Current Methods of Molecular Modeling in the Development of Affine and Specific Agents Binding Proteins (Review)

全文:

Принятые сокращения: CDRs – Complementarity Determining Regions, вариабельные петли; MIP – molecularly imprinted polymers, полимерные молекулярные отпечатки; SELEX – систематическая эволюция лиганда путём экспоненциального обогащения.

ВВЕДЕНИЕ

С момента первого упоминания использования антител для распознавания белков в 1968 году наблюдался стремительный рост интереса к разработке аффинных и специфичных систем для диагностики, а затем терапии и других областей [1]. В 70–80-е годы XX века были разработаны технологии получения моноклональных антител, проведены исследования структуры иммуноглобулинов, получены химерные, гуманизированные и, позднее, полностью человеческие моноклональные антитела, в результате чего антитела стали одной из главных специфичных белок-связывающих систем в современной биологии, медицине и других областях [2]. Антитела применяются в качестве иммобилизирующих и детектирующих реактивов в диагностике, лекарств и средств их доставки, способов маркировки и окрашивания, исследовательских инструментов и др. [3–5].

Тем не менее даже современные моноклональные антитела не лишены недостатков, из-за чего спектр их разнообразия и области применения всё ещё остаются ограниченными. Это способствовало развитию альтернативных систем, способных с высокой эффективностью и специфичностью связываться с белками.

Необходимость оптимизации этих подходов, а также требования к направленной и рациональной разработке таких систем привели к широкому внедрению методов молекулярного моделирования на разных этапах их создания. Методы моделирования оказываются весьма эффективным способом исследования свойств аффинных белок-связывающих систем, а также способом повышения результативности и удешевления их разработки, улучшения параметров связывания и увеличения стабильности. Отдельные исследования показывают возможность рациональной разработки аффинных связывающих систем на основе структуры мишени. Данные методы используются на разных этапах создания белок-связывающих систем, начиная от этапа создания первичных библиотек мономеров и заканчивая этапами оптимизации систем и выяснения молекулярных механизмов связывания. При этом могут быть использованы как универсальные методы, такие как построение белков по гомологии, молекулярный докинг и молекулярная динамика, так и специализированные методы, оптимизированные для конкретного типа связывающих агентов.

В данном обзоре рассмотрены основные преимущества и недостатки известных белок-связывающих систем, основные экспериментальные подходы для их разработки и ограничения таких подходов. Отдельное внимание уделено применимости современных методов молекулярного моделирования к исследованию, оптимизации, рациональной разработке аффинных белок-связывающих систем как способа обхода ограничений экспериментальных подходов и оценке результатов, получающихся при моделировании.

БЕЛКОВЫЕ АФФИННЫЕ БЕЛОК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ

Антитела: структура, способы получения и применение антител. Антитела являются глобулярными белками, которые состоят из 4 полипептидных цепей, двух лёгких (50–60 кДа) и двух тяжёлых (100–120 кДа), соединённых дисульфидными связями. Антигенсвязывающие свойства обеспечиваются вариабельным доменом, образованным фрагментом тяжёлой и лёгкой цепей (рис. 1, а). Вариабельный домен имеет консервативные зоны, отвечающие за поддержание структуры сайта связывания, и вариабельные петли, или CDRs (Complementarity Determining Regions), которые обеспечивают взаимодействие с антигеном (рис. 1, б). Антитела вырабатываются плазматическими клетками иммунной системы, а также являются компонентами рецепторов B-лимфоцитов [6].

 

Рис. 1. Структура иммуноглобулина G (PDB: 1HZH) (а) и вариабельных петель (CDRs) в составе Fv-домена (б)

 

К первому практическому использованию антител как аффинных и специфичных систем можно отнести применение Э. фон Берингом и С. Китасато в 1890 году сыворотки с поликлональными антителами для лечения дифтерии у животных. Антитела стали наиболее популярными антитоксинами, и поликлональные сыворотки используют по сей день. Огромным толчком в исследованиях и применении антител стало изобретение в 1975 году Ж. Келером и С. Мильштейном гибридомной технологии получения моноклональных антител. Моноклональные антитела позволили создавать уникальные воспроизводимые методики выделения, определения наличия и концентрации белков, а также мечения клеток по их антигенному составу. Начиная с 1985 года моноклональные антитела стали использовать в лекарственной терапии. В настоящее время они являются основными аффинными и специфичными системами, связывающимися с белками [7].

Наиболее часто используемым методом разработки моноклональных антител является гибридомная технология: метод слияния генетически модифицированных миеломных клеток с B-лимфоцитами, в результате которого получаются клетки, способные к постоянному выделению антител, связывающих целевую молекулу белка. С точки зрения затрат на разработку и производство антител гибридомная технология является слабоавтоматизируемой и ресурсозатратной, в том числе из-за необходимости постоянного поддержания жизнедеятельности клеточных культур в биореакторах, а также необходимости непрерывного контроля генетических изменений в процессе размножения клеток [8].

Более универсальным и менее затратным является альтернативный способ получения антител с использованием фаговых дисплеев, когда ген вариабельного домена антител встраивается в геном бактериофага (например, M13), после чего производится заражение бактерии, и фрагмент антитела экспрессируется как компонент оболочки вируса. Связываться с антигеном способны только те бактериофаги, в оболочке которых располагается фрагмент антитела, аффинный к белку-мишени. С помощью смеси нецелевых белков удаляются бактериофаги, которые показывают низкую специфичность. По этим двум принципам происходит отбор искомого вариабельного домена, который впоследствии может подвергаться модификациям для увеличения аффинности и специфичности путём направленного мутагенеза и повторного отбора [9].

Несмотря на существование двух методов получения моноклональных антител, экономические затраты на разработку и, что более значимо, на производство антител являются существенными, так как в обоих случаях необходимо использование биореакторов. В связи с этим цены на антитела могут быть высокими, а их применение в различных сферах – ограниченным. В силу высокой сложности контроля воспроизводимости от партии к партии такие характеристики связывания, как аффинность, специфичность и устойчивость, часто отличаются от заявленных производителем [10].

Методы молекулярного моделирования в разработке и исследовании антител. В целях оптимизации структуры и направленной разработки антител для повышения аффинности, специфичности и улучшения других свойств в последние годы активно используются методы молекулярного моделирования.

Моделирование структуры антител. В структуре вариабельного домена антител пять из шести гипервариабельных участков CDRs имеют ограниченное количество возможных конформаций, то есть имеют структуру, незначительно различающуюся (RMSD около 0,7 Å) между различными по специфичности и аффинности антителами [11, 12]. Анализ известных пространственных структур антител показал, что существует восемь основных шаблонов конформаций их вариабельной части: два для структуры лёгкой и тяжёлой цепей, пять для гипервариабельных петель в составе CDRs (L1, L2, L3, H1, H2), и один используется как основа для моделирования H3-петли, которая может значительно варьировать между различными антителами (рис. 1, б). На основе комбинирования этих основных конформаций петель могут быть спрогнозированы структуры большинства вариабельных фрагментов антител. Для пяти из шести петель в составе CDRs моделирование в основном происходит путём построения по гомологии. Основной проблемой является моделирование петли H3 и относительной ориентации цепей H и L. Поскольку H3 является частью интерфейса HL, моделирование обеих этих областей является взаимозависимым [13]. Петля H3 строится с использованием методов ab initio. В этих методах проводится или поиск похожих петель в известных пространственных структурах белков, или последовательное построение этой петли путём добавления аминокислотных остатков с последующей оптимизацией структуры построенной петли методами молекулярной механики и динамики. Предложены методы, основанные на стохастических подходах, таких как алгоритм Монте-Карло, в которых создаётся набор различных геометрий, после чего происходит отбор наиболее стабильных с помощью оценки энергии. Далее, происходит минимизация энергии структуры с помощью оптимизации геометрии и выбирается наиболее энергетически выгодная структура [14]. Консервативные части антитела строятся по гомологии с известными пространственными структурами антител с помощью таких программ, как Modeller, I-TASSER и Rosetta [15–18]. На основе данных подходов были разработаны несколько программных продуктов, как коммерческих (продукты компаний «Schrödinger Inc.», «Chemical Computer Group» и «Accelrys Inc.»), так и свободно доступных (PIGS, WAM, SAbPred) [17, 19–21]. Комбинирование методов построения по гомологии и ab initio лежит в основе пакета программ RosettaAntibody, который показывал высокую точность соответствия смоделированных и определённых в эксперименте структур [22, 23].

Наиболее значимым следствием разработанных методов для моделирования антигенсвязывающих участков антител стала возможность изменения их аффинности путём внесения точечных замен и быстрой оценки связывания в экспериментах in silico [24, 25]. В работе Kiyoshi et al. было смоделировано внесение 1178 точечных мутаций, которые включали поочередную замену каждого из 62 аминокислотных остатков в составе CDRs на соответствующие 19 остатков в структуре антитела 11K2, связывающегося с хемокином MCP-1. В результате отбора in silico было показано, что двенадцать из данных замен приводят к повышению аффинности антитела. В последующей проверке с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса было подтверждено, что при внесении пяти из двенадцати отобранных замен аффинность увеличивается. Для одного из мутантов было показано увеличение аффинности в 4,7 раза по сравнению с антителом дикого типа. Авторы данного исследования отметили, что наибольшее значение для повышения аффинности антител имели заряженные остатки во фрагменте лёгкой цепи вариабельного домена [25]. Эти методы показали эффективность в выявлении аминокислотных остатков, наиболее важных для связывания.

Моделирование структуры комплекса антиген-антитело. В упомянутой выше работе улучшение было проведено для антитела, в случае которого структура комплекса антитело-антиген была известна [25]. На практике для большинства новых или доступных на рынке антител пространственная структура комплекса неизвестна [26]. В связи с этим большое значение имеет возможность правильного определения сайта связывания антитела на поверхности белка-мишени. Для решения этой задачи был разработан ряд экспериментальных и компьютерных подходов [27]. В методах in silico в качестве входных данных используются как пространственные структуры белков-мишеней, так и их аминокислотные последовательности. Предсказание линейных эпитопов по последовательностям показывает хорошие результаты, но среди всех эпитопов они составляют только 10% [27, 28]. Попытки предсказания конформационных эпитопов при анализе аминокислотных последовательностей показали низкую эффективность, так как трудно учесть пространственное взаимодействие различных участков первичной последовательности белков [29–31]. Поэтому наиболее распространённым является метод высокомолекулярного (белок-белкового) докинга, когда два белка на основе оценки электростатических и стерических соответствий стыкуются между собой в жёсткой форме. Так как в процессе такого взаимодействия должна происходить взаимно индуцированная подстройка поверхностей, жёсткий белок-белковый докинг оказывается малоинформативным. В связи с этим были разработаны подходы к моделированию белковых комплексов с быстрой взаимной оптимизацией геометрии [32, 33]. RosettaFold производит быстрое подстраивание геометрии путём минимизации энергии с помощью алгоритма Монте-Карло. На основе метода RosettaFold и RosettaAntibody был разработан алгоритм SnugDock, специально созданный под моделирование комплексов антитело-антиген и способный производить быструю оптимизацию Монте-Карло для получения более качественных моделей [34]. Было отмечено, что близкий к нативному комплекс антитело-антиген обычно оказывается значительно более энергетически выгодным, в связи с чем возникает довольно явный глобальный энергетический минимум для моделируемой системы и отбор происходит более эффективно [33, 35].

Тем не менее явным недостатком данного подхода остаётся его низкая точность. В моделировании комплексов этап оптимизации является приближённым, а функция оценки энергии – упрощённой, что приводит к низкой корреляции между экспериментально полученными данными и предсказаниями [36]. Поэтому результаты докинга часто дополнительно оценивают методом молекулярной динамики. Так, например, в работе по моделированию комплексов антител с бета-амилоидом после проведения докинга кренезумаба (гуманизированное антитело против 1–40 и 1–42 бета-амилоида, которое разрабатывалось в качестве лекарства от болезни Альцгеймера) на поверхность бета-амилоида было получено около 200 моделей комплексов, которые были разделены на восемь кластеров. Далее, для представителей кластеров проводилось несколько этапов молекулярной динамики длительностью 200 нс для оптимизации структуры комплекса, анализа формирования связей и расчёта энергии взаимодействия. Было обнаружено два комплекса, которые остаются стабильными и объясняют экспериментальные данные [35].

Метод Монте-Карло является стохастическим, и его предсказательная сила зависит от количества итераций, при увеличении числа которых растёт количество возможных вариантов положений, в результате чего возникает трудно решаемая проблема отбора наиболее вероятных структур. Для этих задач применяются специальные алгоритмы увеличения конформационной выборки для уменьшения случайных энергетических флуктуаций, переоценки энергий комплекса с помощью повышения значимости учёта электростатической энергии и энергии десольватации, а также кластеризация комплексов. Примерами программ, где были реализованы данные алгоритмы, являются FiberDock, ZRANK, pyDock [37–40].

Помимо методов, основанных на МонтеКарло, были разработаны подходы прямого поиска взаимодействующих поверхностей за счёт быстрого преобразования Фурье. Алгоритм может производить поиск соответствий между белковыми поверхностями, переводя их в частотное представление. Таким образом, находится гораздо меньше возможных мест связывания и взаимных конформаций за значительно меньшее время, в том числе благодаря возможности вычислений на графических процессорах. Однако наиболее значимым фактором в данном алгоритме является не физико-химическое соответствие, а геометрическое, что существенно ограничивает метод и требует дополнительных этапов моделирования [41].

Существуют также методы, основанные на предсказании энергии взаимодействия между двумя белками, в том числе комплекса антитело– антиген, которые оптимизированы для поиска связи между структурой взаимодействующих поверхностей и экспериментально определённой аффинностью. Недавно была показана возможность использования метода пертурбации свободной энергии (free energy perturbation, FEP; метод, основанный на вычислении разницы в изменении свободной энергии комплекса при конвертации одной молекулы лиганда (или аминокислотного остатка) в другую за счёт мелких изменений в структуре лиганда с оптимизацией каждой промежуточной структуры комплекса в процессе молекулярной динамики) для предсказания влияния точечных мутаций на аффинность и стабильность комплекса антиген–антитело [42]. Была также разработана программа DDMut-PPI, которая основана на методах глубокого обучения и позволяет предсказывать изменение свободной энергии при связывании двух белков с большей производительностью [43]. С увеличением количества структур комплексов в базе данных PDB также стала возможной разработка частотных матриц, в которых было определено, что полярные и заряженные аминокислотные остатки на границе взаимодействия являются предпочтительными, и по данному критерию может производиться быстрый отбор потенциальных областей взаимодействия. Таким образом, может происходить дополнительный отбор комплексов по их физико-химическим свойствам, что значительно увеличивает вероятность обнаружения правильной геометрии комплекса [44, 45].

Были разработаны и более универсальные комбинированные подходы. Так, построение структуры антитела по гомологии, оптимизация комплекса и применение сложных физико-химических оценочных функций было использовано в разработанной программе OptMAVEn-2.0 в целях de novo моделирования вариабельных фрагментов антител для взаимодействия с конкретным эпитопом на поверхности белкового антигена. В данном методе реализован как белок-белковый докинг, оптимизация позы, оптимизация положения боковых радикалов, так и подбор последовательности, построение статистических матриц и другое [46]. В этом методе был использован подход по имитации природного процесса V(D)J рекомбинации генов путём конструирования антител из структурных блоков MAP (modular Ab parts) с последующей оптимизацией структуры для увеличения аффинности. С его помощью было сконструировано пять антител для пептидов, которые были протестированы экспериментально, показали правильную укладку белковой глобулы и стабильность в растворе. Три из них имели аффинность в наномолярном диапазоне [47]. Этот подход был также использован для конструирования двух антител для связывания эпитопов на оболочечном белке вируса Зика [46].

Интересной перспективой развития методов моделирования антител является возможность полного de novo конструирования антител против заданного эпитопа на основе вычислительных моделей. Был разработан подход, в рамках которого была собрана библиотека коротких последовательностей-затравок, способных связываться с участками поверхности белка-мишени. Данные последовательности докировались на поверхность белка по методу «горячих точек» (hot spots, метод докирования библиотеки коротких фрагментов и выбора структур, вносящих наибольший вклад во взаимодействие с поверхностью белка; также «горячими точками» часто называют аминокислотные остатки, вносящие существенный вклад в энергию связывания), затем подбирался общий каркас антитела, способный связать полученные участки между собой. С использованием достаточно разнородной библиотеки подобный подход может быть использован для направленной разработки антител под целевые эпитопы, однако в оригинальной работе его применение было ограничено эпитопами, для которых уже известны структуры комплексов с антителом [48].

Комбинирование методов анализа статистики взаимодействия комплексов и построения по гомологии особенно применимо в методах моделирования, основанных на глубоком обучении. Основанная на модели трансформера нейронная сеть AlphaFold2, а также её дополнение в виде AlphaFold-Multimer были применены для моделирования комплексов антитело–антиген из первичной последовательности. Тем не менее результат моделирования всё ещё оставался на уровне 30% успешного воспроизведения геометрии комплекса, полученного из экспериментов [49].

Различные модели глубокого обучения, основанные на графовых нейронных сетях, языковых моделях и др., применялись для моделирования антител под конкретный эпитоп [50–52]. Тем не менее ограничениями данных методов оставались обучающие выборки, полученные из PDB, в связи с чем они рассматривали очень ограниченное количество как структур эпитопов, так и структур самих антигенсвязывающих доменов.

Методы, основанные на глубоком обучении, в настоящее время активно развиваются. Они хорошо аппроксимируют скрытые закономерности, поэтому могут показывать высокую точность построения моделей, превосходя методы построения по гомологии, такие как Modeller и I-Tasser [53]. Однако для качественного обучения таких систем требуется большая обучающая выборка, что пока труднодостижимо. Малое количество экспериментально определённых структур обусловливает то, что данные методы показывают всё ещё не очень высокую точность [49].

Схема используемых методов разработки и оптимизации моноклональных антител показана на рис. 2.

 

Рис. 2. Стратегии применения методов молекулярного моделирования в разработке и оптимизации моноклональных антител

 

В дополнение к методам конструирования структуры антитела и его комплекса с антигеном были разработаны разнообразные подходы для предсказания склонности антител к агрегации, иммуногенности антител, фармакокинетического клиренса [54–56].

Несмотря на значительное количество разнообразных методов моделирования взаимодействия комплексов антитело–антиген, большинство из них имеют серьёзное ограничение, связанное с отсутствием учёта растворителя, играющего важную роль во взаимодействии антител с антигенами. Для решения этой проблемы наиболее эффективным методом всё ещё остаётся длительная молекулярная динамика в условиях явного растворителя, требующая большого количества вычислений. Возможным вариантом решения этой проблемы может быть применение методов ускоренной динамики, в том числе основанных на методах глубокого обучения [57].

Фрагменты антител. Структура и методы разработки фрагментов антител. Как отмечалось выше, разработка и производство антител является дорогостоящим процессом, требующим постоянного контроля. В связывании антител с мишенью задействован только вариабельный домен антитела, поэтому были разработаны укороченные варианты антител, сохраняющие способность связываться с мишенью. С помощью методов генной инженерии были получены разнообразные формы белок-связывающих фрагментов антител, такие как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), отдельный антигенсвязывающий фрагмент (Fab′), минитела, нанотела и др. [58–60]. Сравнение структуры антител и их гомологов показано на рис. 3.

 

Рис. 3. Сравнение структуры антител и примеров фрагментов антител

 

В основе разработки каждого из перечисленных производных моноклональных антител лежат технологии гибридомы или фагового дисплея, позволяющие получать аффинные и специфичные системы и увеличивать аффинность в процессе отбора [61, 62]. С помощью методов генной инженерии из участков генов вырезаются области, кодирующие стабильные домены антитела, отвечающие за удержание структуры и связывание с Fc-рецепторами иммунной системы, и создаются линкеры, соединяющие отдельные участки лёгкой и тяжёлой цепи вариабельного фрагмента иммуноглобулинов.

В случае нанотел основой являются иммуноглобулины, которые имеют только тяжёлую цепь в вариабельном домене, за счёт чего антигенсвязывающий участок оказывается более простым. Подобные антитела встречаются у животных, относящихся к семейству верблюдовых (Camelidae). С уменьшением размера структуры уменьшается стоимость и сложность её производства, возрастает проницаемость в ткани, что особенно важно для терапевтического применения данных систем, но при этом существенно снижается стабильность антигенсвязывающего участка, что влечёт за собой ухудшение параметров связывания [58].

Для решения проблем, связанных со снижением аффинности и специфичности, были разработаны методы созревания на фаговом или дрожжевом дисплее. В этих методах в последовательности, кодирующие антигенсвязывающие участки, вносятся одиночные замены, за счёт чего получается разнообразная выборка, из которой затем отбираются наиболее аффинные и специфичные структуры. В силу меньшей стоимости и трудоёмкости работы с фрагментами антител данный подход оказывается весьма эффективным [63].

Методы молекулярного моделирования в разработке и исследовании фрагментов антител. В силу меньших размеров фрагментов методы молекулярного моделирования, применяемые к разработке и оптимизации целых антител, оказываются более эффективными [64, 65].

Использование небольших участков антител позволяет разрабатывать биспецифические связывающие системы, состоящие из фрагментов двух разных антител, соединённых линкером. Методы молекулярного моделирования были успешно применены для создания биспецифических одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), ингибирующих образование комплекса Т-клеточного рецептора (TCR) с главным комплексом гистосовместимости (MHC-II) в присутствии стафилококкового энтеротоксина B (SEB). Важнейшим инструментом моделирования в данной работе оказалась молекулярная динамика, в которой на микросекундной траектории был показан механизм аллостерического ингибирования образования комплекса SEB–TCR [66].

В данной работе были использованы вариабельные домены известных антител для формирования биспецифической системы, однако для моделирования новых белок-связывающих фрагментов антител необходимы методы предсказания их структуры. Инструменты, использующиеся для моделирования полных антител, оказываются малоэффективными в данной задаче, так как подвижность фрагментов антител из-за отсутствия стабильных доменов изменяется [67]. Для подобных задач были разработаны специальные программы, такие как NanoNet. Данная модель глубокого обучения способна с высокой точностью и производительностью (примерно 1 млн структур за четыре часа на стандартном центральном процессорном устройстве) моделировать структуры нанотел, имея на входе информацию только об их аминокислотной последовательности. Подобные модели в сочетании с гибким белок-белковым докингом могут выступать в качестве инструментов виртуального скрининга для поиска новых белок-связывающих аффинных и специфичных систем [68].

Таким образом, несмотря на меньшие размеры фрагментов антител в сравнении с полными моноклональными антителами, их моделирование сталкивается с теми же трудностями и требует значительного количества вычислений.

Антителомиметики. Структуры и методы разработки белковых антителомиметиков. Антитела и их фрагменты являются наиболее широко используемыми белковыми аффинными и специфичными белок-связывающими системами. Однако они имеют ряд свойств, ограничивающих их применение. Так, высокая стоимость производства и низкая стабильность, которая влечёт за собой проблемы с агрегацией, иммуногенностью, высокой стоимостью хранения и логистикой, оказываются основными лимитирующими факторами для расширения сфер применения антител. Во многом это связано с нативной структурой антител, не предназначенной изначально для существования вне живых систем. Несмотря на малые размеры фрагментов антител, их структура всё ещё не является оптимальной и включает достаточно большие участки, функция которых ограничена только в поддержании структуры сайта связывания [69].

По этой причине возникла идея разработки белок-связывающих систем негомологичных антител, которые принято называть антителомиметиками (другое используемое название – Non-Immunoglobin Epitope Binders). Конструирование более простых белковых структур, обладающих повышенной аффинностью и специфичностью, позволяет избавиться от ограничений антител, в то же время сохранив их полезные качества.

Антителомиметики белковой природы в своей структуре содержат простые жёсткие каркасы из альфа-спиралей или бета-слоёв, в то время как их белок-связывающие участки обычно являются свободными петлями [70]. Примеры белковых каркасов для антителомиметиков показаны на рис. 4. Для их разработки обычно используются методы сайт-направленного или случайного мутагенеза, а производятся они с использованием простых бактериальных реакторов, показывающих более высокий выход продукта в сравнении с антителами [63].

 

Рис. 4. Примеры белковых каркасов антителомиметиков белковой природы. В скобках приведены коды PDB

 

Наиболее общим способом разработки антителомиметиков является цикл направленной эволюции с последующим отбором кандидатов. Так, первичная библиотека ДНК, кодирующая гомологичные белковые структуры, подвергается ПЦР с высокой вероятностью ошибок чтения, что достигается путём введения солей марганца в реакционную систему. В результате значительно возрастает разнообразие аминокислотных последовательностей относительно исходной библиотеки. Далее, с использованием метода фагового дисплея производится отбор наиболее перспективных последовательностей, имеющих повышенную аффинность и специфичность, после чего процесс повторяется [71]. Таким образом, за ограниченное число циклов может быть получена высокоаффинная и специфичная белок-свызывающая система с высокой стабильностью.

Однако у данного метода существуют ограничения, которые препятствуют масштабному выходу на рынок антителомиметиков. Так, при создании антителомиметиков белковой природы возникает сложность в поиске белкового каркаса. Несмотря на большое разнообразие уже известных каркасов, таких как аффитела (B-домен стафилококкового белка А), аднектины (внеклеточный домен человеческого фибронектина III), аффитины (варианты ДНК-связывающего белка Sac7d) и др., каждый белковый каркас имеет свои недостатки, а поиск новых ограничен возможностью расшифровки пространственной структуры белков. Поскольку большинство данных белков имеет чужеродную для организма структуру, они оказываются иммуногенными, что ограничивает их применение in vivo. Также из-за отсутствия Fc-фрагментов они не имеют эффекторных функций [63]. Таким образом, хотя антителомиметики белковой природы лишены большинства недостатков антител, их количество и области применения на данный момент ограничены.

Методы молекулярного моделирования в исследовании и разработке белковых антителомиметиков. Использование методов молекулярного моделирования позволяет решать ряд наиболее важных проблем при разработке белковых антителомиметиков. Каркасная структура антителомиметиков обычно представляет собой стабильный водорастворимый фрагмент известных белков, которые могут принимать правильную конформацию в бактериальных клетках. Это упрощает их поиск, так как данные фрагменты преимущественно состоят из гидрофильных аминокислотных остатков с низким содержанием цистеинов и др. [72]. Можно статистически выделить ограниченный состав аминокислот, которые могут быть использованы для формирования структуры, обладающей заданными свойствами растворимости, pH-чувствительности и т.д. без ухудшения параметров связывания. В результате могут быть получены белки, структура которых является стабильной в широком диапазоне температур и кислотности. Для предсказания пространственной структуры таких белков могут использоваться программы AlphaFold2 и RosettaFold. Однако при этом остаётся неясной точность предсказания этими программами, поскольку они в большей степени обучены на гомологичных структурах [73]. Возможным решением этой проблемы может быть применение диффузионных моделей глубокого обучения, таких как AlphaFold3 и Chroma, способных предсказывать структуры белков на основе желаемых параметров [74, 75]. Благодаря свойству диффузионных моделей производить маленькие шаги в процессе генерации, вводимые ограничения могут в конечном итоге направлять моделирования в сторону нужных свойств. Результаты предсказаний Chroma, проверенные в эксперименте, показали незначительное различие в структурах (RMSD около 1 Å). Так как Chroma обладает субквадратичной вычислительной сложностью от O(N) до O(Nlog[N]), данный инструмент может оказаться очень полезным для разработки каркасных структур для антителомиметиков белковой природы [75]. Серьёзным ограничением диффузионных моделей являются так называемые «галлюцинации», то есть способность данных методов создавать нереалистичные структуры и связи, противоречащие физическим свойствам [76]. По этой причине требуется серьёзная экспертная оценка результатов моделирования.

Однако методы моделирования структуры не решают проблему потенциального иммунного ответа на полученные белковые структуры. На основе данных протеомики были созданы базы данных, такие как SEDB, Epitome, IEDB, AntiJen и Bcipep, в которых хранится информация об эпитопах, распознаваемых T-, B-клеточными рецепторами и антителами, а также встраивающихся в MHC [77–81]. Данная информация может помочь в установлении потенциальных эпитопов и их замене на этапе проектирования белковых каркасов, что может снизить их потенциальную иммуногенность.

Несмотря на меньший размер и низкую структурную сложность антителомиметиков по сравнению с антителами, в настоящее время существует мало примеров применения методов молекулярного моделирования для их разработки. Основным подходом при de novo дизайне белковых антителомиметиков является метод «горячих точек», сочетающий в себе докинг потенциально связывающихся пептидов и последующий подбор каркасов [82]. На основе данного метода были разработаны системы, аффинно связывающие консервативные участки гемагглютинина вируса гриппа (HA). В результате моделирования были сконструированы два высокоаффинных белка, после чего с помощью рентгеноструктурного анализа была проанализирована структура комплекса гемагглютинина с антителомиметиком, имеющим наилучшие показатели аффинности. В результате было показано, что предсказанная структура комплекса очень близка к экспериментально определённой [83].

Комбинация различных подходов, в том числе высокомолекулярного гибкого докинга, производительной молекулярной динамики, методов глубокого обучения в предсказании пространственных структур и методов вычисления иммуногенности способна в значительной степени усовершенствовать существующие и привести к разработке новых белковых антителомиметиков, имеющих ряд преимуществ и лишённых недостатков моноклональных антител и их производных.

НЕБЕЛКОВЫЕ АФФИННЫЕ БЕЛОК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СИСТЕМЫ

Аптамеры. Структура и применение аптамеров. Аффинные системы белковой природы имеют недостатки, связанные со стоимостью производства, сложностью хранения и логистики, иммуногенностью и др. Это стимулировало поиск белок-связывающих систем небелковой природы. Одними из наиболее перспективных из них оказались аптамеры.

Аптамеры – это короткие одноцепочечные молекулы ДНК, РНК или синтетических нуклеиновых кислот обычно длиной от 20 до 60 нуклеотидов, обладающие высокой аффинностью и специфичностью для взаимодействия с высоко- и низкомолекулярными мишенями [84]. Аптамеры были независимо открыты двумя группами в 1990 году как результат процесса, который получил название SELEX (систематическая эволюция лиганда путём экспоненциального обогащения) [84, 85]. Позднее аптамеры были найдены в природе в составе рибопереключателей бактерий [86].

Идея использовать нуклеиновые кислоты для распознавания белковых мишеней возникла в результате исследований вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Было показано, что трансактивационный регулирующий элемент (TAR), содержащий последовательности РНК, может ингибировать репликацию ВИЧ за счёт связывания с вирусным белком Tat с высокой аффинностью и специфичностью [87]. Несмотря на то что аптамеры совершенно не похожи на антитела, считается, что они могут конкурировать с антителами как в диагностическом, так и в терапевтическом применениях [88]. Хотя аптамеры распознают и связывают мишени так же, как и антитела, они имеют ряд преимуществ, таких как более короткое время и низкая стоимость производства, более лёгкая модифицируемость, лучшая термическая и химическая стабильность, меньший размер и низкая иммуногенность [89].

Благодаря конкурентным преимуществам в отношении антител аптамеры нашли применение в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии, а также диагностики и терапии. Одной из перспективных областей исследований, основанных на аптамерах, является область оптических сенсоров. Многочисленные исследования показали, что флуоресцентные красители, присоединённые к конформационно гибким областям аптамера, могут давать оптический сигнал в ответ на связывание с лигандом [90]. На рынке тем не менее аптамеры представлены в незначительном количестве в сравнении с антителами, что связано в первую очередь с отсутствием острой необходимости в перестройке инфраструктуры, которая является экономически затратным и на данный момент нецелесообразным процессом для большинства направлений [91].

Множество аптамеров, созданных для терапевтических целей, проходят клинические испытания или уже выведены на рынок. Среди них препараты для лечения возрастной макулодистрофии, нарушения свёртываемости крови, рака, воспалительных процессов и др. [89, 92].

Помимо использования в качестве лекарственных средств, аптамеры могут быть использованы для адресной доставки лекарств в клетки человека для повышения эффективности препарата и снижения побочных эффектов [93]. Человеческий простатический специфический мембранный антиген (PSMA), трансмембранный белок, ассоциированный с раком простаты, который сверхэкспрессируется на поверхности опухолей, стал первой модельной системой для доставки лекарств на основе аптамеров [94]. Биспецифические аптамеры против gp120 и рецептора CD4 доставляют действующее вещество на основе малой интерферирующей РНК, подавляя активность ВИЧ in vitro [95].

Способы разработки и получения аптамеров. Стандартный метод создания аптамеров, SELEX, является аналогом цикла направленной эволюции с последующим отбором кандидатов, способных связываться с белками, но вместо фагового дисплея и экспрессии внутри бактериальных клеток используется инкубация in vitro и ПЦР. В процессе SELEX интересующая мишень сначала инкубируется с набором из ~109–1011 одноцепочечных случайных олигонуклеотидов, называемым первичной библиотекой. Олигонуклеотиды в библиотеке SELEX обычно состоят из 40–100 нуклеотидов, что обусловлено ограничениями химического синтеза, имеют случайную область в середине и общие последовательности на обоих концах для посадки праймеров. После инкубации первичной библиотеки с мишенью несвязанные олигонуклеотиды удаляются, а комплекс аптамер–белок разделяется. Освободившиеся последовательности ДНК амплифицируют методом ПЦР с повышенным мутагенезом за счёт введения солей марганца. В зависимости от задачи в ходе стандартного SELEX обычно проводится несколько циклов (повторов) процедуры [85]. Потенциальные аптамеры, полученные в результате нескольких раундов отбора, секвенируются, а параметры их связывания с мишенью оцениваются такими методами, как поверхностный плазмонный резонанс или изотермальная калориметрия. Для обогащения аптамеров с высоким сродством к мишени обычно проводится до двадцати раундов отбора [96].

Традиционный SELEX – это основной инструмент генерации аптамеров, однако он не лишён недостатков. Первичная библиотека должна содержать как можно большее разнообразие структур, в то же время в ней должны отсутствовать двухцепочечные нуклеиновые кислоты, а также одноцепочечные линейные структуры, не способные обеспечить надёжную пространственную укладку. Задача поиска оптимальной первичной библиотеки до сих пор не решена [97]. Обычно для повышения её разнообразия вводится большое количество структур с высокой долей GC-пар. Было показано, что повышение доли GC-пар первичной библиотеки приводит к большей сложности пространственных структур, вследствие чего наблюдается большее разнообразие потенциальных аптамеров, а также повышается их средняя аффинность [98].

Другим подходом для увеличения разнообразия первичной библиотеки является подход компании «Soma Logic» (дочерняя компания «Standard BioTools»). В первичной библиотеке компании, используемой для производства специальных модифицированных аптамеров, называемых SOMAмерами, содержится большое количество структур, в составе которых тимины заменены на С5′-этинил-2′-дезоксиуридины. В процессе SELEX к данным остаткам присоединяются боковые радикалы аминокислот или другие модификации, расширяющие свойства получаемых аптамеров [99]. Тем не менее явными ограничениями данного метода являются повышенная стоимость и возможность введения только одной химической модификации в структуру SOMAмера.

Процесс ПЦР, с помощью которого происходит обогащение при SELEX, является неидеальным. В силу большого разнообразия вторичных структур в первичной библиотеке и большей скорости синтеза коротких последовательностей происходит сдвиг, который может приводить к чрезмерному обогащению библиотеки структурами не с максимальным соответствием требуемым параметрам, а максимально выгодными для реакции полимеризации. Для решения данных проблем обычно применяется эмульсионная ПЦР, в которой каждая отдельная структура копируется в микросомах, таким образом, не конкурируя за активный центр полимеразы [100].

Существует большое количество вариаций оптимизации процесса SELEX, однако в настоящее время его эффективность всё ещё остаётся на уровне 30% вероятности обнаружения требуемого аптамера [101].

Одним из важных ограничений аптамеров в сравнении с антителами является отсутствие гидрофобных свойств в структурах природных нуклеиновых кислот. Одним из решений являются упомянутые выше SOMAмеры, к которым, в частности, могут быть добавлены боковые радикалы гидрофобных аминокислот, например, бензильный радикал (рис. 5, а). Однако данная модификация является трудоёмкой и не универсальной, так как полученные аптамеры не копируются напрямую в ПЦР, и требуются дополнительные стадии. Более перспективной является возможность добавления синтетической пары оснований, такой как dNaM-d5SICS (рис. 5, а). За счёт полиароматической углеводородной группы данная пара оснований оказывается гидрофобной, в то же время сохраняется способность её комплементарного воспроизведения в ПЦР за счёт использования модифицированных ДНК-полимераз [102]. Тем не менее добавление новой пары оснований в первичную библиотеку для SELEX требует повышения разнообразия и значительно увеличивает стоимость процесса.

 

Рис. 5. Модификации нуклеиновых кислот для увеличения аффинности аптамеров и их устойчивости к действию нуклеаз. а – Модификации оснований для добавления свойства гидрофобности. б – Модификации для увеличения устойчивости к аутодеградации и действию нуклеаз. Буква B отражает любое из оснований. 2′-амино-(I), 2′-фтор-(II), 2′-О-метил-дезоксирибоза (III), 2′-дезокси-2′-фтор-D-арабинонуклеиновая кислота (IV), закрытая нуклеиновая кислота (Locked Nucleic acid, LNA) (V) и модификации фосфатов (VI, VII)

 

Другим ограничением аптамеров при их использовании в качестве терапевтических средств, в отличие от антител, является отсутствие у них эффекторной функции. Был предложен метод последовательного сшивания свободных концов двух аптамеров, один из которых связывается с целевым белком, а второй связывается с FcRγIII. Таким образом, был получен эффекторный аптамер, способный вызывать иммунный ответ в результате связывания с белком-мишенью [103].

Так как аптамеры являются короткими олигонуклеотидами, они подвержены деградации под действием различных факторов. Аптамеры на основе молекул РНК являются крайне нестабильными, так как подвержены аутодеградации за счёт образования промежуточных связей 2′-гидроксильной группы с фосфатом, а также из-за высокой степени контаминации окружающей среды рибонуклеазами, катализирующими расщепление РНК [104, 105]. С точки зрения стабильности ДНК-аптамеры оказываются более практичными, тем не менее они также могут деградировать под действием дезоксирибонуклеаз in vivo. Было разработано множество модификаций аптамеров, способных препятствовать и аутодеградации, и действию различных нуклеаз (рис. 5, б). Изменение 2′-группы на амино-(I), фтор-(II) или О-метильную группу (III) препятствует аутодеградации, а также не позволяет нуклеазам производить расщепление. Однако данная модификация значительно повышает подвижность нуклеиновых кислот, сопоставимую с подвижностью РНК, и, следовательно, может влиять на структуру получаемой молекулы. 2′-дезокси-2′-фтор-D-арабинонуклеиновая кислота (IV) и закрытая нуклеиновая кислота (Locked Nucleic acid, LNA) (V) используются в аптамерах, так как значительно повышают устойчивость к нуклеазам, имея подвижность молекулы ДНК [106]. Более эффективным в данном случае оказывается замещение кислорода в остатке фосфорной кислоты на серу или метильную группу, которые не влияют на структуру дезоксирибозы. В этих случаях аптамер оказывается устойчивым к действию нуклеаз, однако изменение суммарного заряда молекулы повышает её склонность к неспецифическому связыванию с мишенью [106, 107]. Разработанные модификации, вносимые для увеличения устойчивости к действию нуклеаз или увеличения аффинности, препятствуют протеканию полимеризации в процессе ПЦР, что усложняет процесс SELEX [108].

Методы молекулярного моделирования в разработке и исследовании аптамеров. Метод отбора аптамеров из библиотеки первичных последовательностей. Для оптимизации разработки аптамеров были предложены многочисленные методы, основанные на молекулярном моделировании. Основными вычислительными подходами стали докинг и молекулярная динамика, позволяющие симулировать взаимодействие аптамера и мишени. Иногда данные методы дополняют квантово-механическими или гибридными методами вычисления энергии для более точной оценки связывания [109]. Методы предсказания вторичной и третичной структуры РНК и ДНК играют важную роль в разработке молекул, поскольку для проведения моделирования комплексов белок-аптамер необходима их третичная структура [110]. Современные инструменты in silico дают возможность моделировать аптамеры как под малые молекулы, так и под сложные биополимеры. Единственное их ограничение, в отличие от метода SELEX – невозможность использовать клетки в качестве мишени. Типичный цикл моделирования аптамера в исследовании in silico начинается с прогнозирования вторичной структуры с последующим предсказанием и оптимизацией третичной структуры. Далее производится жёсткий или гибкий докинг мишени и аптамера, при этом отбираются комплексы с наибольшими оценками связывания. Следующим важным, но не обязательным шагом является этап молекулярной динамики, позволяющий оценить стабильность комплекса и определить энергию связи с более высокой точностью [111]. Анализ взаимодействия аптамера с мишенью позволяет исследователям проводить замены нуклеотидов или их химические модификации, после чего предыдущие шаги можно повторить с новыми кандидатами [112]. Помимо методов моделирования структур и их взаимодействия, модели взаимосвязи структура–активность (QSAR) начали применять в разработке аптамеров для быстрого предсказания требуемой характеристики и сканирования пространства последовательностей [113–115].

Все вышеперечисленные вычислительные методы могут быть использованы вместе с экспериментальными, дополняя друг друга и повышая эффективность. К примеру, для повышения разнообразия первичной библиотеки SELEX было предложено использовать методы предсказания вторичных структур, которые позволяют оценивать их сложность и отбирать последовательности с наибольшим потенциалом. Такие методы также могут быть применены для подбора правильного соотношения структур в первичной библиотеке для устранения неравномерного течения ПЦР [116]. Тем не менее методы предсказания вторичной структуры в основном низкопроизводительны и не способны предсказать большое количество различных структур за ограниченное время. В то же время они обычно применимы к РНК, в то время как аптамеры преимущественно делаются на основе ДНК в силу их большей структурной стабильности и экономической эффективности. Также большинство методов предсказания вторичных структур игнорируют распространённую структуру псевдоузла из-за высокой вычислительной стоимости её предсказания [116, 117]. Поэтому было предложено использовать методы глубокого обучения, благодаря чему были разработаны модели, способные с высокой скоростью и точностью предсказывать структуры нуклеиновых кислот [118]. Однако в настоящее время экспериментальных данных о структурах одноцепочечных ДНК ещё недостаточно для качественного обучения моделей.

Библиотека первичных последовательностей SELEX содержит большое число разнообразных последовательностей, однако финальный аптамер, выбранный для данной мишени, может быть всё ещё не оптимальным, то есть обладать низкой стабильностью пространственной структуры или аффинностью. При разработке аптамера, связывающего антибиотик сульфадиметоксин, был применён многостадийный подход по внесению точечных замен в аптамер с последующей молекулярной динамикой [119]. За основу авторами был взят аптамер, созданный с помощью SELEX. Его взаимодействие с мишенью было смоделировано с помощью молекулярной динамики, аффинность взаимодействия оценивалась как изменение свободной энергии Гиббса при взаимодействии между аптамером и целевой молекулой. В структуру аптамера вносились точечные замены, после чего снова производилась молекулярная динамика и оценка связывания. Авторы выбирали лучшие последовательности на каждом шаге, благодаря чему смогли увеличить аффинность аптамера, не прибегая к дополнительным экспериментам с помощью SELEX.

Другой пример подобного подхода – разработка аптамера против простатического специфического антигена (PSA) [120]. Авторы работы использовали пять последовательностей, полученных с помощью SELEX, в качестве стартовой точки для моделирования. Данные последовательности были размножены путём скрещивания последовательностей с использованием генетического алгоритма, после чего взаимодействие с мишенью оценивалось с использованием белок-белкового докинга. Лучшие кандидаты были синтезированы, а их взаимодействие с мишенью измерено с помощью кварцевых микровесов, что позволило снова отобрать лучших кандидатов. Таким образом, последовательности итеративно оптимизировались под мишень, при этом использовались как реальные эксперименты, так и более простые и производительные компьютерные модели. В результате был получен аптамер, который показал в три раза более эффективное связывание по сравнению с исходными аптамерами, полученными по методу SELEX.

Метод направленного моделирования аптамеров на основе информации о структурах мишеней. В работах, описанных выше, использовали методы компьютерного моделирования преимущественно для усовершенствования существующих аптамеров, полученных экспериментально. Однако были предложены и подходы к de novo моделированию аптамеров на основе информации о структуре мишени. В исследовании по разработке аптамера для цитохрома P450 использовался метод «горячих точек» и подход по разделению нуклеотидной цепи на два типа участков. Первый участвует в образовании связей с белком за счёт свободных нуклеотидов, которые вносят основной вклад в аффинность и специфичность молекулы. Вторая же часть ответственна за поддержание пространственной структуры аптамера. После определения на поверхности белка участков, имеющих положительно заряженные аминокислоты, с помощью алгоритмов низкомолекулярного докинга и молекулярной динамики были получены структуры тринуклеотидов, связывающихся с поверхностью белка. К наиболее аффинным участкам были добавлены спиральные комплементарные участки для образования структуры шпильки. Синтезированные аптамеры показали высокую специфичность, не связываясь с белками других семейств, а экспериментально определённые энергии связывания имели высокую корреляцию с расчётными [121].

В процессе моделирования молекул, как правило, создаётся набор кандидатов, требующий оценки их эффективности для дальнейшего отбора. Проведение эксперимента для оценки связывания с мишенью будет самым точным, но в то же время самым затратным подходом. Поэтому часто используют методы молекулярного докинга и динамики. Однако длительные симуляции для большого числа кандидатов затратны по времени. Решением может быть использование методов машинного обучения для предсказания требуемой характеристики. Такой подход использовался для разработки аптамера против аминопептидазы CD13. Последовательности аптамеров генерировались итеративно с использованием генетического алгоритма. Отбор новых последовательностей для следующего поколения производился оценочной функцией на основе модели машинного обучения, предварительно обученной на характеристиках первичной и вторичной структур РНК и белка [114]. В другой работе для разработки аптамеров против нейтрофильного желатиназа-ассоциированного липокалина использовали модель нейронной сети, обученной на экспериментальных данных, для изучения пространства последовательностей. Авторам удалось не только разработать и синтезировать аптамеры с высокой аффинностью, но и найти более короткие последовательности нуклеиновых кислот с сопоставимой аффинностью и большей стабильностью [115]. Однако подобные нейронные сети могут выявлять зависимости и совершенствовать уже известные структуры, но при поиске новых соединений исключать перспективные структуры из рассмотрения. По этой причине они нуждаются в тщательном тестировании и должны быть хорошо интерпретируемыми.

Наиболее перспективными методы молекулярного моделирования оказываются в разработке модифицированных аптамеров, более пригодных для применения в терапии. Так, с помощью in silico подходов к разработке аптамеров может быть выбрана оптимальная комбинация модификаций, способная увеличить аффинность, предотвратить деградацию под действием нуклеаз, но при этом не повлиять на специфичность. Был предложен подход, в котором последовательное применение различного программного обеспечения позволяло моделировать модифицированные аптамеры и их взаимодействие с белками-мишенями [122]. В этой работе использовали классический путь предсказания третичной структуры аптамеров, за которым следовало внесение модификаций, после чего производился высокомолекулярный докинг и выявлялись взаимодействующие основания. В работе использовали программы Mfold и 3dRNA для предсказания пространственных структур нуклеиновых кислот. Однако метод Mfold не способен предсказывать псевдоузлы, к тому же является низкопроизводительным [123]. Метод 3dRNA также является низкопроизводительным и показывает значительное расхождение между экспериментальными и предсказанными структурами (RMSD около 4 Å) [124]. Таким образом, из-за невысокой точности предсказания и низкой производительности данный метод ограничен в использовании для моделирования новых аптамеров для заданной мишени.

Другим очевидным ограничением метода стало отсутствие этапа молекулярной динамики, которая могла бы оптимизировать структуру комплекса. Внесение даже единичных модификаций может значительно влиять на пространственную структуру нуклеиновой кислоты [125]. По этой причине после внесения модификаций структуру необходимо подвергать длительной молекулярной динамике для исследования конформационных изменений. Однако стандартные силовые поля для моделирования нуклеиновых кислот не могут быть применены для симуляции модифицированных нуклеиновых кислот. В работе Galindo-Murillo et al. была проведена параметризация модифицированных нуклеотидов, которая позволила проводить молекулярную динамику нетипичных оснований и показала хорошее соответствие полученных результатов моделирования и эксперимента. Однако спектр параметризованных модификаций был ограниченным [126]. Существующие универсальные силовые поля способны производить симуляцию молекул с множеством различных модификаций, но для биополимеров данные силовые поля плохо согласуются с экспериментами [127].

Таким образом, существует два перспективных направления развития методов молекулярного моделирования аптамеров на основе структуры мишени. Одна группа методов имитирует процесс отбора, характерного для SELEX, с использованием предсказания пространственной структуры, докинга и молекулярной динамики, вторая производит направленную разработку структуры нуклеиновой кислоты, способную связываться с эпитопом на поверхности белка. Общая схема применения данных подходов показана на рис. 6. Оба подхода требуют качественного предсказания вторичной и третичной структуры, а также использования методов молекулярной динамики. Развитие данных методов является наиболее важным для успешного прогнозирования новых аптамеров.

 

Рис. 6. Схема применения методов молекулярного моделирования в разработке и оптимизации аптамеров

 

Молекулярные отпечатки. Структура и способы получения молекулярных отпечатков. Для получения ещё более простых в производстве аналогов антител в 1973 году был предложен метод полимерных молекулярных отпечатков (molecularly imprinted polymers, MIP) [128]. MIP представляют собой пористые материалы, способные селективно узнавать шаблон (молекулы, на узнавание которых разрабатывается MIP). Они получаются путём самосборки функциональных мономеров вокруг молекулы шаблона в порогене (растворитель для образования пор), после чего инициируется полимеризация в присутствии сшивающего реагента [129]. MIP находят множество применений в таких областях, как диагностика (включая аналоги иммуноферментного анализа), аффинное разделение, доставка лекарств и др. [130–135]. Исходно MIP были созданы для низкомолекулярных соединений, но в настоящее время их начинают использовать и для белковых молекул.

Основной подход к получению молекулярных отпечатков заключается в направленном создании поверхности с геометрическим и физико-химическим соответствием шаблону. На первом этапе добавляют функциональные мономеры, которые взаимодействуют с шаблоном и образуют непрочный комплекс. На втором этапе проводят полимеризацию полученного комплекса в присутствии избыточного количества сшивающих мономеров и порогена. На последнем этапе происходит вымывание шаблона из молекулярного отпечатка, за счёт чего образуется полость для специфического связывания белка-мишени [136, 137].

Существует два основных подхода к получению молекулярных отпечатков. Первый включает использование ковалентных функциональных мономеров, которые создают химическую связь с молекулой шаблона, а после этапа полимеризации ковалентные связи расщепляются. В силу сложности данной процедуры и необходимости дополнительных этапов расщепления данный подход практически не используется в отношении белков.

Второй подход основан на образовании относительно слабых нековалентных взаимодействий между шаблоном и функциональными мономерами, таких как водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса, диполь-дипольные и гидрофобные взаимодействия. В силу простоты данный подход в настоящее время является наиболее распространённым. Однако подход с нековалентным связыванием требует более тщательного подбора состава и количества функциональных мономеров [138].

Процедура получения MIP всегда связана с тщательным подбором состава смеси и условий реакции в зависимости от структуры шаблона и выбранного полимера, что является одним из основных недостатков этого метода. Кроме необходимости случайного перебора возможных компонентов, функциональных и сшивающих мономеров, порогенов и условий протекания реакции, данный процесс также является слабовоспроизводимым. Кроме того, для получения каждой новой партии молекулярного отпечатка требуется использование шаблона, что отрицательно сказывается на масштабируемости производства [139].

Для решения проблемы перебора компонентов был предложен метод комбинаторной химии, в котором создаётся большое разнообразие возможных составов, и эксперименты по получению молекулярных отпечатков происходят параллельно [140, 141].

Дополнительные сложности при создании MIP для белков создают условия полимеризации: повышенная температура, неестественная для белков величина pH, органические растворители, что может привести к изменению структуры шаблона [132]. В качестве альтернативы использования целого белка был предложен метод эпитопного импринтинга. У большинства белков на поверхности есть участки с большим количеством полярных и заряженных аминокислот, которые наиболее часто участвуют в связывании. Вместо попытки полимеризации вокруг целого белка, что связано с большими трудностями в подборе условий, в которых полимеризация не будет нарушать структуру белка, могут быть использованы только фрагменты, включающие данный эпитоп. В силу меньшего размера и часто более стабильной структуры таких эпитопов данный подход повышает диапазон допустимых условий для протекания реакции полимеризации. Тем не менее для достижения полного соответствия данного эпитопа нативной структуре требуется проводить сложные работы, связанные с искусственным созданием меньших по размеру белков, сохраняющих структуру эпитопа [142].

Несмотря на возможность перебора большого количества компонентов смеси для получения структуры молекулярного отпечатка, сила взаимодействия функциональных мономеров с шаблоном обычно низкая, из-за чего мономеры добавляют в избытке. В результате часто возникает широкий спектр равновесных состояний комплекса мономеры–шаблон, что даёт широкий диапазон аффинности и специфичности у MIP [143].

Полимеризация вокруг матрицы должна происходить с возможностью последующего беспрепятственного удаления белка из сайта связывания и доступа для нового белка. Поэтому плотно полимеризующиеся сшивающие мономеры, используемые для разработки молекулярных отпечатков для малых молекул, для белков не подходят. Были предложены методы, позволяющие использовать изменение условий для регулирования размера пор, что позволяет контролировать процесс связывания и высвобождения белков. Для этого, в частности, было предложено проводить полимеризацию с добавлением pH-чувствительных сшивающих элементов пептидной природы, из-за чего при повышении pH поры и сайт связывания увеличиваются в размерах, и появляется возможность выхода белка [144].

Однако более популярным подходом стал метод поверхностных отпечатков, в котором шаблон покрывают тонким слоем полимера, не способным полностью погрузить белок в толщу и не препятствующим высвобождению и связыванию. Развитием данного метода является предполимеризация наночастиц, при которой функциональные мономеры связываются с заранее подготовленными наночастицами из сшивающего полимера, а после взаимодействия с белком-мишенью происходит полноценная полимеризация. Тем не менее независимо от метода данные подходы обычно значительно снижают специфичность связывания в сравнении с полимеризацией в объёме [145].

Сравнение вариантов белок-связывающих полимерных молекулярных отпечатков показано на рис. 7.

 

Рис. 7. Варианты белок-связывающих полимерных молекулярных отпечатков

 

Методы молекулярного моделирования в разработке и исследовании молекулярных отпечатков. Разработка MIP – это длительный и дорогостоящий процесс. Он требует выбора оптимальных мономеров, подбора соотношения компонентов в реакционной смеси, оптимальных условий проведения реакции. Это затрудняет задачу и увеличивает время по разработке MIP, что ограничивает возможности для их широкого применения. Компьютерное моделирование может значительно оптимизировать этот процесс.

К настоящему времени основные работы по молекулярному моделированию MIP были проведены для низкомолекулярных соединений [146–149]. Основные усилия при этом были направлены на предполимеризационную стадию. Для этого использовались как методы квантовой механики, так и молекулярной динамики. Целью применения данных методов является поиск наиболее подходящего функционального мономера, оценка характера связывания и подбор оптимального соотношения компонентов реакционной смеси [150–157].

Для разработки MIP, связывающихся с белками, было предложено несколько вычислительных подходов [158–160]. Основными методами при этом являются молекулярный докинг и молекулярная динамика.

Одной из сложностей при создании MIP является его возможное влияние на структуру белкашаблона. Так, было показано, что в процессе приготовления MIP происходит ингибирование рибонуклеазы А. Моделирование (с помощью метода молекулярной динамики) формирования комплекса белка с функциональными мономерами на основе стирена и сшивающего полимера, диметилакрилата полиэтиленгликоля 400, показало возможные конформационные изменения в белке, которые приводили к его инактивации [161]. В то же время исследование методом молекулярной динамики не выявило возможного влияния функциональных мономеров на структуру белка PSA [162].

В работе Kryscio et al. были изучены механизмы влияния условий процесса получения молекулярных отпечатков на конформацию альбумина. Для этого был применён докинг различных функциональных и сшивающих мономеров на поверхность белка. Были определены сайты преимущественного положения мономеров. В каждом из полученных участков наблюдалось серьёзное влияние на пространственную структуру. В то же время было показано, что различные функциональные мономеры конкурируют за одни и те же боковые радикалы аминокислотных остатков [158].

Методы молекулярного моделирования активно используются для подбора мономеров и поиска оптимальных соотношений реагентов в разработке MIP для белков [158, 163, 164]. В работе Rajpal et al. докинг применялся для анализа состава смеси функциональных мономеров, позволив подобрать оптимальный состав смеси для нескольких пептидов до проведения лабораторных экспериментов [165]. Докинг с последующей молекулярной динамикой были использованы для подбора концентраций функциональных и сшивающих мономеров для оптимального связывания миоглобина [159].

Помимо прогнозирования состава функциональных и сшивающих мономеров, важность представляет и прогнозирование аффинности молекулярных отпечатков к их мишени [166]. Была оценена применимость методов, основанных на глубоком обучении, в оценке аффинности молекулярных отпечатков к малым молекулам. Было показано, что использование различных моделей глубокого обучения позволяет хорошо предсказывать параметры связывания молекулярных отпечатков с 2-метоксифенидином. Подобный подход может быть применён и к анализу связывания с белком, что может в значительной степени упростить подбор компонентов и условий полимеризации при получении молекулярных отпечатков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Область применения аффинных и специфичных систем явно развивается в сторону более простых, дешёвых и технологических решений. Первоначально это были моноклональные антитела, в том числе их производные: химерные, гуманизированные и человеческие моноклональные антитела. Желание упростить и удешевить производство и разработку антител привело к использованию их фрагментов, таких как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), отдельный антиген-связывающий фрагмент (Fab′), минитела, нанотела и др. Развитием систем белковой природы стало получение антителомиметиков. Из-за сложности в хранении и применении белковых систем следующим этапом разработки стало получение систем небелковой природы, основными из которых являются аптамеры и полимерные молекулярные отпечатки. Каждая из разрабатываемых аффинных систем имеет как свои преимущества, так и недостатки. Можно ожидать, что и в дальнейшем эти технологии будут развиваться параллельно друг другу, и у разработчиков будет иметься широкий набор решений для выбора наиболее подходящей системы в каждом конкретном случае в зависимости от поставленных задач.

В последние годы на этапах разработки аффинных систем начали активно использовать методы молекулярного моделирования. Их применение во многом позволяет отказаться от традиционного подхода «проб и ошибок». Моделирование взаимодействия аффинной системы со своей мишенью позволяет более детально понять молекулярные механизмы, лежащие в основе высокоаффинного и специфичного связывания, и на этой основе подобрать оптимальную структуру системы, а также условия её получения. Молекулярное моделирование становится неотъемлемой частью таких разработок.

Основными методами выступают:

1. Моделирование по гомологии для построения структур антител и их фрагментов, известных антителомиметиков, а также структуры мишени;
2. Ab initio методы для прогнозирования вариабельных связывающих частей антител, их фрагментов и антителомиметиков;
3. Низкомолекулярный докинг для подбора позы взаимодействующих оснований в задаче проектирования белковых связывающих систем и аптамеров (например, метод «горячих точек»), а также в подборе состава для разработки молекулярных отпечатков;
4. Высокомолекулярный докинг для предсказания структур комплексов белок–белок или белок–нуклеиновая кислота;
5. Методы молекулярной механики, квантовой химии и статистики для оценки энергии взаимодействия, что является основой отбора более аффинных связывающих систем;
6. Молекулярная динамика, позволяющая моделировать поведение молекулярных систем в естественных условиях, оценивать стабильность моделируемых структур и их комплексов.

Классические методы моделирования продолжают совершенствоваться, но в последние годы наблюдается резкое увеличение интереса к системам предсказания, основанным на глубоком обучении. Способность нейронных сетей улавливать скрытые закономерности позволяет создавать программы, обладающие высокой предсказательной силой. Системы на основе глубокого обучения используются при моделировании или de novo проектировании структур белков и белок–белковых комплексов (в том числе антител и комплексов антиген–антитело), нуклеиновых кислот, позволяют аппроксимировать физико-химические характеристики, ускорять вычислительно дорогие процессы симуляций и другое. Тем не менее серьёзным недостатком методов, основанных на глубоком обучении, является ограниченность обучающих данных. В связи с этим часто возникают проблемы снижения точности или «галлюцинации», которые мешают данным методам полностью вытеснить классические.

Современные пакеты программного обеспечения, в том числе свободно распространяемые и веб-сервисы, позволяют проводить весь цикл вычислений при разработке всех типов аффинных систем, однако требуется наработка большего количества данных, совершенствование алгоритмов и сравнительные исследования применимости разных методов для увеличения их точности, производительности и результативности.

Вклад авторов. Насаев Ш.Ш., Муканов А.Р., Мишкорез И.В., Долгушева В.А. – концепция, написание текста, иллюстрирование; Кузнецов И.И., Лейбин И.В., Павлюк Г.А., Манасян А.Л. – написание текста, редактирование статьи; Веселовский А.В. – руководство работой, редактирование статьи.

Финансирование. Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 гг., № 122030100170-).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или с использованием животных в качестве объектов.

作者简介

Sh. Nasaev

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

A. Mukanov

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

I. Mishkorez

Xelari Ltd.; Institute of Biomedical Chemistry

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow; 119121 Moscow

I. Kuznetsov

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

I. Leibin

Skolkovo Institute of Science and Technology

Email: veselov@ibmh.msk.su
俄罗斯联邦, 121205 Moscow

V. Dolgusheva

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

G. Pavlyuk

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

A. Manasyan

Xelari Ltd.

Email: veselov@ibmh.msk.su

R&D Department

俄罗斯联邦, 121601 Moscow

A. Veselovsky

Institute of Biomedical Chemistry

编辑信件的主要联系方式.
Email: veselov@ibmh.msk.su
俄罗斯联邦, 119121 Moscow

参考

补充文件