Design, In Silico Evaluation, and Determination of Antitumor Activity of Potential Inhibitors Against Protein Kinases: Application to Bcr-Abl Tyrosine Kinase

Full Text

Принятые сокращения: МД – молекулярная динамика; ХМЛ – хронический миелоидный лейкоз; RMSD – среднеквадратичное отклонение.

ВВЕДЕНИЕ

Гибридный ген BCR-ABL1, образующийся в результате реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 (филадельфийская хромосома), кодирует тирозинкиназу Bcr-Abl с аномально высокой активностью, которая регулирует сигналы, ответственные за клеточный рост, активацию, дифференцировку, адгезию и апоптоз [1, 2]. Tирозинкиназа Bcr-Abl играет ключевую роль в патогенезе хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), характеризующегося быстрым неконтролируемым ростом миелоидных клеток в периферической крови и костном мозге, и в 20−50% случаев является причиной острого B-лимфобластного лейкоза взрослых [3–5]. Первый препарат для лечения пациентов с ХМЛ, иматиниб, одобренный в 2001 году Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA; https://www.fda.gov/; по состоянию на 28.02.2024), селективно взаимодействует с ATP-связывающей полостью тирозинкиназы Bcr-Abl [6–8]. Связывание иматиниба с каталитическим центром белка приводит к ингибированию его активности in vitro и in vivo, подавлению пролиферации и апоптозу в клетках, экспрессирующих тирозинкиназу Bcr-Abl при Ph-позитивном ХМЛ [9–11]. В результате терапии иматинибом у больных с ХМЛ через 2 года после начала лечения наблюдается полный цитогенный ответ с состоянием стойкой ремиссии в течение длительного времени [9–11]. Иматиниб является также эффективным лекарственным средством для лечения острого лимфоцитарного лейкоза с филадельфийской хромосомой, некоторых типов стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, гиперэозинофильного синдрома, хронического эозинофильного лейкоза, системного мастоцитоза и миелодиспластического синдрома [5]. Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый при лечении ХМЛ иматинибом, у части пациентов развивается резистентность к этому препарату, что приводит к повышению уровня тирозинкиназы Bcr-Abl [12–15]. Одной из основных причин этого является мутация T315I в гене ABL, которая нарушает важные взаимодействия иматиниба с целевым белком [12–15].

За последние два десятилетия с момента открытия иматиниба были разработаны и одобрены FDA для лечения ХМЛ ингибиторы тирозинкиназы Bcr-Abl второго и третьего поколения, среди которых в первую очередь следует отметить нилотиниб, дазатиниб, бозутиниб и понатиниб, взаимодействующие с ATP-связывающим центром фермента, а также аллостерический ингибитор с альтернативным механизмом действия − асциминиб [16–20]. Все эти противоопухолевые агенты проявляют повышенную ингибиторную активность, по сравнению с иматинибом, и эффективны во многих случаях, когда возникает резистентность к этому препарату [16–20]. Их применение позволило значительно увеличить продолжительность жизни пациентов с ХМЛ, а также с некоторыми стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта [16–20]. Однако, наряду с терапевтическим эффектом, лечение этими препаратами может сопровождаться рядом гематологических и негематологических побочных эффектов, связанных с их относительно высокой токсичностью [12, 19, 20]. Кроме того, мутации, возникающие в ATP-связывающей полости тирозинкиназы Bcr-Abl, могут вызывать резистентность к используемым препаратам, оставляя пациентам ограниченные возможности лечения [13, 14, 16, 19, 20]. На сегодняшний день мутация T315I является главной причиной развития первичной и вторичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназы Bcr-Abl у пациентов с хронической фазой ХМЛ [14, 18]. В связи с этим в настоящее время проводятся многочисленные исследования по разработке противоопухолевых агентов, эффективных для лечения больных ХМЛ с мутацией T315I в гене ABL. Подробная информация об этих исследованиях представлена в недавних обзорных статьях [12, 14, 18], свидетельствующих о том, что работы по созданию новых эффективных препаратов против ХМЛ, которые могут преодолевать приобретаемую в ходе лечения резистентность, по-прежнему являются чрезвычайно актуальными.

Современный дизайн лекарственных препаратов все больше ориентируется на разработку многоцелевых ингибиторов, содержащих два и более фармакофора из разных органических веществ, что усиливает активность соединений-предшественников и даже приводит к новым видам биологической активности за счет появления дополнительных взаимодействий с целевым белком [21]. В соответствии с этой терапевтической стратегией в настоящей работе осуществлен дизайн производных 2-ариламинопиримидина – основного фармакофора иматиниба [11, 20], содержащих фрагмент 5-арилзамещенного изоксазола – азольного соединения, присутствующего в структурах многих противоопухолевых агентов с различными механизмами действия [22]. Методами молекулярного докинга и молекулярной динамики (МД) проведена оценка потенциала ингибиторной активности этих соединений по отношению к тирозинкиназе Bcr-Abl и ее мутантной форме T315I и выполнено их тестирование на противоопухолевую активность с использованием моделей опухолевых клеток in vitro. В результате проведенных исследований идентифицированы три соединения, перспективные для разработки новых кандидатов в лекарственные средства для терапии пациентов с ХМЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Теоретическая часть. Дизайн потенциальных ингибиторов тирозинкиназы Bcr-Abl. Способность соединений 2-ариламинопиримидинового ряда блокировать процесс канцерогенеза путем ингибирования протеинкиназ обусловила использование пиримидинового гетероцикла в качестве ключевого фармакофора многих соединений, на основе которых разработаны эффективные противораковые лекарства [11, 15, 20, 23, 24]. Дизайн гибридных молекул осуществляли путем объединения 2-ариламинопиримидинового фармакофора с фрагментом 5-арилзамещенного изоксазола, используя различные комбинации метильных заместителей в кислотном и аминном остатках амида. В структурах целевых амидов присутствовали два фармакофорных фрагмента – 2-аминопиримидин в аминном остатке и изоксазол в кислотном остатке, связанные между собой через фениламидный линкер. При этом кислотные и аминные остатки в амиде соединяли амидным линкером, способным образовывать водородные связи в активном центре тирозинкиназы Bcr-Abl. В результате были сконструированы пять химерных молекул, различающихся положением метильных заместителей в кислотном остатке и аминосодержащем остатке. Согласно данным работы Schönherr и Cernak [25], варьирование положений метильных заместителей в структурах биоактивных молекул может оказывать существенное влияние на их ингибиторную активность и в отдельных случаях приводит к ее увеличению более чем на 2 порядка. Эти данные обусловили использование в настоящем исследовании стратегии «магического метильного эффекта» [25] для дизайна потенциальных ингибиторов тирозинкиназы Bcr-Abl на основе химерных молекул, объединяющих ключевые фармакофоры разных противоопухолевых агентов, нацеленных на разные терапевтические мишени.

Для генерации двумерных структур молекул использовали программный пакет ChemDraw 18.0 (https://perkinelmerinformatics.com/products/research/chemdraw; по состоянию на 28.02.2024), а затем с помощью программы Open Babel 2.4.1 [26] рассчитывали их трехмерные структуры с последующей оптимизацией геометрии и минимизацией энергии в силовом поле UFF [27]. Физико-химические параметры соединений рассчитывали с помощью веб-сервера SwissADME [28]. Для оценки липофильности молекул использовали среднее арифметическое значений LogP, вычисленных для каждого лиганда с привлечением методов XLOGP3, WLOGP, MLOGP, SILICOS-IT и iLOGP [28].

Оценку потенциальной ингибиторной активности сконструированных соединений против тирозинкиназы Bcr-Abl и Bcr-AblT315I проводили с помощью методов молекулярного докинга и молекулярной динамики.

Молекулярный докинг. Подготовку соединений для молекулярного докинга осуществляли с помощью программного пакета MGLTools [29]. Молекулярный докинг проводили с использованием программы AutoDock Vina 1.1.2 [30] в приближении жесткого рецептора и гибких лигандов. Трехмерные структуры тирозинкиназы Bcr-Abl и Bcr-AblT315I заимствовали из Банка данных белков (https://www.rcsb.org; PDB ID: 3KFA и 3OY3 соответственно; по состоянию на 28.02.2024). Ячейку для докинга конструировали с использованием программных средств AutoDockTools 1.5.6 (https://ccsb.scripps.edu/mgltools/1-5-6/; по состоянию на 28.02.2024). Для этого с помощью программного пакета UCSF Chimera 1.15 [31] структуру нативной тирозинкиназы накладывали на структуру ее мутантной формы T315I, совмещали их по атомам Cα и подбирали размеры ячейки таким образом, чтобы она полностью включала ATP-связывающую полость фермента. В результате построенная ячейка имела следующие параметры: ΔX = 31 Å, ΔY = 23 Å, ΔZ = 23 Å с центром при X = 18 Å, Y = 8 Å, Z = 6 Å в системе координат тирозинкиназы Bcr-Abl с мутацией T315I. Параметр, характеризующий полноту поиска (охват конформационного пространства), был задан равным 100 [30].

Значения свободной энергии связывания лигандов с тирозинкиназой Bcr-Abl и Bcr-AblT315I рассчитывали с помощью классической оценочной функции AutoDock Vina 1.1.2 [30] и двух функций машинного обучения − RF-Score-4 [32] и NNScore 2.0 [33]. Межмолекулярные взаимодействия в статических моделях комплексов лигандов с ферментом идентифицировали с помощью программы BINANA 1.3 [34]. Структуры комплексов лиганд/Bcr-Abl визуализировали средствами программного пакета UCSF Chimera 1.15 [31].

Молекулярную динамику комплексов сконструированных соединений с тирозинкиназой Bcr-Abl и Bcr-AblT315I выполняли в программном пакете Amber18 с использованием силовых полей Amber ff14SB (киназа Bcr-Abl) и GAFF (лиганды) [35]. Для задания парциальных зарядов атомов (модель AM1-BCC) использовали модуль Antechamber программного пакета AmberTools18 [35]. Атомы водорода добавляли с помощью программы tleap пакета AmberTools18 [35]. Комплексы лиганд/Bcr-Abl помещали в кубическую ячейку, заполняли растворителем (модель воды TIP3P [35]) и добавляли ионы Na+ и Cl− до значения ионной силы, равного 0,15 М. Систему минимизировали методами наискорейшего спуска (500 шагов) и сопряженных градиентов (500 шагов), нагревали от 0 К до 300 К в течение 50 пс в рамках статистического ансамбля NVT и термостата Ланжевена, а затем уравновешивали в течение 50 пс и давлении 1,0 атм (ансамбль NPT, баростат Берендсена). На заключительном шаге систему уравновешивали в течение 0,5 нс при постоянном объеме и проводили молекулярную динамику длительностью 200 нс в изобарно-изотермических условиях при температуре 300 К и давлении 1 атм.

Анализ молекулярно-динамических траекторий комплексов лиганд/Bcr-Abl. Средние значения энергии связывания для динамических моделей комплексов лиганд/Bcr-Abl рассчитывали с помощью метода MM/GBSA [36–38] в программном пакете AMBER18 [35]. При расчете свободной энергии первые 50 нс МД-моделирования отводили на релаксацию системы и не учитывали при анализе МД-траекторий. Энергию связывания вычисляли для 150 комплексов МД-траектории, разделенных интервалом 1 нс. Для расчета полярной составляющей энергии сольватации использовали континуальную модель растворителя Пуассона–Больцмана с ионной силой 0,15 М. Неполярные компоненты свободной энергии гидратации вычисляли на основе расчетов площади поверхности, доступной растворителю [35]. Энтропийную компоненту свободной энергии Гиббса рассчитывали с использованием программного модуля Nmode [35]. Анализ МД-траекторий выполняли с помощью программного модуля CPPTRAJ пакета AmberTools18 [35]. Для положительного контроля в расчетах МД использовали комплексы тирозинкиназы Bcr-Abl и Bcr-AblT315I с иматинибом и понатинибом, построенные методом молекулярного докинга. Кроме того, для анализа конформационной стабильности комплексов лиганд/Bcr-Abl проводили МД-расчеты нативной тирозинкиназы и ее мутантной формы T315I в свободном состоянии. При этом в качестве стартовых моделей использовали кристаллические структуры фермента (PDB ID: 3KFA и 3OY3).

Экспериментальная часть. Тестирование на противоопухолевую активность. Соединения, синтезированные по методике, описанной нами ранее [39], тестировали на противоопухолевую активность с использованием моделей клеточных линий K562 (хронический миелоидный лейкоз), HL-60 (острый промиелоцитарный лейкоз) и HeLa (карцинома шейки матки). Для анализа использовали тест на жизнеспособность, основанный на свойстве митохондрий живых клеток в процессе аэробного дыхания восстанавливать резазурин до резоруфина, флуоресцирующего в щелочной среде желто-красным цветом [40].

Клеточные линии K562, HL-60 и HeLa были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург; центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных»; https://incras-ckp.ru). Клетки линий K562 и HL-60 выращивали в питательной среде RPMI 1640 («Sigmа-Aldrich», США), а HeLa – в питательной среде DMEM. В обоих случаях в среду добавляли 10% фетальной бычьей сыворотки и смесь антибиотиков пенициллина (100 ед./мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и антимикотика амфотерицина (25 мкг/мл) при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Клетки помещали в 96-луночный планшет («Sarstedt», Германия) в концентрации 104 клеток на лунку в 100 мкл среды и добавляли тестируемые вещества в концентрациях 0,1, 1,0, 10,0, 25,0 и 50,0 мкM. Для этого исходные растворы (20 мМ) соединений в ДМСО последовательно разводили инкубационной средой до конечных концентраций и добавляли к контролю 0,5% ДМСО. После 72 ч культивирования клеток с исследуемыми соединениями в стандартных условиях в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 20 мкл резазурина в концентрации 250 мкМ. Через 3 ч экспозиции при 37 °С в атмосфере 5% CO₂ клетки восстанавливали синий резазурин до розового резоруфина. Количество восстановленного продукта измеряли по флуоресценции при длине волны возбуждения 530–570 нм и длине волны испускания 590 нм на планшетном анализаторе Tecan Infinite M200 («Tecan», Австрия). Жизнеспособность клеток в присутствии исследуемого соединения рассчитывали по формуле:

$Жизнеспособность, \%=ФЛ опытных лунок/ФЛ контр. лунок\times 100\%$, (1)

где ФЛ − флуоресценция.

Концентрацию препарата, которая вызывает 50%-ное ингибирование жизнеспособности клеток (IC₅₀), рассчитывали графически по дозозависимой кривой в программе MS Excel. Все эксперименты проводили в трех независимых повторах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ данных молекулярного докинга показал, что комплексы сконструированных соединений (рис. 1) с тирозинкиназой Bcr-Abl и Bcr-AblT315I проявляют низкие значения свободной энергии связывания (табл. 1). Из данных табл. 1 следует, что эти значения сопоставимы с величинами, рассчитанными с использованием идентичного вычислительного протокола для контрольных ингибиторов, и близки к экспериментальному значению −11,0 ± 0,3 ккал/моль, полученному для комплекса иматиниба с нативной тирозинкиназой Bcr-Abl в работе Agafonov et al. [41]. Важно отметить, что различия между экспериментальным значением энергии связывания и величинами, предсказанными для этого комплекса с помощью трех разных оценочных функций, составляют 0,1 ккал/моль (AutoDock Vina 1.1.2, RFScore 4) и 1,1 ккал/моль (NNScore 2.0) (табл. 1). Эти результаты, указывающие на высокий потенциал ингибиторной активности сконструированных молекул против тирозинкиназы Bcr-Abl и ее мутантной формы T315I, в целом согласуются с выводами, сделанными на основе анализа динамических моделей комплексов лиганд/Bcr-Abl. Данные МД показали (табл. 2), что с учетом величин стандартных отклонений, средние значения свободной энергии связывания анализируемых соединений с ферментом сопоставимы с величинами, предсказанными для иматиниба, но уступают при этом понатинибу – ингибитору тирозинкиназы Bcr-Abl третьего поколения, широко используемому в клинике для терапии ХМЛ [18, 19]. Исключение составляет соединение IV, которое показало гораздо более низкое сродство к обеим терапевтическим мишеням по сравнению с контрольными ингибиторами (табл. 2). Анализ средних значений свободной энергии связывания и стандартных отклонений (табл. 2) дает основание предположить, что комплексы сконструированных соединений с тирозинкиназой Bcr-Abl и ее мутантной формой T315I относительно стабильны в течение МД-расчетов. Это предположение подтверждают данные о временных зависимостях среднеквадратичных отклонений (RMSD, Root-Mean-Square Deviations) координат атомов динамических структур комплексов от их стартовых моделей, построенных методом молекулярного докинга (рис. 2). Согласно приведенным на рис. 2 графикам зависимости RMSD от времени, средним значениям этих величин и стандартным отклонениям, анализируемые комплексы не подвергаются значительным структурным преобразованиям на МД-траекториях. Так, для нативной тирозинкиназы Bcr-Abl средние значения RMSD и стандартные отклонения, равные 3,8 ± 0,5 Å (соединение I), 2,8 ± 0,6 Å (соединение II), 3,2 ± 0,6 Å (соединение III), 3,0 ± 0,5 Å (соединение IV) и 3,2 ± 0,8 Å (соединение V), сопоставимы с величинами 3,0 ± 0,6 Å и 2,4 ± 0,4 Å, полученными для иматиниба и понатиниба соответственно (рис. 2).

 

Рис. 1. Химические структуры сконструированных соединений

 

Таблица 1. Значения свободной энергии связывания ΔG, рассчитанные для статических моделей комплексов лиганд/Bcr-Abl и лиганд/Bcr-Abl^T315I с помощью оценочных функций AutoDock Vina 1.1.2, RFScore 4 и NNScore 2.0

Лиганд	ΔGVina, ккал/моль		ΔGRFScore4, ккал/моль		ΔGNNScore2.0, ккал/моль
	Bcr-Abl	Bcr-AblT315I	Bcr-Abl	Bcr-AblT315I	Bcr-Abl	Bcr-AblT315I
I	–12,5	–10,9	–11,4	–11,3	–11,0	–11,3
II	–11,8	–10,8	–11,4	–11,1	–12,6	–9,8
III	–12,2	–11,0	–11,4	–11,3	–0,6	–11,2
IV	–11,4	–10,6	–11,1	–11,2	–11,4	–10,9
V	–11,8	–10,7	–11,3	–11,5	–11,1	–10,4
Иматиниб	–10,9	–9,3	–11,1	–11,1	–12,1	–9,5
Понатиниб	–12,0	–12,2	–11,4	–11,3	–12,2	–12,3

 

Таблица 2. Средние значения свободной энергии связывания <ΔG> и соответствующие им стандартные отклонения ΔG_STD, рассчитанные для динамических моделей комплексов лиганд/Bcr-Abl и лиганд/Bcr-Abl^T315I

Лиганд	<ΔH>, ккал/моль	ΔHSTD, ккал/моль	<TΔS>, ккал/моль	(TΔS)STD, ккал/моль	<ΔG>, ккал/моль	ΔGSTD, ккал/моль
Тирозинкиназа Bcr-Abl
I	–46,4	3,2	–23,2	6,5	–23,3	7,3
II	–47,3	3,3	–25,9	7,6	–21,4	8,1
III	–43,8	4,4	–25,0	6,6	–18,9	8,1
IV	–34,1	2,9	–24,8	5,3	–9,3	6,0
V	–47,3	4,4	–24,5	6,9	–22,7	8,4
Иматиниб	–50,0	4,8	–26,6	6,9	–23,4	8,2
Понатиниб	–55,1	3,2	–26,1	6,8	–29,0	7,1
Тирозинкиназа Bcr-AblT315I
I	–41,5	3,5	–27,2	5,5	–14,3	6,5
II	–47,2	4,9	–25,2	6,0	–22,0	8,0
III	–29,5	3,2	–21,4	6,3	–8,1	7,2
IV	–26,0	2,7	–23,4	5,2	–2,6	5,9
V	–33,8	3,4	–27,1	7,6	–6,7	8,6
Иматиниб	–39,4	3,5	–25,9	5,7	–13,6	6,9
Понатиниб	–53,3	3,7	–26,7	6,5	–26,7	7,0

 

Рис. 2. Временные зависимости значений RMSD (Å), рассчитанных между динамическими и стартовыми структурами комплексов соединений I−V с тирозинкиназой Bcr-Abl (голубая линия) и Bcr-Abl^T315I (синяя линия). В правом верхнем углу указаны средние значения RMSD и стандартные отклонения для нативного фермента, а в правом нижнем – для его мутантной формы. Приведены также соответствующие данные для контрольных соединений и фермента в свободном состоянии

 

В случае мутантной формы фермента средние значения RMSD и стандартные отклонения для соединений I−V равны 2,5 ± 0,4 Å (соединение I), 2,8 ± 0,5 Å (соединение II), 2,7 ± 0,5 Å (соединение III), 3,1 ± 0,7 Å (соединение IV) и 3,0 ± 0,8 Å (соединение V) и близки к величинам, рассчитанным для иматиниба (2,8 ± 0,6 Å) и понатиниба (2,9 ± 0,9 Å). В то же время для тирозинкиназы Bcr-Abl и Bcr-AblT315I в свободном состоянии эти значения, составляющие соответственно 3,4 ± ± 0,6 Å и 2,6 ± 0,6 Å, сопоставимы с величинами, рассчитанными для анализируемых соединений в комплексах с ферментом (рис. 2). Эти данные, свидетельствующие об относительной конформационной стабильности комплексов лиганд/Bcr-Abl, подтверждают результаты анализа тепловых карт RMSD (рис. 3), которые позволяют оценивать по всей МД-траектории сходства и различия между динамическими структурами в терминах RMSD. Для комплексов сконструированных и контрольных соединений с тирозинкиназой Bcr-Abl и ее мутантной формой T315I средние значения RMSD, вычисленные путем сравнения каждой последующей динамической структуры с предыдущей, варьируют в интервале от 0,78 ± 0,07 Å до 0,82 ± 0,07 Å.

 

Рис. 3. Тепловые карты RMSD, полученные для комплексов тирозинкиназы Bcr-Abl (а) и ее мутантной формой T315I (б) с соединениями I−V, контрольными ингибиторами и фермента в свободном состоянии в разное время моделирования МД. Значения RMSD рассчитывали для атомов основной цепи тирозинкиназы. Время измеряется по осям абсцисс и ординат. Значение RMSD между структурами комплексов в моменты времени t₁ и t₂ находится на пересечении значений t₁ по оси абсцисс и t₂ по оси ординат

 

Дополнительным свидетельством относительной устойчивости комплексов на МД-траекториях являются данные о временных зависимостях значений свободной энергии связывания, которые, несмотря на значительные флуктуации в отдельные промежутки времени, не проявляют тенденции к увеличению в исследованном временном интервале (рис. 4). Тем не менее необходимо отметить, что в ряде случаев наблюдается кратковременное существенное снижение сродства лигандов к активному центру тирозинкиназы Bcr-Abl, однако это не приводит к распаду комплексов, что подтверждают величины энергии связывания на заключительных кадрах МД-траекторий (рис. 4), а также их визуальный анализ.

 

Рис. 4. Временные зависимости свободной энергии связывания для комплексов соединений I−V с тирозинкиназой Bcr-Abl (голубая линия) и Bcr-Abl^T315I (синяя линия). С помощью оранжевой и желтой линий показано простое скользящее среднее с размером окна 20 нс. Сверху и снизу приведены средние значения свободной энергии связывания и соответствующие им стандартные отклонения, рассчитанные соответственно для нативной и мутантной тирозинкиназы Bcr-Abl. Приведены также соответствующие данные для контрольных соединений

 

В табл. 3 приведены физико-химические параметры сконструированных соединений, традиционно используемые при отборе молекул, потенциально эффективных при пероральном применении. Из анализа данных табл. 3 следует, что эти параметры полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к лекарству-кандидату «правилом пяти» Lipinski [42, 43], которые обеспечивают такие важные характеристики, как всасывание, распределение, метаболизм и экскреция.

 

Таблица 3. Физико-химические параметры сконструированных соединений и контрольных ингибиторов иматиниба и понатиниба

Лиганд	Химическая формула	Молекулярная масса (Да)	LogP	Число доноров водородной связи	Число акцепторов водородной связи
I	C27H22N6O2	462,5	4,2	2	6
II	C26H20N6O2	448,5	4,0	2	6
III	C26H20N6O2	448,5	3,9	2	6
IV	C27H22N6O2	462,5	4,3	2	6
V	C26H20N6O2	448,5	3,8	2	6
Иматиниб	C29H31N7O	493,6	3,4	2	6
Понатиниб	C29H27F3N6O	532,6	4,3	1	8

 

Кроме того, по данным компьютерного прогнозирования, проведенного с помощью веб-сервера открытого доступа ProTox-II (https://tox-new.charite.de/protox_II/), рассматриваемые соединения обладают низкой цитотоксичностью и относятся к четвертому классу острой пероральной токсичности, характеризующемуся значениями полулетальной дозы 300 мг/кг < LD₅₀ ≤ 2000 мг/кг [44].

Таким образом, in silico оценка сконструированных соединений показала, что, наряду с потенциальной ингибиторной активностью по отношению к тирозинкиназе Bcr-Abl и Bcr-AblT315I, эти молекулы имеют приемлемые фармакокинетические и токсикологические характеристики. Тем не менее среди сконструированных соединений следует выделить лиганд IV, для которого, как было отмечено выше, не наблюдалось соответствия между данными молекулярного докинга и молекулярной динамики. Однако при анализе полученных результатов необходимо иметь в виду, что все вычислительные подходы к моделированию структуры комплексов белков с лигандами и к оценке энергии межмолекулярных взаимодействий связаны с различными приближениями, необходимыми для решения задачи, что не всегда приводит к удовлетворительной корреляции между расчетными и экспериментальными данными [45, 46]. Поэтому все сконструированные in silico соединения, включая лиганд IV, были синтезированы и исследованы на противоопухолевую активность in vitro.

На рис. 5 показаны графики зависимости жизнеспособности клеток линий K562, HL-60 и HeLa от концентрации лигандов, а в табл. 4 приведены данные о противоопухолевой активности этих соединений, представленные в величинах IC₅₀. Из анализа этих данных видно, что соединения I−III ингибируют рост клеток крови линий K562 и HL-60, однако не оказывают существенного воздействия на жизнеспособность эпителиальных клеток линии HeLa. В то же время соединение IV демонстрирует противоопухолевую активность только против клеток линии HL-60, а соединение V неактивно во всех рассматриваемых случаях (табл. 4). Анализируя полученные данные, необходимо отметить, что соединение III оказалось неактивным по отношению к клеткам линий К562 и HeLa, но в виде метансульфоната эта молекула проявила ингибиторную активность против клеток K562 (табл. 4; рис. 5). В ряду проявивших противоопухолевую активность молекул следует особо выделить соединение I, эффективно подавляющее рост клеток линий K562 и HL-60, что подтверждается низкими значениями IC₅₀, равными 2,8 ± 0,8 мкМ и 3,5 ± 0,2 мкМ соответственно (табл. 4; рис. 5).

 

Рис. 5. Зависимости жизнеспособности клеток (% от контроля) от концентрации исследуемых соединений (log концентрации [моль/литр]). III* − Солевая форма соединения III в виде метансульфоната

 

Таблица 4. Противоопухолевая активность соединений in vitro

Соединение	Клеточная линия
	K562	HL-60	HeLa
	IC50 (мкМ)
I	2,8 ± 0,8	3,5 ± 0,2	> 50,0
II	14,4 ± 3,5	4,5 ± 2,8	> 50,0
III	> 50,0	11,3 ± 3,0	> 50,0
III*	17,4 ± 3,0	14,5 ± 1,3	> 50,0
IV	> 50,0	47,6 ± 2,1	> 50,0
V	> 50,0	> 50,0	> 50,0

Примечание. III* − Солевая форма соединения III в виде метансульфоната.

 

Очевидно, что, несмотря на установленную противоопухолевую активность соединений I–III по отношению к клеткам ХМЛ К562, полученные данные не доказывают способность этих молекул к специфическим взаимодействиям с тирозинкиназой Bcr-Abl, предсказанную методами молекулярного моделирования. Более того, согласно этим данным, соединения I−III ингибируют рост клеток острого промиелоцитарного лейкоза HL-60, экспрессирующих онкогенный фузионный белок PML-RARalpha, который играет важную роль в патогенезе данного онкологического заболевания крови [47]. Это дает основание предполагать, что соединения I–III представляют собой мультитаргетные ингибиторы опухолевого роста, что, вероятно, может быть обусловлено одновременным присутствием в их составе фрагментов 2-ариламинопиримидина и изоксазола, производные которых, как было отмечено выше, часто встречаются в структурах молекул, ингибирующих пролиферацию различных типов опухолевых клеток [20, 22].

Следует отметить, что наблюдаемые различия в противоопухолевой активности соединений I−III по отношению к лейкозным клеткам крови K562, HL-60 и опухолевым клеткам эпителия шейки матки HeLa (табл. 4) могут быть обусловлены разной степенью комплементарности их структур структурам активных центров белков, экспрессируемых этими клетками и ответственных за опухолевый рост. Кроме того, эти клеточные линии выделены из различных видов опухолей и характеризуются различной экспрессией как поверхностных, так и внутриклеточных белков, а также реализуемыми сигнальными путями, что может служить еще одной причиной обнаруженной специфичности действия соединений I–III против опухолевых клеток крови K562 и HL-60. Безусловно, эти предположения, сделанные на основе результатов тестирования сконструированных гибридных молекул на моделях опухолевых клеток, должны быть проверены в экспериментах по исследованию механизма их действия с использованием in vitro моделей потенциальных белковых мишеней.

На рис. 6 приведены комплексы тирозинкиназы Bcr-Abl и ее мутантной формы T315I c соединениями I–III, которые, согласно полученным экспериментальным данным (табл. 4), обладают противоопухолевой активностью по отношению к миелоидным клеткам крови человека K562. Анализ данных рис. 6 и табл. 5 показывает, что эти соединения образуют широкую сеть межмолекулярных контактов, ответственных за стабилизацию комплексов лиганд/Bcr-Abl. В частности, соединение I формирует водородные связи с остатками M318 и D381 нативного фермента, играющими важную роль для проявления его каталитической активности [48–52]. Примечательно, что эти консервативные гидрофильные остатки участвуют в образовании водородных связей с иматинибом и нилотинибом, а также с рядом других известных ингибиторов тирозинкиназы Bcr-Abl [52]. Кроме водородных связей, соединение I образует 54 контакта Ван-дер-Ваальса с остатками белка, включая такие функционально значимые аминокислоты, как K271, E286, T315 и D381 (табл. 5; рис. 6) [48–52]. Как и в случае тирозинкиназы Bcr-Abl, при связывании с ее мутантной формой это соединение формирует многочисленные межмолекулярные взаимодействия, образуя водородную связь с остатком D381 и 36 контактов Ван-дер-Ваальса (табл. 5; рис. 6). Соединения II и III проявляют аналогичный механизм связывания с ферментом, основу которого формируют водородные связи и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия (табл. 5; рис. 6). Из анализа данных о межмолекулярных взаимодействиях, реализующихся в интерфейсе комплексов лиганд/Bcr-Abl, также следует, что важная роль в связывании принадлежит изоксазольному фрагменту, который участвует в образовании прямых межатомных контактов лигандов с тирозинкиназой Bcr-Abl. При этом атом кислорода изоксазольного кольца соединений I–III формирует водородные связи с аминогруппой основной цепи остатка M318 нативной тирозинкиназы (табл. 5; рис. 6). В случае мутантного фермента атомы кислорода и азота изоксазольного кольца соединений I и III соответственно образуют водородные связи с аминогруппой основной цепи остатка D381 (табл. 5; рис. 6). Полученные данные позволяют предполагать, что совместный вклад в стабилизацию комплексов лиганд/Bcr-Abl фармакофорных фрагментов 2-ариламинопиримидина и изоксазола способен обеспечить высокий потенциал ингибиторной активности сконструированных химерных молекул против тирозинкиназы Bcr-Abl и ее мутантной формы T315I.

 

Рис. 6. Комплексы соединений I–III с нативной и мутантной тирозинкиназой Bcr-Abl, построенные методом молекулярного докинга. Соединения представлены моделью «шарик-палочка-шарик». Отмечены остатки фермента, образующие межатомные контакты с лигандами. Остатки, участвующие в водородных связях, обозначены палочковой моделью. Водородные связи показаны красными пунктирными линиями. Проволочная модель использована для обозначения остатков тирозинкиназы Bcr-Abl, образующих контакты Ван-дер-Ваальса

 

Таблица 5. Межмолекулярные взаимодействия в структурных комплексах соединений I−III с тирозинкиназой Bcr-Abl и Bcr-Abl^T315I, построенных методом молекулярного докинга

Лиганд	Водородные связи1	Ван-дер-Ваальсовы контакты2	Катион–π-взаимодействие3, T-стэкинг4
Tирозинкиназа Bcr-Abl
I	О...*HN[M318] N...*HN[D381]	L248(10), A269(3), K271(1), E286(7), V289(2), M290(6), I293(1), V299(5), T315(3), F317(1), F359(1), L370(4), A380(3), D381(1), F382(6)	–
II	О...*HN[M318] N...*HN[D381]	L248(11), A269(3), E286(5), V289(2), M290(6), I293(2), V299(4), T315(2), F317(1), F359(2), L370(4), A380(3), D381(1), F382(6)	–
III	O...*HN[M318] N...*HN[D381]	L248(7), A269(3), K271(4), E286(5), V289(2), M290(2), V299(1), I313(2), T315(3), F317(1), F359(2), L370(2), A380(2), D381(3), F382(5)	–
Tирозинкиназа Bcr-AblT315I
I	O...*HN[D381]	A269(2), K271(1), E282(2), K285(4), E286(3), V289(3), M290(5), I293(3), L298(1), V299(2), I315(3), L354(4), F382(3)	H361 (катион-π)
II	NH...**O[E286]	L248(7), G249(2), Y253(1), A269(4), K271(1), V289(1), M290(3), I293(2), V299(3), I313(3), I315(5), L354(2), H361(1), L370(4), A380(2), D381(2), F382(6)	H361 (катион-π) Y253 (T-стэкинг) F382 (T-стэкинг)
III	N...*HN[D381]	A269(3), K271(1), E282(2), E286(3), V289(1), M290(4), I293(2), V299(1), I313(1), I315(6), D381(2), F382(3)	H361 (катион-π)

Примечания: 1 – Первыми указаны доноры или акцепторы водородной связи, принадлежащие молекуле лиганда, а вторыми – соответствующие атомы или функциональные группы остатков тирозинкиназы, приведенных в квадратных скобках в однобуквенном коде. Символом * отмечены атомы основной цепи белка; символом ** − атомы боковой цепи. 2 – Аминокислотные остатки тирозинкиназы, формирующие Ван-дер-Ваальсовы контакты с лигандами. В круглых скобках указано число контактов. 3 – Аминокислотные остатки тирозинкиназы, участвующие в катион-π-взаимодействиях с лигандами. 4 – Аминокислотные остатки тирозинкиназы, образующие Т-стэкинг с π-сопряженными системами лигандов.

 

Таким образом, совместный анализ данных молекулярного моделирования и биомедицинского тестирования in vitro позволил идентифицировать 3 амида замещенной изоксазол-3-карбоновой кислоты с фармакофорным фрагментом 2-ариламинопиримидина (соединения I–III; рис. 1), проявляющих ингибиторную активность против клеток линий K562 и HL-60 (табл. 4). При этом соединение I показало наибольшую эффективность нейтрализации этих клеток, и поэтому может рассматриваться в качестве приоритетной базовой структуры в исследованиях по созданию новых эффективных противоопухолевых средств. Эти исследования включают оптимизацию структур соединений-лидеров методами QSAR [53, 54], направленную на получение их аналогов с улучшенной противоопухолевой активностью и приемлемыми фармакологическими свойствами, химический синтез лигандов и биомедицинские испытания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе осуществлен дизайн пяти 2-ариламинопиримидиновых амидов изоксазол-3-карбоновой кислоты, проведена in silico оценка потенциальной ингибиторной активности этих соединений по отношению к тирозинкиназе Bcr-Abl и ее мутантной форме T315I, выполнен их синтез и тестирование на моделях опухолевых клеток in vitro. В результате совместного анализа расчетных и экспериментальных данных идентифицированы три соединения (лиганды I–III; рис. 1), проявляющие ингибиторную активность против миелоидных клеток линий K562 и HL-60. Показано, что соединение I проявляет наибольшую эффективность ингибирования роста этих клеток. Полученные данные позволяют предположить, что идентифицированные соединения могут служить основой для разработки новых эффективных лекарственных препаратов, способных ингибировать каталитическую активность тирозинкиназы Bcr-Abl путем блокирования ATP-связывающей полости фермента. Кроме того, соединения I−III могут быть использованы для создания многоцелевых ингибиторов протеинкиназ, что подтверждается многочисленными исследованиями [11, 15, 20, 23, 24, 55], согласно которым производные 2-ариламинопиримидина обладают высоким потенциалом в качестве кандидатов для разработки эффективных противоопухолевых агентов с различными механизмами действия. Наконец, эти молекулы могут рассматриваться в качестве перспективных базовых структур для разработки эффективных ингибиторов других онкогенных белков-мишеней. На это предположение указывают полученные нами данные об их противоопухолевой активности по отношению к линии клеток острого промиелоцитарного лейкоза (табл. 4), характеризующегося образованием аномального онкогенного фузионного белка PML-RARalpha [47]. В связи с этим одно из дальнейших направлений развития настоящей работы предполагает исследование механизма действия идентифицированных соединений на in vitro моделях потенциальных белковых мишеней.

Вклад авторов. Королева Е.В., Игнатович Ж.В. и Поткин В.И. выполнили дизайн соединений, спланировали и руководили экспериментами по их синтезу; Андрианов А.М. и Корноушенко Ю.В. провели вычислительные исследования и проанализировали данные компьютерного моделирования; Ермолинская А.Л. синтезировала соединения; Панибрат О.В. выполнила тестирование соединений на противоопухолевую активность; Андрианов А.М. написал первоначальный вариант рукописи; Андрианов А.М., Корноушенко Ю.В., Королева Е.В. и Поткин В.И. отредактировали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили статью.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Государственной программы научных исследований «Конвергенция-2025» Республики Беларусь (грант № 3.04.1).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

E. V. Koroleva

Institute of Chemistry of New Materials of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

A. L. Ermolinskaya

Institute of Chemistry of New Materials of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

Zh. V. Ignatovich

Institute of Chemistry of New Materials of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

Yu. V. Kornoushenko

Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

O. V. Panibrat

Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

V. I. Potkin

Institute of Physical-Organic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

A. M. Andrianov

Institute of Bioorganic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus

Author for correspondence.
Email: alexande.andriano@yandex.ru
Belarus, Minsk

References

Supplementary files