ПОМОЩИ АУТОФАГИИ

Аутофагия – это процесс клеточной деградации, необходимый для поддержания гомеостаза клетки и обновления её цитоплазматических компонентов. Аутофагия высококонсервативна, и её влияние на разнообразные биологические функции описано у широкого круга организмов: от растений и дрожжей до человека [64]. Для билатерий аутофагия является важным инструментом раннего развития, так как она принимает участие в клеточных дифференцировках и тканевых перестройках [65, 66]. Например, у личинок дрозофилы активность аутофагии очень высока в жировом теле L3-бродячей (L3W) стадии, когда личинка быстро растёт и претерпевает метаморфоз, но не у более молодой L3-кормящейся (L3F) стадии. Было показано, что переход из стадии L3F в L3W контролируется экдизоном, и основными регуляторами аутофагии в этом случае выступают Hox-белки, которые подавляют преждевременную аутофагию на стадии L3F [67]. При нормальном развитии в жировом теле L3F-личинки обнаружена совместная неколлинеарная локализация Hox-белков из нескольких паралогических групп. Здесь Hox-белки подавляют экспрессию генов atg (18 генов), ответственных за аутофагию. Показано, что нокауты по отдельным Hox-генам (Dfd, Scr, Ubx, abd-A, AbdB) не приводят к преждевременному запуску аутофагии. Только единовременное выключение экспрессии всех Hox-паралогов в эксперименте на личинке L3F инициирует этот процесс [67]. Наоборот, пролонгированная экспрессия исследованных Hox-генов ингибирует аутофагию в клетках жирового тела личинок. Такие особи переходят в блуждающую стадию на 6–7 дней позже, чем контрольные, и это указывает на то, что принудительное поддержание экспрессии Hox-генов приводит к задержке развития дрозофилы. Таким образом, в жировом теле личинок универсальная активность Hox-белков несёт временную, а не пространственную информацию, регулируя наступление аутофагии на нужном этапе развития. Стоит отдельно отметить, что в культуре фибробластов млекопитающих HoxB8 и HoxA9 тоже подавляют аутофагию. Эти же белки оказывают сходное действие на личинку дрозофилы при трансгенезе [67]. Эти предварительные исследования не исключают паралог-неспецифического участия Hox-генов в контроле аутофагии у последнего общего предка насекомых и позвоночных, но требуют проведения дополнительного анализа на широком круге объектов.

ЗАЧЕМ HOX-ГЕНЫ РАБОТАЮТ ДО НАЧАЛА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ?

У многоклеточных животных Hox-гены не экспрессируются в тотипотентных и плюрипотентных клетках, поскольку эта экспрессия индуцирует дифференцировку. В эмбриональных стволовых клетках млекопитающих Hox-локусы имеют амбивалентный эпигенетический статус. Их гистоновый код содержит как репрессивные, так и пермиссивные метки [68]. Эти клетки не экспрессируют Hox-гены, но могут быстро начать это делать в случае дополнительных разрешающих сигналов, что приведёт их к началу дифференцировочного пути.

Несмотря на запрет работы Hox-генов в тотипотентных клетках, их материнские транскрипты были обнаружены в ооцитах млекопитающих (мышь, корова и человек [69]), амфибий (Xenopus laevis [70]), аннелид (Platynereis dumerilii [71]), многоножек (Strigamia maritima [72], Trigoniulus corallinus [73]), перепончатокрылых (муравьи трибы Camponotini [74]), декапод (Macrobrachium olfersii [75]) и даже у гидроидного полипа Clitya hemisphaerica [58]. Причём у всех животных, кроме X. laevis, в ооцитах экспрессировались гены из нескольких паралогических групп.

Структура ооцитарных транскриптов Hox-генов может дать подсказку об их функциях. На примере многоножки Strigamia maritime (Chilopoda) [72] было показано, что материнские РНК Hox-генов полиаденилированы, но некоторые из них не содержат открытой рамки считывания. Возможно, часть материнских РНК многоножки относится к классу регуляторных (белок-некодирующих) РНК. С другой стороны, транскрипты Hox-генов в ооцитах млекопитающих деаденилированы [69]. Это объяснимо, если такие материнские транскрипты нужны для поздних этапов развития и запасаются в стабильной (нетранслируемой) форме [76]. Кроме того, в ядрах ооцитов и в клетках ранних эмбрионов млекопитающих (мышь, корова) был обнаружен белок HOXB9 [77], а белки Ubx и AbdA найдены в ооцитах муравьёв [74].

Очевидно, что ооцитарная функция Hox-генов отличается от канонической, поскольку представители разных паралогических групп локализуются в одной-единственной клетке. Консервативность этого явления говорит о его неслучайной природе. Пока не существует удачных экспериментов, однозначно указывающих на функции ооцитарных транскриптов Hox-генов, но можно выдвинуть несколько гипотез.

Не исключено, что большая часть материнских транскриптов Hox-генов не транслируются. Они могут быть элементом эпигенетической настройки зиготического генома. Известно, что некодирующая РНК часто работает каркасом для сборки белков ремоделинга хроматина, нацеливая их на подконтрольные локусы. Эта функция описана в том числе и для регуляторных РНК, которые считываются с Hox-кластеров позвоночных животных [78], и согласуется с наличием транскриптов без открытой рамки считывания в ооцитах Strigamia. Важность некодирующей РНК в первых делениях дробления была показана на эмбрионах мыши [79].

C другой стороны, РНК-матрицы Hox-генов могут транслироваться. Например, белок HoxB9 присутствует в ядрах ооцитов (как зрелых, так и незрелых) и в ядрах клеток ранних эмбрионов [77]. Это не исключает раннюю функцию Hox-генов, направленную на оогенез. Известно, что у мыши ряд транскриптов Hox-генов и их кофакторов уже присутствует на стадии растущего ооцита [80]. Любопытно, что гомеодоменный белок Nobox из одноимённого семейства, одновременно близкого к ANTP- и PRD-классам [81], присутствует в ооцитах мыши и регулирует работу важных для оогенеза генов [82]. Нельзя исключить, что ооцитарные матрицы и белки Hox-генов нужны для транскрипционного контроля ранних зиготических генов [83].

Hox-белки могут быть не только транскрипционными регуляторами, но и регуляторами клеточного цикла, сплайсинга РНК, репликации и репарации ДНК [84–86]. Так, у некоторых Hox-белков есть сайты распознавания для серин/треонин-киназы ATM [87], чья роль в репарации двунитевых разрывов ДНК широко известна [88]. Как минимум для одного Hox-белка позвоночных, HoxB7, было экспериментально показано участие в этом процессе [85]. В эпителиальных клетках молочной железы HoxB7 увеличивает вероятность негомологичного соединения концов ДНК, связываясь с комплексом из гетеродимеров Ku70/80 (белками, узнающими двуцепочечные разрывы) и ДНК-протеинкиназой [85]. Экспрессия HoxB7 стимулирует работу ДНК-протеинкиназы, что коррелирует с эффективностью репарации, тогда как при нокауте по HoxB7 этот эффект пропадает. Кроме того, Hox-белки способствуют сборке пререпликативных комплексов. Например, HoxD13 и HoxC13 в различных клеточных культурах взаимодействуют при помощи гомеодоменов с белками пререпликативных комплексов ORC и Cdc6 [86, 89, 90]. Несмотря на то что упомянутые функции Hox-белков были описаны не в эмбриогенезе, мы предполагаем, что они всё же могут участвовать в первых стадиях развития многоклеточных животных. В раннем развитии синхронные деления бластомеров протекают с минимальным интервалом (нет G1- и G2-фаз цикла), поэтому для успешного завершения этапа дробления необходима очень точная настройка молекулярной машинерии ооцита. В данном случае ооцитарные Hox-белки могут ускорять сборку пререпликативных комплексов и усиливать репарацию ДНК для поддержания целостности генетического материала зародыша.

Безусловно, роль Hox-генов в оогенезе не прояснится без функциональных тестов на широком круге моделей. Не исключено, что ооцитарные РНК и белки Hox-генов могут быть «транскрипционным шумом» или побочными продуктами предыдущих этапов оогенеза [91].

ДОЗОЗАВИСИМЫЕ ФУНКЦИИ HOX-БЕЛКОВ

Существуют дозозависимые функции Hox-белков, реализующиеся, когда морфология зачатка определяется их концентрацией [92]. У млекопитающих Hox-белки в дозозависимой манере задают морфологию позвонков [93] и устанавливают число и длину пальцев [94]. В обоих случаях постепенное снижение дозы Hox-белков усиливает выраженность морфологических изменений. Так, при постепенном снижении дозы любого белка из постериорных паралогов HoxA- и HoxD-кластеров (Hoxd11, Hoxd12, Hoxa13, Hoxd13) пальцы линейно и паралог-независимо укорачиваются в зависимости от доли мутантных аллелей Hox-генов [94].

У беспозвоночных животных самый наглядный пример дозозависимой функции Hox-белков – регуляция морфологии крыльев. Эта функция описана у насекомых из разных клад и, по всей видимости, является универсальной для диверсификации формы и размера крыльев на втором (T2) и третьем (T3) грудных сегментах [92]. В её выполнении задействованы белки Antp и Ubx. У Drosophila дикого типа белок Antp присутствует только в Т2, а белок Ubx – в Т3, причём концентрация Antp в T2 ниже, чем концентрация Ubx в Т3 (рис. 1, а) [95]. У мутантов Ubx-/- вместо гальтер на Т3 образуется пара крыльев (рис. 1, б). Если у таких мутантов повысить дозу Antp в Т3 до уровня Ubx, то восстанавливается нормальный фенотип (на Т3 образуются гальтеры (рис. 1, в)) [95]. Наоборот, при снижении дозы Ubx в Т3 вместо гальтер вырастают летательные крылья (рис. 1, г) [95]. Также при повышении дозы Antp в T2 вместо крыльев появляются гальтеры (рис. 1, д) [95].

Рис. 1. Влияние дозы Antp- и Ubx-белков на фенотип Drosophila. а – «Дикий тип» (на рисунке обозначен как WT); б – мутант Ubx-/-; в – доза Antp в Т3 на уровне Ubx в норме восстанавливает фенотип; г – доза Ubx в Т3 на уровне Antp в Т2 приводит к формированию крыла; д – доза Antp в Т2 на уровне Ubx в Т3 приводит к формированию гальтер; е – гипотетический фенотип, близкий к наблюдаемому у веерокрылых (отряд Strepsiptera), который может быть смоделирован на Drosophila. Иллюстрация подготовлена по данным статьи Paul et al. (2021) и Merabet, Carnesecchi (2024) [92, 95]

HOX-ФАКТОРЫ МОГУТ СЕКРЕТИРОВАТЬСЯ

Сложность, с которой сталкивается исследователь, решивший прояснить анцестральную функцию гомеобоксных генов из класса ANTP, связана с тем, что такая функция изначально не была единственной, по крайней мере, на уровне Metazoa. Это следует из устройства многозадачных гомеодоменных белков ANTP-класса (рис. 2). Ещё в конце прошлого столетия было обнаружено, что синтетический гомеодоменный белок из 60 аминокислотных остатков, повторяющий последовательность гомеодомена Antp Drosophila, может проникать сквозь мембраны нервных клеток крысы без посредничества каких-либо рецепторов. После проникновения он транспортируется в ядро и повышает уровень дифференцированности реципиентных клеток [96]. Позже выяснилось, что естественные гомеодоменные белки Emx1, Emx2, Engrailed-2 (En2), Hoxa5, Hoxb4, Hoxc8, Knotted1, Otx2, Pax6 и Vax1 обнаруживаются в клетках, которые не экспрессируют их мРНК [97].

Рис. 2. Структурные мотивы белков из класса ANTP и их участие в реализации функций Hox-белков. Схема описывает функциональное значение основных доменов Hox-факторов. Гомеодомен, наиболее консервативный участок белков ANTP-класса, необходим Hox-факторам для реализации как канонических (транскрипция), так и неканонических функций. Помимо гомеодомена, высокая степень консервативности также характерна для короткого гексапептидного мотива, с помощью которого Hox-белки взаимодействуют с кофакторами [102]. Удивительно, что транспортная способность Hox-факторов также обусловливается этими доменами: гомеодомен содержит секретирующий и интернализующий (пенетратин) мотивы, а консервативный остаток триптофана в гексапептиде необходим Hox-белкам для экспорта из ядра [103]. Для некоторых Hox-факторов показано, что их секреция может зависеть от отдельных гидрофобных аминокислот, локализованных в менее консервативных сайтах белка [97]. Цветными буквами в последовательностях отмечены консервативные позиции, цветными рамками окружены мотивы, неканонические функции выделены жирным шрифтом, Mm – Mus musculus, Dm – Drosophila melanogaster, ао – аминокислотные остатки

Оказалось, что способность к межклеточному переносу, подобно сигнальной молекуле или молекуле морфогена, есть у большинства гомеодоменных белков, в том числе за границами класса ANTP [97–100]. Механизм, при помощи которого это происходит, ещё не вполне понятен. Известно, что секреция и интернализация зависят от двух перекрывающихся мотивов, локализованных в наиболее консервативных участках гомеодомена [100]. Кроме того, секреция зависит от отдельных гидрофобных аминокислот за пределами гомеодомена (рис. 2) [97]. Создаётся впечатление, что гомеодоменные белки способны попадать в любые типы клеток путём макропинацитарного эндоцитоза, но эффективность процесса зависит от устройства гликокаликса принимающей клетки [97, 101].

Во впечатляющем исследовании 2019 года [97] на способность к секреции и переносу были протестированы 162 человеческих гомеодоменных белка из разных классов, причём тест проводили одновременно на трёх разных культурах клеток (секреция – HEK 293T, GT1-7 и MDCK; интернализация – HeLa). Показано, что эффективность секреции сильно зависит от типа клеток и от характеристик первичной последовательности самих гомеодоменных белков. К примеру, белки EN2, HOXC8, PAX6 и VAX1 секретировались во всех трёх клеточных культурах, а HOXA5 и OTX2 – только в двух. Десять белков, в числе которых оказался только один Hox (HOXA10), не секретировались вовсе, что, впрочем, не исключает такой возможности в других типах клеток. Все протестированные белки (включая не секретируемые) оказались способны к интернализации. Это значит, что именно секреция гомеодоменных белков – определяющий этап трансдукции, на котором клетки контролируют этот процесс.

Гомеодоменные белки способны распространяться на два-три клеточных диаметра подобно паракринным сигнальным факторам, но есть примеры их обширной диффузии. У мыши белок Otx2 синтезируется в сосудистом сплетении, секретируется в спинномозговую жидкость и накапливается по всей коре головного мозга [104].

Важно, что эндогенные белки преимущественно работают как транскрипционные факторы. Сразу после трансляции их захватывают кариоферины, распознающие сигнал ядерной локализации, и транспортируют в ядро. Экзогенные белки демонстрируют более широкий спектр функций. Показано, что секретируемый Otx2 мыши перемещается в митохондрии, где связывается с митохондриальными ATP-синтазами и усиливает синтез ATP [105]. Ранее сообщалось, что экзогенный En2 у Xenopus накапливается в конусах роста нейронов, управляет нацеливанием их аксонов на мишени и косвенно усиливает трансляцию [106].

Эти примеры не исключают проникновения экзогенных белков в ядра, где они запускают транскрипцию собственных мРНК и других специфических мишеней. Классический пример такого рода – вертикальный сигналинг во время гаструляции у Xenopus. Было показано, что Hox-белки из пресомитной мезодермы последовательно включают экспрессию собственных Hox-генов в нейроэктодерме гаструлы, т.е. происходит копирование позиционной информации из одного зародышевого листка в другой [104]. Прямой обмен транскрипционными факторами между слоями клеток координирует работу программ развития без посредничества морфогенов и сигнальных каскадов.

Поразительно, что сигнальная и регуляторная функции в общих случаях обеспечиваются здесь одним и тем же эволюционно древним, консервативным мотивом – гомеодоменом. Возможность решить две задачи при помощи одного инструмента могла использоваться для координации роста и развития первыми Metazoa, ещё до возникновения современных отношений между лигандами, способными перемещаться на большие расстояния (long range signaling), их мессенджерами и мишенями [104].

КАК НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ПРИВЕЛИ РАБОТУ HOX-КЛАСТЕРА К КАНОНИЧЕСКОМУ ВИДУ?

Координированная работа Hox-генов, необходимая для выполнения канонической функции, остаётся большой эволюционной загадкой потому, что это многособытийный процесс. Он складывается из:

– эпигенетической настройки Hox-локусов, в том числе за счёт регуляторных РНК, закодированных в Hox-кластерах;

– установления топологически-ассоциированных доменов (TADs), которые стабилизируются в соответствии с положением клеток вдоль передне-задней оси;

– ответов на разнонаправленные сигналы морфогенов (ретиноевой кислоты, Wnt, Fgf, Bmp) в трёхмерных координатах эмбриона;

– согласованной экспрессии в клетках разных зародышевых листков за счёт уникального для гомеодоменных белков механизма – вертикального сигналинга;

– ответа на индивидуальные сигналы вышестоящих регуляторных белков, которые могут включать/выключать индивидуальные гены;

– реципрокных взаимодействий Hox-генов (постериорная супрессия и не только).

Некоторые из регуляторных механизмов представлены на рис. 3.

Рис. 3. Управление транскрипцией Hox-кластера. а – Некоторые механизмы контроля над Hox-кластером у билатеральных животных. 1 – GCR (Global Control Region), глобальный контролирующий элемент. Регуляторные элементы этого типа описаны у позвоночных; 2 – локальные cis-регуляторные модули (индивидуальные и обобществлённые), сайт-специфичные транскрипционные факторы и микроРНК (miR), закодированные в последовательностях Hox-кластеров. Присутствуют у первичноротых и вторичноротых животных; 3 – вертикальный сигналинг – описан у позвоночных. б – Неканонические функции Hox-генов, которые могут быть реализованы при помощи отдельных элементов контроля. в – Упрощённая схема регуляции Hox-кластера во время реализации канонической функции осевого паттернирования. Не все из механизмов представлены на схеме и не все из представленных универсальны. У членистоногих не найдены GCR и не показан вертикальный сигналинг. Спиральные животные в целом плохо изучены на уровне активационных механизмов Hox-кластера, но среди них есть объекты с темпоральной коллинеарностью и изначальной мезодермальной транскрипцией. RA (Retinoic Acid), FGF и WNT – градиенты морфогенов

Как на основе неканонических функций могла возникнуть эта очень сложная картина? Возможно, разные способы регуляции Hox-кластера, нужные для выполнения отдельных задач, были кооптированы в новую программу. Интуитивно верным кажется предположение, что эта новая программа – гаструляция в её «билатеральном варианте». На эту мысль наводит временна́я сопряжённость активации Hox-кластера и гаструляционных процессов у вторичноротых животных. Кроме того, есть данные о преадаптации – два Hox-гена книдарии Nematostella vectensis (передний, NvAx6, и серединно-постериорный, NvAx1) важны для гаструляции и спецификации орально-аборальной оси. Сайты их экспрессии маркируют оральный и аборальный полюса, а морфолиновый нокдаун подавляет гаструляцию [107]. Однако эти гены не образуют кластер и работают в разных зародышевых листках. У Drosophila осевой паттерн Hox-генов устанавливается до начала гаструляции, и пока нет исследований, где бы достоверно подтверждалось или опровергалось участие Hox-генов в гаструляции у членистоногих. У некоторых спиральных животных (аннелиды, брахиоподы, моллюски) ранняя активация Hox-генов совпадает с началом или продолжением гаструляции, но функциональные тесты пока отсутствуют [26, 108, 109].

С высокой степенью уверенности можно утверждать, что у последнего общего предка билатеральных животных Hox-кластер был один. Этот кластер мог использоваться для решения нескольких разных задач, например, для спецификации двигательных нейронов, установления нервно-мышечных синапсов и для какой-то из функций, требующих количественного изменения транскриптов в ответ на стимул (вероятно, концентрацию морфогена). Такая древняя функция могла быть связана с аутофагией, контролем над пролиферацией или гаметогенезом. Важно, что эта функция обеспечивалась градиентным распределением Hox-белков вдоль оси и удерживала Hox-гены в кластере. Предок Nephrozoa мог использовать весь кластер или какие-то гены из него для управления гаструляцией, но в линии современных Acoelomorpha (сестринская ветвь Nephrozoa) это не так, потому что все Hox-гены Convolutriloba включаются после гаструляции [53].

Разные способы управления одним и тем же кластером, очевидно, давали сбои, и какие-то из аберрантных вариантов подхватывались отбором. В эволюции билатеральных животных из линии Nephrozoa могли произойти два важных события – объединение нескольких систем регуляции Hox-кластера в одной программе и гетерохронный сдвиг её активации в сторону более раннего развития. Наименее катастрофичный вариант предполагает серию гетерохронных сдвигов коллинеарной экспрессии Hox-генов во внутренних, мезодермальных по происхождению структурах вплоть до стадии гаструлы. После этого при помощи вертикального сигналинга Hox-гены начали коллинеарно включаться в прилежащей эктодерме (будущей нейроэктодерме), и животные приобрели новый мощный инструмент для контроля над ранним развитием. Этот инструмент легко масштабировался в зависимости от градиента морфогенов, он координировал развитие эктодермальных и мезодермальных тканей и был эволюционно пластичен за счёт многих элементов управления, пришедших из более древних программ. Возможно, именно этот новый молекулярный механизм «детонировал» и вызвал «Кембрийский взрыв», потому что мог быстро изменять раннее развитие.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разнообразие неканонических функций Hox-генов определяется самой структурой гомеодоменного белка, который может работать не только транскрипционным фактором, но и регулятором общебиологических процессов, таких как репарация ДНК, репликация, трансляция и сплайсинг РНК.

Модель «песочных часов», при всей наглядности, оставляет неканонические функции Hox-генов невидимыми. Согласно модели «обратных песочных часов» (Inverse hourglass model), которая справедлива для Metazoa в целом [110], существует принципиальное сходство в работе генов на самых ранних этапах развития (плюрипотентное состояние клеток, дробление) и на более поздних (дифференцировка, органогенез). Однако животные из разных типов будут сильно различаться ансамблями регуляторных генов и характером их вовлечённости в морфогенез в середине развития (mid-developmental transition), как раз между дроблением и коммитированной дифференцировкой [110]. Именно эти различия и определяют фундаментальную разницу между типами внутри Metazoa. Иными словами, можно выявить отдельные наборы сигнальных путей и транскрипционных факторов, которые взаимодействуют в период установления планов организации Metazoa. Их частная совокупность формирует облик типа. Оказалось, что гомеобоксные гены в целом и Hox-гены в частности не попадают в категорию таких «типоспецифичных» регуляторов, потому что в дивергентный период развития их функции шире и консервативней.

Мы предполагаем, что у прото-Hox-гена изначально уже был широкий репертуар функций, причём часть из них опиралась на сигнальную природу его белка. Животные из ветви ParaHoxоzoa оказались наследниками этой регуляторной сложности и приумножили её за счёт кооперации между программами развития, в которых использовались разные функциональные возможности Hox-белков. Эти программы возникали на разных этапах эволюции, и их следы сохранились у современных животных в виде отдельных паралог-неспецифических и дозозависимых функций.

Вклад авторов. М.A. Кулакова – концепция и руководство работой; М.A. Кулакова, Г.П. Маслаков, Л.О. Полюшкевич – написание текста; М.A. Кулакова, Г.П. Маслаков, Л.О. Полюшкевич – редактирование текста статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт Российского научного фонда (проект № 23-24-00426).

Благодарности. В работе использовали программное обеспечение для анализа последовательностей Geneious® 2023.2.1, доступ к которому был предоставлен ресурсным центром «ЦКП Хромас» Санкт-Петербургского государственного университета.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Данная статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

M. A. Kulakova

Author for correspondence.
Email: m.kulakowa@spbu.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

G. P. Maslakov

Email: m.kulakowa@spbu.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

L. O. Polyushkevich

Email: m.kulakowa@spbu.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Effect of Antp- and Ubx-protein dosage on Drosophila phenotype. a - ‘Wild type’ (labelled as WT in the figure); b - Ubx-/- mutant; c - Antp dose in T3 at the level of Ubx in normal restores the phenotype; d - Ubx dose in T3 at the level of Antp in T2 leads to wing formation; e - Antp dose in T2 at the level of Ubx in T3 leads to the formation of a galter; f - hypothetical phenotype close to the one observed in fanflies (Strepsiptera), which can be modelled on Drosophila. The illustration is based on data from Paul et al. (2021) and Merabet, Carnesecchi (2024) [92, 95]

Download (280KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Structural motifs of proteins from the ANTP class and their involvement in the realisation of Hox-protein functions. The scheme describes the functional significance of the main domains of Hox-factors. The homeodomain, the most conserved region of ANTP-class proteins, is required for Hox-factors to realise both canonical (transcription) and non-canonical functions. In addition to the homeodomain, a high degree of conservativity is also characteristic of the short hexapeptide motif by which Hox proteins interact with cofactors [102]. Surprisingly, the transport capacity of Hox factors is also driven by these domains: the homeodomain contains secreted and internalising (penetratin) motifs, and the conserved tryptophan residue in the hexapeptide is required for Hox proteins to export from the nucleus [103]. For some Hox factors, it has been shown that their secretion can depend on individual hydrophobic amino acids localised to less conserved sites on the protein [97]. Coloured letters in the sequences indicate conserved positions, coloured boxes surround motifs, non-canonical functions are shown in bold, Mm - Mus musculus, Dm - Drosophila melanogaster, ao - amino acid residues

Download (199KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Control of Hox cluster transcription. a - Some mechanisms of Hox cluster control in bilateral animals. 1 - GCR (Global Control Region), global controlling element. Regulatory elements of this type have been described in vertebrates; 2 - Local cis-regulatory modules (individual and generalised), site-specific transcription factors and microRNAs (miR) encoded in Hox cluster sequences. Present in primary and secondary animals; 3 - vertical signalling - described in vertebrates. b - Non-canonical functions of Hox genes that can be realised by individual controls. c - Simplified scheme of Hox cluster regulation during the realisation of canonical axial patterning function. Not all of the mechanisms are represented in the scheme and not all of those represented are universal. No GCRs are found in arthropods and no vertical signalling is shown. Spiral animals are generally poorly understood at the level of Hox cluster activation mechanisms, but among them there are sites with temporal collinearity and primordial mesodermal transcription. RA (Retinoic Acid), FGF and WNT are gradients of morphogens

Download (291KB)

Indexing metadata