Combined Administration of Metformin and Amprolium to Rats Affects Metabolism of Free Amino Acids in the Brain, Altering Behavior, and Heart Rate

全文:

Принятые сокращения: ОГДК – 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс; ПДК – пируватдегидрогеназный комплекс; ТДФ – тиаминдифосфат; ТКТ – транскетолаза; ФЭА – фосфоэтаноламин; BCAA – аминокислоты с разветвлённой цепью; GSH – глутатион; GSSG – окисленный глутатион.

ВВЕДЕНИЕ

Давно известно, что ожирение и инсулинорезистентность сопровождаются нарушениями метаболизма аминокислот и изменением их уровней в крови [1, 2]. В частности, диабет связан с повышенным содержанием α-аминоадипата в плазме крови [3]. Известно также, что терапевтический потенциал противодиабетического препарата метформина может быть увеличен путём преодоления вызываемых метформином нарушений деградации аминокислот с разветвлённой цепью (BCAA), опосредованных AMP-активируемой протеинкиназой (AMPK) [4, 5]. Аминокислоты деградируют через митохондриальный цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), в основном в результате их трансаминирования в пируват, 2-оксоглутарат или 2-оксокислоты с разветвлённой цепью, подвергающиеся дальнейшему окислению соответствующими тиаминдифосфат (ТДФ)-зависимыми комплексами дегидрогеназ 2-оксокислот. Недостаточность окисления глюкозы обычно вызывает усиление деградации аминокислот в качестве альтернативного источника энергии.

ТДФ является дифосфорилированным производным тиамина (витамина B1). Поскольку в качестве кофермента ТДФ участвует в путях деградации аминокислот, дефицит тиамина нарушает метаболизм аминокислот. В частности, известно, что блокада биосинтеза ТДФ и, следовательно, нарушение катализа ТДФ-зависимыми ферментами вызывают изменения содержания ряда аминокислот в мозге экспериментальных животных [6, 7]. С другой стороны, улучшение метаболизма мозга в результате введения тиамина сопровождается снижением окисления аминокислот [8].

Хотя долгое время считалось, что дефицит тиамина больше не является проблемой в развитых странах, растёт число случаев, когда патогенез нейродегенеративных расстройств связан с нарушением тиаминового статуса пациента [9]. Употребление тиамина не рекомендуется производить одновременно с приёмом противодиабетического препарата метформина, поскольку тиамин и метформин конкурируют за одни и те же клеточные транспортеры. В связи с этим рекомендации учитывают, что тиамин может снижать фармакологический эффект метформина. Однако возможность противоположного эффекта, то есть снижения внутриклеточного содержания тиамина в результате конкуренции метформина и тиамина за одни и те же переносчики, при назначении метформина рассматривается на удивление редко. Это ещё более поразительно ввиду неоднократно наблюдаемого нарушения тиаминового статуса у пациентов с сахарным диабетом второго типа, свидетельствующего об уменьшении кишечного всасывания и/или внутриклеточного транспорта тиамина [10]. Несмотря на эти факты, насколько нам известно, связь между дефицитом тиамина и приёмом метформина не изучалась. Существование такой связи подтверждается рядом клинических наблюдений. Так, лактатный ацидоз является как известным эффектом тиаминового дефицита, так и распространённым побочным эффектом метформиновой терапии. Некоторые исследования клинических случаев продемонстрировали, что тиамин устраняет вызванный метформином лактатный ацидоз [11, 12]. Известно также, что дефицит тиамина ухудшает окисление 2-оксокислот с разветвлённой цепью [6], что может лежать в основе нарушения деградации BCAA метформином [4]. Однако, подобно лактатному ацидозу, связь этого побочного эффекта метформина с другим его побочным эффектом – блокированием транспорта тиамина – не анализировалась.

В данной работе мы изучали эффекты хронического введения метформина крысам, тиаминовый статус которых одновременно нарушался введением ампролиума. Ампролиум является кокцидиостатиком, используемым в птицеводстве. Он блокирует всасывание тиамина в кишечнике, а также замедляет его транспорт через гематоэнцефалический барьер и внутрь клеток [13–15]. Благодаря этим свойствам данный препарат также используется в фундаментальных исследованиях для создания животных моделей дефицита тиамина [16]. Введение ампролиума может вызывать тиамин-чувствительный цереброкортикальный некроз и полиоэнцефаломаляцию у сельскохозяйственных и домашних животных [17–21], тем самым ставя под сомнение безопасность использования животных, обработанных ампролиумом, для пищевого потребления [22]. Хроническое введение ампролиума мышам вызывает поведенческие изменения наряду с нарушением клеточных процессов [23]. Поэтому мы использовали комбинированное введение метформина и ампролиума крысам для моделирования эффектов противодиабетических препаратов из группы бигуанидов (метформин) на фоне такой типичной для пациентов с диабетом сопутствующей патологии, как недиагностированный дефицит тиамина. Принимая во внимание, что метформин и ампролиум оказывают влияние на внутриклеточные транспортеры тиамина семейств SLC19A и OCT [24–26], мы сравнивали тиамин-зависимый метаболизм у контрольных и обработанных крыс посредством: (1) оценки уровней ТДФ (коферментной формы тиамина), активностей ТДФ-зависимых ферментов и насыщения этих ферментов ТДФ в гомогенатах мозга, (2) количественного определения аминокислот и родственных соединений в экстрактах мозга и (3) проведения поведенческих тестов и регистрации электрокардиограммы (ЭКГ) в ходе эксперимента. Мы показали, что к концу эксперимента контрольные и опытные животные различаются по насыщению ТДФ-зависимых ферментов ТДФ и по вкладу ТДФ и ТДФ-зависимых ферментов в метаболизм, но не по общему уровню ТДФ. Используемые препараты увеличивали содержание и усиливали метаболические взаимодействия свободных аминокислот и аммиака в коре головного мозга крыс, одновременно влияя на поведение животных и параметры ЭКГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты на животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Директивами Европейского Союза 86/609/EEC и 2010/63/EU. Двадцать шесть самцов крыс линии Wistar были случайным образом распределены в контрольную и экспериментальную группы. На момент входа в эксперимент возраст крыс составлял от 5 до 6 недель, а масса тела – 155,3 ± 2,7 и 155,4 ± 3,3 г в контрольной и экспериментальной группах соответственно. В конце эксперимента крысы в возрасте от 9 до 10 недель весили 271,0 ± 5,1 и 278,3 ± 5,4 г в контрольной и экспериментальной группах соответственно. Ампролиум (40 мг/кг массы тела) и метформин (200 мг/кг массы тела для первых трёх инъекций и 70 мг/кг массы тела для последующих пятнадцати инъекций) вводили крысам в виде двух отдельных инъекций (n = 14; две крысы погибли на 3-й день). Контрольная группа (n = 12) получала две отдельные инъекции физиологического раствора. Животным делали инъекции утром (ZT 2 ± 1). Всего было сделано 18 двукратных инъекций в течение 24 дней по схеме, представленной на рис. 1, т.е. 5 дней с инъекциями сменялись двухдневным перерывом, вплоть до последних трёх дней с инъекциями. Дозы подбирали, основываясь на опубликованных данных [23, 27]. Ежедневно контролировали вес животных, потребление пищи и воды. Существенных различий между опытной и контрольной группами не наблюдалось. Тест «открытое поле» («OpenScience», Москва, Россия) использовали для оценки спонтанной активности животных в незнакомой обстановке [28]. Тест проводился в течение трёх минут в полной тишине; область освещалась 15-ваттной красной лампой, как описано ранее [29, 30]. Оценивали следующие параметры: локомоторная активность (по количеству пересечённых линий); количество выходов в центральную зону (по числу перемещений в центральную зону, пересекающих внешний и внутренний круги); количество стоек (на задних конечностях); время и количество актов груминга, время замирания, акты дефекации. Для количественной оценки исследовательской активности и тревожности также применяли кумулятивные индексы. Индекс исследовательской активности суммировал количество стоек и выходов в центральную зону. Индекс тревожности суммировал количество актов груминга и дефекации, а также время груминга и замирания.

 

Рис. 1. Схема экспериментов на животных. В указанные дни в течение 24 дней вводили инъекции метформина (М) и ампролиума (А). За первыми тремя инъекциями метформина в дозе 200 мг/кг массы тела следовали 15 инъекций метформина в дозе 70 мг/кг массы тела. Каждая из инъекций метформина сопровождалась второй инъекцией ампролиума в дозе 40 мг/кг массы тела. Физиологические и биохимические тесты проводили в указанные дни, как описано в разделе «Материалы и методы»

 

ЭКГ регистрировали в течение 3 минут с помощью неинвазивных электродов, как описано ранее [29]. Вегетативная регуляция сердца оценивалась по следующим параметрам ЭКГ: средний интервал R-R (мс); диапазон значений интервала R-R, т.е. разница между максимальным и минимальным значением интервалов R-R (dX, мс); среднеквадратичное значение последовательных разностей интервалов R-R (RMSSD, мс); и стресс-индекс (SI). Физиологический мониторинг проводили на 8-й, 15-й и 25-й дни эксперимента.

После проведения физиологических тестов на 25-й день животных умерщвляли путём декапитации. Мозг вырезали и переносили на лёд; кору головного мозга отделяли и замораживали в жидком азоте в течение 60–90 с после декапитации.

Приготовление гомогенатов мозга. Замороженную ткань коры гомогенизировали в 50 мМ MOPS-буфере (pH 7,0), содержащем 0,2 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 20% глицерина и ингибиторы протеазы (1 мМ AEBSF, 0,8 мкМ апротинина, 50 мкМ бестатина, 10 мкМ пепстатина A, 15 мкМ E-64 и 20 мкМ лейпептина) с использованием диспергатора T10 Basic Ultra-Turrax («IKA»; Штауфен, Германия), как описано ранее [29]. Один мл буфера использовали на 0,4 г веса свежей ткани. Ткань далее разрушали ультразвуком (7 циклов × 30 с озвучивания в режиме низкой интенсивности и 30 с паузы) с помощью ультразвукового аппарата Bioruptor («Diagenode»; Льеж, Бельгия) в ледяной водяной бане. Полученные гомогенаты смешивали в соотношении 3 : 1 (v/v) с буфером для солюбилизации, содержащим 40 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 600 мМ NaCl, 4 мМ ЭДТА, 1% дезоксихолата натрия и 4% NP-40, и инкубировали в течение не менее 30 мин перед анализами.

Определение активностей ферментов. Активность транскетолазы (TKT) оценивали спектрофотометрически по скорости окисления NADH в сопряжённой системе с триозофосфатизомеразой/глицерол-3-фосфатдегидрогеназой по известному методу [31], модифицированному для микропланшетного ридера [32]. Для расчёта скорости реакции использовали линейную часть кривой накопления продукта (30 мин) с последующим вычитанием фоновой скорости, измеренной без добавления пентозофосфатов. Активность пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) определяли колориметрическим методом на микропланшетном ридере CLARIOstar Plus («BMG Labtech»; Ортенберг, Германия) по продукции NADH, сопряжённой с восстановлением иодонитротетразолия до формазана [33], с ранее описанными модификациями [34, 35]. Для расчёта скорости реакции использовали линейную часть кривой накопления продукта с 1 по 10 мин. Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК) оценивали по поглощению продуцируемого NADH при 340 нм, как описано ранее [8], на микропланшетном ридере Sunrise («Tecan», Австрия). Для расчёта активности использовали стационарную, т.е. после завершения лаг-периода, скорость реакции с 5 по 10 мин. Для оценки активности эндогенных холоферментов ТДФ-зависимых дегидрогеназ анализы проводили в отсутствие MgCl₂ и ТДФ в реакционной среде. Эндогенную холотранскетолазу определяли в среде, не содержащей ТДФ.

Количественное определение метаболитов мозга. Свободные аминокислоты и родственные аминосоединения количественно определяли в метанол-уксуснокислых экстрактах коры мозга с помощью ионообменной хроматографии в системе литиевых буферов с дериватизацией нингидрином [36]. Таурин количественно определяли в виде единого пика с фосфоэтаноламином (ФЭА). В независимых исследованиях мозга млекопитающих относительное содержание таурина, по сравнению с ФЭА, варьировало от сопоставимого до в 10 раз более обильного [37–40]. Окисленный глутатион (GSSG) и NAD+ измеряли в чёрных 96-луночных микропланшетах с использованием микропланшетного ридера CLARIOstar Plus с помощью опубликованных ранее флуориметрических анализов [41, 42]. ТДФ количественно определяли по ранее описанному методу активации апо-ТКТ коферментом [43], модифицированному для микропланшетного ридера [44].

Статистический анализ проводили с помощью программных пакетов STATISTICA (версия 6.0), GraphPad Prism (версия 8.4) и R (версия 4.3). Выбросы были идентифицированы с помощью итеративного теста Граббса (Alpha = 0,01) и исключены из статистического анализа. Учитывая нормальное распределение данных согласно тесту Д’Агостино–Пирсона, различия в содержании метаболитов между двумя группами анализировали с помощью теста Стьюдента. Различия в кумулятивных параметрах корреляций между метаболитами (сумма и средние коэффициенты корреляции, а также число значимых положительных и отрицательных корреляций) анализировали с помощью теста Манна–Уитни ввиду ненормального распределения. При анализе более двух групп использовали дисперсионный анализ (ANOVA) вместе с апостериорным сравнением средних значений в группах с помощью теста Шидака. Данные представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Корреляции между исследуемыми параметрами анализировали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена, поскольку не все значения физиологических параметров были распределены нормально. Различия между группами и корреляции считали достоверными при p < 0,05, при p ≤ 0,1 рассматривались как тенденции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровни ТДФ, активностей ТДФ-зависимых ферментов и редокс-активных соединений в качестве индикаторов тиамин-зависимого метаболизма в коре головного мозга крыс. Содержание ТДФ может характеризовать потенциальные изменения тиамин-зависимого метаболизма после комбинированного хронического введения ингибиторов транспорта тиамина метформина и ампролиума, поскольку ТДФ является коферментной формой и основным производным тиамина в мозге. Ввиду существенной роли ТДФ в центральном редокс-метаболизме важными индикаторами тиамин-зависимых метаболических изменений являются уровни NAD+, а также антиоксидантных пептидов глутатиона (GSH) и карнозина.

Как видно из рис. 2, незначительное снижение общего содержания ТДФ в мозге после обработки ингибиторами транспорта тиамина не достигает уровня статистической значимости (p = 0,28). Тем не менее обработка вызывает некоторый уровень окислительного стресса, известного в качестве индикатора тиаминовой недостаточности [45, 46]. Наблюдается снижение содержания антиоксиданта карнозина, который защищает мозг от повреждения пероксинитритом [47], и тенденция (p = 0,09) к повышению уровня GSSG (рис. 2).

 

Рис. 2. Уровни ТДФ, NAD+, антиоксидантных пептидов карнозина и глутатиона (GSH), окисленного глутатиона (GSSG), а также соотношение восстановленного и окисленного глутатиона в коре головного мозга крыс, получавших метформин/ампролиум (М+А), по сравнению с контрольными животными

 

Полная, т.е. определяемая в присутствии ТДФ в реакционной среде, активность ТДФ-зависимых ферментов в коре головного мозга не отличается в контрольной и обработанной группах. Однако степень активации ферментов ТДФ, добавленным в среду, снижается после обработки. Для ТКТ это проявляется в исчезновении после обработки наблюдаемой в контрольных образцах небольшой, но статистически значимой активации ТДФ (рис. 3, а, верхняя панель). Для ОГДК наблюдается достоверное снижение фракции апо-ОГДК в обработанных образцах по сравнению с контрольными (рис. 3, в, нижняя панель). Активация ПДК ТДФ составляет ~100% как в контрольной, так и в обработанной группах, что согласуется с известной необходимостью добавления ТДФ в среду для измерения активности ПДК [34, 48]. В отличие от ТКТ и ОГДК, холофермент ПДК полностью диссоциирует в условиях анализа как в контрольной, так и в обработанной группе. Это не позволяет использовать уровни насыщения ПДГ ТДФ в качестве индикатора изменений, вызванных введением метформина/ампролиума. Однако как для ТКТ, так и для ОГДК уровни насыщения ТДФ увеличиваются после обработки по сравнению с контрольной группой.

 

Рис. 3. Активация ТКТ (а), ПДК (б) и ОГДК (в) добавлением ТДФ в реакционную среду измерения ферментативных активностей в коре головного мозга контрольных крыс и крыс, обработанных метформином/ампролиумом (M+A). На верхней панели полые и закрашенные точки обозначают активности, измеренные без и в присутствии ТДФ соответственно (статистический анализ с помощью ANOVA с повторными измерениями). Нижняя панель показывает сравнение фракций эндогенных апоферментов ТКТ, ПДК и ОГДК в обработанных и контрольных образцах, рассчитанных как [1 – (Активность без ТДФ)/(Активность в присутствии ТДФ)] × 100%. Исключённый из анализа выброс обозначен символом «x»

 

Если бы наблюдаемые изменения в насыщении ТКТ и ОГДК были вызваны различным содержанием ТДФ в мозге крыс, то определяемые в мозге обработанных и необработанных животных уровни ТДФ (ось Х) и соответствующие им активности эндогенных холоферментов либо фракций апоферментов (ось Y) занимали бы разные области пространства XY. Если же изменения в активности либо активации ферментов ТДФ (ось Y) были бы вызваны изменениями свойств фермента, а не уровней ТДФ (ось Х), то характерные для контрольной и опытной групп значения занимали бы одну и ту же область в пространстве XY. Корреляции между уровнем ТДФ и содержанием эндогенных холо- или апоферментов (рис. S1 Приложения) свидетельствуют в пользу второго предположения, поскольку точки для двух групп животных занимают одну и ту же область на графиках, показывающих соотношение значений активностей TKT или ОГДК или активации ферментов ТДФ и уровня ТДФ. Примечательно, что доля апо-ТКТ у контрольных крыс демонстрирует ожидаемую статистически значимую отрицательную корреляцию с содержанием ТДФ в мозге. Изменение параметров этой корреляции у обработанных животных дополнительно свидетельствует в пользу изменения сродства ТКТ к ТДФ после обработки. Активация митохондриального ОГДК ТДФ, добавленным в реакционную среду, достоверно не коррелирует с общим уровнем ТДФ в тканях ни у обработанных, ни у контрольных животных.

Таким образом, введение метформина/ампролиума не приводит к статистически значимому снижению общего уровня ТДФ в мозге крыс, но увеличивает сродство ТКТ и ОГДК мозга к коферменту ТДФ.

Изменения профилей свободных аминокислот и родственных соединений в мозге крыс после хронического введения метформина и ампролиума. По сравнению с контрольной группой хроническое введение метформина/ампролиума вызывает статистически значимое увеличение содержания метиллизина, триптофана, серина, глутамата, аспартата и бета-аланина, снижая содержание карнозина (рис. 4). Кроме того, наблюдаются тенденции (0,05 < p ≤ 0,1) к увеличению уровней цистатионина, лейцина, бета-аминоизобутирата и аланина. Содержание свободных аминокислот мозга, включая BCAA, в основном увеличивается. Это сопровождается достоверным повышением уровня аммиака в мозге (рис. 4). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что хроническое введение метформина и ампролиума приводит к гипераммониемии мозга, возникающей в результате повышенной деградации накапливающихся аминокислот. Таким образом, в дополнение к падению уровня антиоксиданта карнозина и росту содержания GSSG (рис. 2), общее нарушение метаболизма аминокислот, ассоциированное с гипераммониемией, представляет собой маркер патологических изменений в мозге крыс, получавших метформин/ампролиум.

 

Рис. 4. Изменения (в %) содержания аминокислот и родственных соединений в коре головного мозга крыс, получавших метформин/ампролиум, по сравнению с контрольными животными (n = 12 в каждой группе). Исключённые из статистического анализа выбросы не показаны, поскольку находятся за пределами диапазона оси Y. * Достоверное отличие от контрольных значений, принятых за 100%

 

Анализ корреляций между уровнями ТДФ или активностями ТДФ-зависимых ферментов и содержанием метаболитов мозга. Средние уровни ТДФ или активности ТДФ-зависимых ферментов в тканях (рис. 2 и 3) позволяют оценивать изменения в тиаминовом статусе, но не возникающие в результате потенциальных адаптаций различия в метаболических сетях контрольных и обработанных животных. Поэтому в дополнение к средним значениям параметров тиаминового статуса, парные корреляции между этими параметрами и содержанием метаболитов ТДФ-зависимой сети реакций полезны для характеристики метаболических изменений, вызванных введением исследуемых препаратов. Как показано в табл. 1, введение метформина/ампролиума сильно влияет на корреляции между содержанием ТДФ или активностями ТДФ-зависимых ферментов и уровнями редокс-индикаторов либо аминокислот. В частности, обработка метформином и ампролиумом приводит к достоверным положительным корреляциям между уровнями ТДФ и патологических маркеров, таких как GSSG, α-аминоадипат и аммиак. Кроме того, уровень ТДФ в мозге обработанных крыс положительно коррелирует с содержанием цитруллина, этаноламина, глицина и объединённым уровнем таурина и ФЭА, что не наблюдается у контрольных крыс. Достоверности положительной корреляции между уровнями ТДФ и лизина и отрицательной корреляции между уровнями ТДФ и триптофана у контрольных животных, напротив, пропадают после обработки. В совокупности эти данные указывают на изменение метаболического вклада ТДФ в редокс-состояние клеток и метаболизм аминокислот после хронического введения ингибиторов транспорта тиамина.

 

Таблица 1. Корреляции между уровнями ТДФ или активностями ТДФ-зависимых ферментов и содержанием NAD+, антиоксидантных пептидов, свободных аминокислот или родственных метаболитов в коре головного мозга контрольных крыс (контроль) и крыс, обработанных метформином/ампролиумом (M+A)

Параметр	ТДФ		ПДК−ТДФ		ПДК+ТДФ		ОГДК−ТДФ		ОГДК+ТДФ		ТКТ−ТДФ		ТКТ+ТДФ
	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A
NAD+	0,34	−0,47	−0,21	−0,11	−0,05	0,10	0,66	−0,70	0,77	−0,60	0,36	0,30	−0,15	0,55
Карнозин	0,29	−0,33	−0,31	0,33	0,12	0,50	−0,08	0,08	0,21	0,38	0,27	−0,62	−0,07	−0,43
GSH	0,06	−0,07	−0,16	−0,01	−0,73	0,10	0,27	−0,13	−0,03	−0,01	−0,18	0,02	−0,45	0,15
GSSG	−0,05	0,76	0,38	−0,15	0,25	−0,60	−0,02	0,38	0,08	0,26	−0,03	0,31	0,11	0,11
GSH/GSSG	−0,14	−0,54	−0,17	−0,16	−0,04	0,46	−0,11	−0,70	−0,11	−0,61	0,00	0,19	−0,23	0,38
GSH + 2*GSSG	−0,04	0,36	0,14	−0,52	0,02	−0,28	0,04	−0,27	0,16	−0,24	−0,16	0,70	−0,39	0,69
α-Аминоадипат	−0,18	0,75	0,08	−0,01	0,10	−0,61	0,36	0,61	0,16	0,45	−0,07	0,15	−0,12	−0,01
α-Аминобутират	0,15	0,01	−0,08	−0,57	−0,08	−0,28	0,34	−0,31	0,20	−0,45	0,09	0,59	−0,03	0,71
Арг	−0,45	0,26	0,31	0,37	0,29	0,11	−0,65	−0,05	−0,45	0,04	0,17	−0,10	0,34	0,01
β-Аминоизобутират	0,07	0,37	−0,12	−0,57	−0,69	−0,58	0,10	0,32	−0,30	0,06	−0,28	0,34	−0,36	0,21
Цитруллин	−0,16	0,60	0,21	−0,10	−0,07	−0,36	0,50	−0,03	0,52	−0,20	−0,04	0,31	−0,28	0,22
Цистатионин	0,31	−0,17	−0,10	0,75	−0,15	0,45	−0,21	−0,27	−0,08	−0,09	0,47	−0,36	0,29	−0,26
Этаноламин	0,52	0,60	−0,22	0,06	0,00	−0,31	0,38	0,26	0,51	0,41	0,35	0,23	−0,03	0,22
Гли	−0,24	0,57	0,01	0,07	0,42	−0,06	−0,29	0,01	−0,11	0,24	0,37	0,08	0,55	0,15
Гидроксилизин	0,11	0,30	−0,08	0,26	0,11	0,40	−0,60	0,06	−0,17	0,27	0,48	−0,49	0,37	−0,48
Иле	0,02	0,57	−0,03	0,15	0,35	−0,24	−0,54	0,01	−0,03	0,11	0,73	0,14	0,73	0,21
Лей	−0,13	0,52	0,07	0,21	0,52	−0,20	−0,61	0,04	−0,13	0,19	0,58	0,10	0,69	0,18
Лиз	0,76	0,53	−0,65	0,02	−0,21	−0,11	−0,04	0,11	0,27	0,32	0,52	0,03	0,10	0,06
Мет	−0,19	0,47	0,08	0,20	0,43	0,10	−0,76	−0,22	−0,23	−0,03	0,59	−0,02	0,65	−0,02
NH3	0,19	0,66	−0,01	−0,01	−0,26	−0,26	−0,37	0,08	−0,49	0,31	0,20	0,30	0,40	0,29
Фен	−0,47	0,43	0,44	0,27	0,57	0,21	−0,57	0,01	−0,32	0,30	0,15	−0,24	0,50	−0,19
Фосфосерин	0,10	0,31	−0,15	−0,55	0,29	−0,22	0,33	0,59	0,61	0,76	0,32	0,08	0,07	−0,03
Таурин + ФЭА	0,19	0,79	−0,22	−0,31	−0,29	−0,48	0,34	0,42	0,33	0,38	0,30	0,34	−0,13	0,00
Тре	0,57	0,49	−0,38	−0,13	0,01	0,06	−0,24	−0,19	0,03	0,18	0,88	0,20	0,64	0,29
Трп	−0,79	−0,33	0,73	0,56	0,20	0,25	−0,49	−0,59	−0,66	−0,36	−0,08	0,03	0,35	0,29
Мочевина	0,33	0,43	−0,15	0,17	0,24	−0,13	0,07	−0,25	0,35	−0,02	0,63	0,46	0,28	0,54
Вал	−0,21	0,44	0,28	0,27	0,70	−0,02	−0,20	−0,19	0,17	0,12	0,56	0,15	0,67	0,29

Примечание. В таблице приведены метаболиты, содержание которых имеет хотя бы одну достоверную корреляцию с уровнем ТДФ или активностями ТДФ-зависимых ферментов. Каждая ячейка показывает ранговый коэффициент корреляции Спирмена для данной пары параметров. Коэффициенты корреляций, меняющихся в результате обработки от достоверных (p < 0,05) до недостоверных или наоборот, показаны красным цветом на сером фоне. Коэффициенты достоверных корреляций выделены жирным шрифтом.

 

Схожим образом под действием метформина и ампролиума меняется и значимость корреляций между уровнями активностей ТДФ-зависимых ферментов и редокс-индикаторов или аминокислот в мозге (табл. 1). В частности, после обработки уровень активности ОГДК отрицательно коррелирует с уровнями NAD+ и редокс-потенциалом глутатиона (GSH/GSSG), в то время как у контрольных животных активность ОГДК имеет сильную положительную корреляцию с содержанием NAD+. Уровень активности ТКТ мозга после обработки, но не в контрольной группе, положительно коррелирует с уровнями общего глутатиона (GSH + 2*GSSG) и α-аминобутирата и отрицательно – с уровнем карнозина. Кроме того, достоверные положительные корреляции уровней активности TKT и BCAA, наблюдаемые в контрольной группе, исчезают после обработки. В целом, корреляционный анализ показывает, что метаболические взаимосвязи ТДФ или ТДФ-зависимых ферментов со свободными аминокислотами или родственными соединениями различаются в мозге обработанных и контрольных крыс.

Влияние обработки метформином и ампролиумом на поведение крыс в тесте «открытое поле» и ЭКГ. Проведение физиологических тестов в ходе эксперимента помогает понять, как наблюдаемые изменения метаболизма аминокислот мозга влияют на поведение животных и ЭКГ. В отличие от биохимической характеристики мозговой ткани, физиологическое тестирование может повторяться в ходе эксперимента, что даёт представление о динамике изменений, вызванных введением метформина и ампролиума. Согласно ANOVA, фактор «обработки» значимо влияет на количество выходов в центральную зону (рис. 5, а) и связанную с ним локомоторную активность (рис. 5, б). Кумулятивные индексы исследовательской активности и тревожности также показывают значимый вклад фактора «обработки» (рис. 5, б). Значимое взаимодействие между количеством выходов в центральную зону и длительностью эксперимента (рис. 5, а) проявляется в увеличении выходов в центральную зону после 15-го дня только у обработанных крыс. В результате на 25-й день количество выходов в центральную зону у обработанных животных значительно выше, чем у контрольных. Очевидно, что эта разница вносит наибольший вклад в более высокий кумулятивный индекс исследовательской активности у обработанных крыс по сравнению с контрольными. Несмотря на достоверность влияния фактора «обработки» на локомоторную активность (p = 0,046) и кумулятивный индекс тревожности (p = 0,03), рассчитанную по всем тестированиям каждой из групп сравнения, достоверные различия между отдельными группами, протестированными в выбранные дни эксперимента, не выявляются (рис. 5, б).

 

Рис. 5. Изменения поведения крыс в тесте «открытое поле» (а, б) и параметров ЭКГ (в) в зависимости от продолжительности хронического введения метформина/ампролиума (M+A) по сравнению с контрольными крысами. Достоверные различия между группами показаны на графиках; статистически значимые факторы, такие как «обработка» метформином/ампролиумом и «длительность обработки», а также их взаимодействие показаны под графиками (согласно ANOVA с повторными измерениями и апостериорным тестом Шидака)

 

Ввиду того, что введение метформина и ампролиума не влияет на количество стоек, но оказывает значимое влияние на количество выходов в центральную зону (p = 0,02) и локомоторную активность (p = 0,046), наблюдаемое увеличение количества выходов в центральную зону и сопутствующее увеличение исследовательской активности (p = 0,02), по-видимому, связано с общим повышением локомоторной активности, вызванным обработкой (рис. 5, а, б). Эти поведенческие изменения у обработанных крыс связаны с увеличением частоты сердечных сокращений, поскольку в ходе эксперимента R-R интервал ЭКГ снижается только у крыс, получавших метформин и ампролиум (рис. 5, в).

Таким образом, хроническое введение метформина и ампролиума влияет на определённые параметры поведения и ЭКГ в зависимости от продолжительности обработки. Наиболее существенные различия между контрольными и обработанными животными наблюдаются к концу эксперимента, что проявляется в увеличении количества выходов в центральную зону и связанного с этим кумулятивного индекса исследовательской активности у получавших метформин и ампролиум крыс по сравнению с контрольными.

Анализ корреляций между уровнями ТДФ или активностей ТДФ-зависимых ферментов и параметрами поведения или ЭКГ. Чтобы понять, насколько велик вклад тиаминового статуса и его взаимодействия с содержанием метаболитов в мозге (табл. 1) в индуцируемые метформином/ампролиумом изменения поведения и ЭКГ крыс, были проанализированы корреляции тиамин-зависимых биохимических параметров с физиологическими. Результаты анализа (табл. 2) выявляют интересную временную зависимость эффектов введения метформина/ампролиума на корреляции. Уровни ТДФ, определённые в мозге на 25-й, последний, день эксперимента, более достоверно коррелируют с поведенческими параметрами, определёнными не на 25-й, а на 15-й день. Так, у контрольных животных уровень ТДФ в мозге на 25-й день положительно коррелирует с кумулятивным индексом тревожности на 15-й день и отрицательно – с кумулятивным индексом исследовательской активности на 15-й день, причём обе корреляции пропадают у обработанных крыс. С другой стороны, у обработанных крыс уровень ТДФ в мозге на 25-й день отрицательно коррелирует с локомоторной активностью на 15-й день, тогда как у контрольных крыс эта корреляция отсутствует. Примечательно, что наблюдаемые корреляции согласуются с физиологическими закономерностями. Так, известно, что исследовательская активность выше при низкой тревожности. Соответственно, корреляции контрольных животных показывают, что содержание ТДФ имеет прямую взаимосвязь с тревожностью и обратную – с исследовательской активностью. Аналогично, известно, что локомоторная активность коррелирует с количеством выходов в центральную зону. Соответственно, корреляции обработанных животных показывают, что содержание ТДФ обратно связано с обоими параметрами.

 

Таблица 2. Корреляции уровней ТДФ или активностей ТДФ-зависимых ферментов мозга, измеренных в присутствии (+) или отсутствии (−) ТДФ в реакционной среде, с параметрами ЭКГ или поведения у контрольных (Контроль) и обработанных метформином/ампролиумом (M+A) крыс

Параметр	ТДФ		ПДК–ТДФ		ПДК+ТДФ		ОГДК–ТДФ		ОГДК+ТДФ		ТКТ–ТДФ		ТКТ+ТДФ
	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A	Контроль	M+A
R-R интервал	−0,24	−0,19	0,03	−0,08	0,65	0,06	0,02	−0,19	−0,01	−0,15	−0,22	0,13	−0,09	0,24
dX	−0,37	0,05	0,27	−0,23	0,04	−0,08	0,18	0,02	−0,10	−0,02	−0,75	0,48	−0,50	0,42
RMSSD	−0,10	−0,18	0,02	0,09	0,11	−0,21	0,13	0,29	0,03	0,20	−0,34	0,04	−0,35	−0,01
SI	0,36	−0,06	−0,08	0,34	−0,27	0,21	−0,06	0,03	0,21	0,03	0,60	−0,40	0,38	−0,43
Тревожность, день 8	0,04	−0,02	0,20	0,41	−0,52	0,02	−0,14	−0,20	−0,45	−0,30	−0,37	−0,05	−0,10	−0,06
Тревожность, день 15	0,57	0,02	−0,53	−0,10	0,05	0,27	0,30	−0,05	0,45	−0,01	0,29	−0,38	0,01	−0,24
Тревожность, день 25	−0,16	0,08	0,01	−0,11	0,36	0,14	0,44	0,08	0,14	0,02	−0,59	0,21	−0,39	0,03
Время груминга	−0,04	0,52	−0,15	−0,09	−0,14	−0,40	0,00	0,21	0,10	−0,04	−0,28	0,42	−0,30	0,01
Время замирания	−0,31	−0,19	0,28	−0,14	0,38	0,36	0,47	−0,19	0,15	−0,14	−0,65	0,09	−0,37	0,23
Акты дефекации	−0,44	−0,11	0,14	−0,37	0,28	0,23	0,05	−0,43	−0,07	−0,01	−0,45	0,03	−0,07	0,24
Акты груминга	−0,25	−0,17	0,22	0,04	0,05	−0,05	−0,24	0,18	−0,06	−0,05	−0,27	0,23	−0,19	0,09
Исследовательская активность, день 8	−0,33	−0,46	0,04	−0,28	0,61	0,13	−0,06	0,00	0,15	0,23	0,39	0,07	0,32	0,22
Исследовательская активность, день 15	−0,60	−0,25	0,43	−0,22	0,19	−0,13	−0,34	−0,23	−0,47	−0,22	−0,10	0,22	0,03	0,22
Исследовательская активность, день 25	−0,10	−0,33	0,11	0,21	0,07	0,02	−0,43	−0,25	−0,01	−0,32	0,58	−0,29	0,49	−0,15
Количество стоек	−0,06	0,03	0,25	0,13	0,18	−0,27	−0,45	−0,27	0,01	−0,32	0,63	0,03	0,57	0,09
Количество выходов в центральную зону	−0,38	−0,80	0,09	0,39	0,03	0,55	−0,43	−0,10	−0,34	−0,08	0,12	−0,69	0,20	−0,39
Локомоторная активность, день 8	−0,40	−0,52	0,05	0,20	0,41	0,31	0,08	0,04	0,22	0,16	0,15	−0,32	0,06	−0,06
Локомоторная активность, день 15	−0,26	−0,58	0,21	0,22	−0,36	−0,02	0,02	−0,18	−0,25	−0,34	−0,18	0,16	−0,30	0,23
Локомоторная активность, день 25	−0,05	0,10	0,07	0,00	−0,12	−0,30	−0,61	0,12	−0,24	0,06	0,60	−0,15	0,52	−0,18

Примечание. Каждая ячейка показывает ранговый коэффициент корреляции Спирмена для данной пары параметров. Корреляции, которые достоверны (p < 0,05) лишь в контрольной или обработанной группе, показаны красным цветом на сером фоне. Коэффициенты достоверных корреляций выделены жирным шрифтом. Корреляции с «Локомоторной активностью» и кумулятивными индексами «Тревожность» или «Исследовательская активность» построены по данным, полученным на 8-й, 15-й или 25-й дни; корреляции с другими физиологическими параметрами показаны только для данных, полученных на 25-й день.

 

Из представленных на рис. 5 графиков видно, что на 15-й день тенденции, наблюдаемые для многих физиологических параметров, меняются на противоположные: если параметр в основном снижается с 8-го по 15-й день, он начинает расти с 15-го по 25-й день, и наоборот. Это переключение может иметь как адаптивную, так и патологическую природу. Важность уровней ТДФ для наблюдаемых эффектов подчёркивается тем фактом, что количество выходов в центральную зону является единственным поведенческим параметром, который существенно различается на 25-й день между обработанными и контрольными животными, и в то же время единственным параметром в обработанной группе, который коррелирует с уровнем ТДФ на 25-й день. Достоверные корреляции как содержания ТДФ в мозге, так и активности ТДФ-зависимой ТКТ с количеством выходов в центральную зону на 25-й день (табл. 2) указывают на то, что переключение физиологических процессов на 15-й день, когда разница между экспериментальными группами ещё не проявилась (рис. 5), связано с ТДФ-зависимым метаболизмом мозга.

В конце эксперимента активности ТДФ-зависимых ферментов в основном достоверно коррелируют с параметрами поведения или ЭКГ у контрольных животных, причём эти корреляции пропадают у обработанных животных (табл. 2). То же самое наблюдается и для корреляции между активностью ПДК и исследовательской активностью на 8-й день. У обработанных животных возникает лишь отрицательная корреляция между активностью ТКТ и количеством выходов в центральную зону, отсутствующая у контрольных животных.

В целом, активность эндогенного холофермента ТКТ показывает наибольшее количество достоверных корреляций, как положительных, так и отрицательных, с параметрами поведения или ЭКГ, в основном у контрольных животных (табл. 2).

Изменения метаболической сети мозга крыс после хронического введения метформина/ампролиума, детектируемые по корреляциям биохимических и физиологических параметров. На рис. 6 и 7 показаны паттерны взаимодействия между содержанием метаболитов, активностями ферментов и физиологическими параметрами у контрольных и обработанных крыс. В целом, корреляционные матрицы для контрольных и обработанных животных показывают рост положительных взаимосвязей между содержанием аминокислот мозга и родственных им соединений (группа 5 на рис. 6 и 7) после обработки метформином/ампролиумом. По сравнению с контрольными животными у обработанных наблюдается более чем двукратное увеличение суммарных и средних коэффициентов корреляций, а также количества положительных корреляций между содержанием этих метаболитов (табл. S1 Приложения). Одновременно растёт содержание свободных аминокислот и аммиака в мозге (рис. 4). В совокупности эти результаты свидетельствуют в пользу общей причины повышения содержания различных аминокислот, такой как превалирование деградации белков над их биосинтезом.

 

Рис. 6. Матрицы корреляций физиологических и биохимических параметров у контрольных крыс. Выделенные горизонтальные линии делят параметры на пять групп: (1) параметры ЭКГ, (2) параметры тревожности, (3) параметры исследовательской и локомоторной активностей, (4) активности ТДФ-зависимых ферментов вместе с уровнем ТДФ и (5) уровни NAD+, аминокислот и родственных соединений

 

Рис. 7. Матрицы корреляций физиологических и биохимических параметров после хронического введения метформина/ампролиума. Выделенные горизонтальные линии делят параметры на пять групп: (1) параметры ЭКГ, (2) параметры тревожности, (3) параметры исследовательской и локомоторной активностей, (4) активности ТДФ-зависимых ферментов вместе с уровнем ТДФ и (5) уровни NAD+, аминокислот и родственных соединений

 

Значимые сдвиги в корреляциях между уровнями метаболитов и активностями ТДФ-зависимых ферментов, вызванные введением метформина и ампролиума (табл. 1 и обсуждение выше), сопровождаются изменениями в корреляциях между связанными с ТДФ маркерами патологических состояний. В частности, индуцированное обработкой изменение знака корреляции между содержанием NAD+ и активностью ОГДК сопровождается изменениями достоверности других корреляций с уровнем NAD+. У контрольных животных уровень NAD+ положительно коррелирует с содержанием мочевины и объединёнными уровнями таурина (антиоксиданта) и ФЭА. После обработки эти корреляции замещаются положительными корреляциями между уровнями NAD+ и триптофана либо редокс-потенциала глутатиона (GSH/GSSG), а также достоверной отрицательной корреляцией между уровнями NAD+ и α-аминоадипата. Примечательно, что введение животным метформина/ампролиума вызывает отрицательную корреляцию уровней α-аминоадипата и GSH/GSSG и положительную корреляцию уровней α-аминоадипата и GSSG, при этом обе корреляции отсутствуют у контрольных животных. У контрольных животных наблюдаются достоверные корреляции между содержанием антиоксиданта карнозина и уровнями аммиака (отрицательная), аланина (положительная) или гистидина (положительная). У обработанных животных эти корреляции замещаются достоверными отрицательными корреляциями между уровнем карнозина и уровнем общего глутатиона или активностью ТКТ, а также достоверными положительными корреляциями между содержаниями карнозина и пролина либо цистина. Таким образом, одновременно с изменением взаимосвязей уровней ТДФ или активностей ТДФ-зависимых ферментов с другими параметрами введение метформина/ампролиума изменяет взаимосвязи различных патологических маркеров, таких как маркер окислительного стресса GSSG или маркер диабета α-аминоадипат [3].

Что касается изменений в корреляциях между биохимическими и физиологическими параметрами, обработка метформином/ампролиумом изменяет знак корреляций между содержанием аминокислот и поведенческими параметрами групп 2 и 3. Преимущественно отрицательные корреляции между параметрами тревожности и содержанием аминокислот у контрольных животных становятся преимущественно положительными у обработанных животных. Противоположная ситуация наблюдается для корреляций между содержанием аминокислот и параметрами исследовательской и локомоторной активностей (рис. 6 и 7). Тот факт, что взаимосвязи между аминокислотами мозга и поведенческими параметрами различаются у крыс в разных состояниях, согласуется с необязательностью наличия причинно-следственных связей между коррелирующими параметрами. Тем не менее важно, что соотношения между содержанием аминокислот и поведенческими параметрами групп 2 и 3 противоположны. Это наблюдение соответствует отрицательной взаимосвязи между тревожностью и исследовательской или локомоторной активностями: тревожное животное не склонно ни к движению, ни к исследованию.

Отрицательные корреляции SI (индикатора симпатической активности) с длительностью R-R интервалов и их вариабельностью (dX) демонстрируют базовую физиологическую зависимость: чем ниже симпатическая активность, тем длиннее интервал R-R и выше его вариабельность. Поэтому достоверность этих корреляций сохраняется и после введения метформина и ампролиума. Однако отрицательная корреляция SI с RMSSD, наблюдаемая в контрольной группе, после обработки исчезает. Одновременно положительная корреляция dX с RMSSD у контрольных крыс замещается положительной корреляцией dX с R-R интервалом. Таким образом, хроническое введение метформина/ампролиума влияет на баланс между симпатической и парасимпатической регуляцией, проявляющийся в корреляциях между отдельными параметрами ЭКГ. Эти изменения сопровождаются изменениями корреляций между параметрами ЭКГ и содержанием метаболитов мозга, участвующих в клеточной редокс-регуляции (восстановленный, окисленный и общий глутатион, цистин, цистатионин, таурин + ФЭА), или некоторых других аминокислот (изолейцин, аспартат и треонин) (рис. 6 и 7). Единственная достоверная корреляция R-R интервала с содержанием изучаемых метаболитов – отрицательная корреляция с уровнем восстановленного глутатиона – не меняется под действием метформина и ампролиума.

Таким образом, введение метформина/ампролиума влияет на баланс между симпатической и парасимпатической регуляцией, что связано с изменением взаимных корреляций между параметрами ЭКГ, а также корреляций параметров ЭКГ с уровнями аминокислот в мозге. В свою очередь, изменение баланса симпатической и парасимпатической регуляции проявляется в изменении показателей тревожности. У грызунов замирание (форма поведенческого торможения, также являющаяся показателем тревожности) сопровождается снижением частоты сердечных сокращений [49]. У контрольных животных в нашем исследовании это иллюстрируют положительные корреляции времени замирания с длительностью R-R интервалов и dX, а также отрицательная корреляция времени замирания с SI. Однако только положительная корреляция между временем замирания и dX остаётся достоверной после обработки метформином и ампролиумом. Исчезновение двух других указанных корреляций служит дополнительным подтверждением индуцируемых обработкой изменений в балансе симпатической и парасимпатической регуляции.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе показано, что хроническое введение ингибиторов поступления тиамина в клетку, метформина и ампролиума, нарушает метаболизм аминокислот в мозге крыс. Известно, что дефицит тиамина нарушает окисление BCAA и вызывает другие изменения в метаболизме аминокислот в мозге [6, 7]. Известным, но недооцененным побочным эффектом метформина – широко используемого противодиабетического препарата – является ингибирование транспортеров тиамина. Ампролиум является применяемым в ветеринарии противопаразитарным препаратом, действие которого основано на блокаде транспорта тиамина. Хотя паразиты имеют более высокую чувствительность к такой блокаде, чем их хозяева [50], тиаминовый транспорт животных клеток также может быть затронут в зависимости от дозы. Так, ампролиум используется для моделирования дефицита тиамина у животных и в животных клетках [16, 25]. Поскольку нарушение тиаминового статуса является распространённым сопутствующим заболеванием при диабете, хроническое комбинированное введение метформина и ампролиума в нашей животной модели имитирует эффекты метформина у тех пациентов-диабетиков, у которых имеется недиагностированная тиаминовая недостаточность. Высокая чувствительность нервной системы к нарушениям тиаминового статуса обусловлена, в частности, зависимостью метаболизма аминокислотных нейромедиаторов или их предшественников от тиамина [30, 35, 41, 51]. Эти последствия нарушенного тиаминового статуса в мозге могут влиять на параметры поведения и ЭКГ, обосновывая наш интерес к изучению влияния ингибиторов переносчиков тиамина на метаболизм мозга.

Мы показали, что хроническое введение метформина/ампролиума повышает содержание BCAA в мозге (рис. 4), что согласуется с результатами независимых исследований, показавших нарушение деградации BCAA метформином [4]. Исчезновение достоверных корреляций между уровнями этих аминокислот и активностями ТДФ-зависимых ферментов (табл. 1) у обработанных животных связывает изменения содержания BCAA с перестройками в тиамин-зависимом метаболизме. Тем не менее достоверные изменения измеряемого нами ТДФ при снижении поступления в клетки тиамина под действием метформина и ампролиума не детектируются (рис. 2). Возможно, что отсутствие изменений ТДФ в мозге при снижении поступления тиамина связано с буферной функцией сильного ингибирования тиаминдифосфокиназы её продуктом ТДФ в отношении тканевого содержания ТДФ [52]. Увеличение насыщения ТКТ и ОГДК коферментом на 25-й день эксперимента (рис. 3) предполагает компенсаторную адаптацию ТДФ-связывающих ферментов в ответ на хроническое введение ингибиторов транспорта тиамина. Такие адаптации подтверждаются немонотонными изменениями физиологических параметров в течение эксперимента (рис. 5) и корреляциями этих зависящих от времени параметров с конечными уровнями ТДФ и активностями ТДФ-зависимых ферментов (табл. 2). Помимо содержания ТДФ в тканях, насыщение ТДФ-зависимых ферментов ТДФ может также зависеть от аллостерической регуляции [53] или пост-трансляционных модификаций ферментов [32, 44]. Более высокую степень насыщения ТКТ ТДФ наблюдали и в ряде независимых исследований тиаминового метаболизма при различных патологических состояниях (см. работу Artiukhov et al. [44] и упомянутые там ссылки). Независимо от конкретных молекулярных механизмов, увеличение насыщения ТКТ и ОГДК мозга ТДФ после хронического введения метформина/ампролиума указывает на то, что данные препараты влияют на центральный метаболизм глюкозы как в цитоплазме, так и в митохондриях. Хотя вызванные обработкой изменения средних уровней редокс-индикаторов (рис. 2) и активностей ТДФ-зависимых ферментов (рис. 3) кажутся незначительными, они ассоциированы с индикаторами окислительного стресса (снижение содержания антиоксиданта карнозина и тенденция к повышению содержания GSSG, рис. 2), повышением уровня аммиака и значительными нарушениями метаболизма аминокислот (рис. 4). В результате метформин и ампролиум вызывают изменения в поведении и ЭКГ животных (рис. 5).

Эффекты хронического введения метформина и ампролиума на уровни аминокислот в мозге и их взаимовлияние (рис. 4; табл. S1 Приложения) поразительно похожи на те, которые наблюдаются после острой гипоксии [54]. Оба воздействия повышают содержания свободных аминокислот в мозге и усиливают их положительные корреляции друг с другом. Сходство эффектов этих очень разных воздействий на метаболизм аминокислот в мозге подразумевает сильное нарушение окислительного энергетического обмена не только в случае острой гипоксии, но и после хронического приёма метформина и ампролиума. Поскольку тиамин необходим для окислительного метаболизма, наблюдаемое сходство свидетельствует в пользу зависимости нарушенного метаболизма аминокислот от тиамина после хронического введения метформина и ампролиума, ингибирующего внутриклеточный транспорт тиамина.

Повышенные уровни свободных аминокислот и аммиака, среди которых наибольшее увеличение наблюдается для уровня продукта протеолитической деградации – свободного метиллизина (рис. 4) – указывают на нарушенный гомеостаз белков по окончании введения метформина и ампролиума. Хорошо известный медиатор действия метформина, AMPK, индуцирует аутофагию при нехватке питательных веществ [55–57]. Активирующим аутофагию стресс-сигналом вполне может служить снижение внутриклеточного уровня тиамина на ранних стадиях введения метформина и ампролиума.

Гипераммониемия при нарушениях метаболизма аминокислот и гомеостаза белков часто сопровождается окислительным стрессом [58, 59]. Известно, что пониженная активность ТДФ-зависимых ферментов индуцирует гипераммониемию вследствие недостаточной активности цикла мочевины при дефиците ацетил-CoA и ATP [60]. Вклад ТДФ-зависимого метаболизма в мозговую гипераммониемию, вызванную хроническим введением метформина/ампролиума, подтверждается сильной корреляцией между уровнями ТДФ и NH₃ в мозге животных в конце эксперимента, что не наблюдается у контрольных животных (табл. 1). Увеличение насыщения ОГДК ТДФ в качестве адаптации к пониженному содержанию тиамина может способствовать гипераммониемии, активируя деградацию аминокислот в ЦТК, поскольку ОГДК катализирует скорость-лимитирующий этап цикла. Вызываемые введением метформина/ампролиума изменения взаимосвязей уровней аминокислот в мозге не только с уровнем ТДФ, но и с активностями ТДФ-зависимых ферментов (табл. 1) могут быть результатом «гиперактивации» ОГДК при росте её насыщения коферментом.

Ввиду значимости α-аминоадипата в качестве маркера диабета [3] и деградации этого соединения через метаболический путь, опосредованный ТДФ-зависимой 2-оксоадипатдегидрогеназой [61], следует отметить корреляции между уровнями α-аминоадипата и ТДФ или активностями ТДФ-зависимых дегидрогеназ, индуцированные введением метформина и ампролиума (табл. 1). Активность митохондриального 2-оксоадипатдегидрогеназного комплекса не определяется в присутствии ОГДК по причине гораздо более высокой экспрессии 2-оксоглутаратдегидрогеназы по сравнению с 2-оксоадипатдегидрогеназой в гомогенатах мозга и трансформации обоими комплексами как 2-оксоглутарата, так и 2-оксоадипата [8, 51, 62]. Однако ингибирование 2-оксоадипатдегидрогеназы in vivo соединениями, селективно связывающимися с её активным центром, снижало содержание карнозина и увеличивало содержание β-аланина в мозге крысы [51]. Поскольку те же изменения наблюдаются и после хронического введения метформина/ампролиума (рис. 1 и 4), это позволяет предположить, что индуцированный этими препаратами дефицит тиамина ингибирует 2-оксоадипатдегидрогеназу из-за сниженной доступности ТДФ для насыщения фермента. Такое снижение доступности ТДФ для 2-оксоадипатдегидрогеназы может быть вызвано увеличением сродства ОГДК к ТДФ (рис. 2). Неспособность 2-оксоадипатдегидрогеназы успешно конкурировать с ОГДК за ТДФ подтверждается наличием положительной корреляции между уровнем эндогенной холо-ОГДК и содержанием α-аминоадипата, предшественника субстрата 2-оксоадипатдегидрогеназы, у обработанных, но не у контрольных животных (табл. 1). Эта корреляция показывает, что чем выше активность ОГДК, эндогенно насыщенного ТДФ, тем выше уровень α-аминоадипата в мозге. Другими словами, чем выше активность ОГДК, тем менее эффективно 2-оксоадипатдегидрогеназа катализирует расщепление продукта трансаминирования α-аминоадипата – 2-оксоадипата. Дополнительным свидетельством ингибирования 2-оксоадипатдегидрогеназы после хронического введения метформина/ампролиума могут служить положительная корреляция между уровнями NAD+ и триптофана и отрицательная корреляция между уровнями NAD+ и α-аминоадипата у обработанных, но не у контрольных крыс (рис. 6 и 7). Возникновение данных корреляций хорошо соответствует метаболической роли 2-оксоадипатдегидрогеназы в биосинтезе NAD+ из триптофана [62]. Снижая деградацию триптофана через α-аминоадипат, ингибирование 2-оксоадипатдегидрогеназы должно способствовать альтернативному превращению триптофана в хинолиновую кислоту, которая является интермедиатом биосинтеза NAD+ из триптофана. Таким образом, прямая корреляция уровней NAD+ и триптофана и обратная – между уровнями NAD+ и α-аминоадипата свидетельствуют о том, что хроническое введение метформина/ампролиума увеличивает связанный с уровнями α-аминоадипата и триптофана биосинтез NAD+ в мозге крыс – эффект, согласующийся с ингибированием ТДФ-зависимой 2-оксоадипатдегидрогеназы. Индукция метаболических маркеров дисфункции 2-оксоадипатдегидрогеназы и накопление α-аминоадипата в мозге заслуживает особого внимания ввиду известной связи между уровнями α-аминоадипата в крови или дисфункцией 2-оксоадипатдегидрогеназы и диабетом, ожирением и сердечно-сосудистыми заболеваниями [51].

Изменения биохимии мозга крыс, индуцированные метформином/ампролиумом, связаны с изменениями в их поведении и параметрах ЭКГ. Введение метформина/ампролиума нарушает баланс между симпатической и парасимпатической регуляцией, что очевидно из корреляций между параметрами ЭКГ и временем замирания.

Известно, что ампролиум снижает исследовательскую активность [23], тогда как метформин оказывает анксиолитические и антидепрессивные эффекты [63, 64]. В нашем исследовании комбинированное введение метформина и ампролиума вызывает пограничное снижение тревожности (p = 0,05 для фактора «обработки», рис. 5), сопровождающееся увеличением локомоторной активности, что способствует увеличению числа выходов в центральную зону и кумулятивного индекса исследовательской активности у обработанных животных по сравнению с контрольными. Эти эффекты связаны с зависящим от времени эксперимента ростом числа выходов в центральную зону и частоты сердечных сокращений, наблюдаемым только у обработанных животных (рис. 5). Отсутствие таких изменений у контрольных крыс может свидетельствовать об их лучшей, по сравнению с обработанными крысами, адаптации к повторяющемуся тестированию.

Помимо ингибирования транспорта тиамина, другие механизмы действия метформина, в частности активация AMPK-зависимых сигнальных путей, могут вносить вклад в комплекс биохимических и физиологических эффектов комбинированного введения метформина и ампролиума. Наше исследование подчёркивает условный характер действия метформина. Преимущества приёма метформина могут быть снижены недостаточностью тиамина, которая может развиться у людей из-за различных сопутствующих факторов, включая проблемы с питанием и/или полиморфизмы генов, кодирующих переносчики тиамина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованная модель хронического введения ингибиторов транспорта тиамина, метформина и ампролиума не показала существенных изменений конечных уровней ТДФ и полных активностей ТДФ-зависимых ферментов у обработанных крыс по сравнению с контрольными. Однако немонотонные изменения поведения и ЭКГ обработанных крыс в ходе эксперимента, а также взаимосвязи параметров поведения или ЭКГ с уровнями ТДФ или активностей ТДФ-зависимых ферментов в конце эксперимента предполагают адаптацию к нарушенной в ходе эксперимента доступности тиамина организму животных. После хронического введения метформина/ампролиума можно наблюдать переключение метаболической роли ТДФ и ТДФ-зависимых ферментов с антиоксидантной и азотсберегающей на прооксидантную и гипераммониемическую. Такое переключение сопровождается ростом частоты сердечных сокращений у обработанных, но не контрольных животных и повышением локомоторной составляющей исследовательской активности у обработанных крыс по сравнению с контрольными.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

Вклад авторов. А.В.Г. спланировала и провела эксперименты на животных; А.В.А. измерял активности дегидрогеназ 2-оксокислот; О.Н.С. измеряла активность ТКТ и содержание ТДФ; А.Л.К. количественно определял аминокислоты; А.В.Г., А.В.А. и В.И.Б. анализировали и визуализировали результаты. В.И.Б. разработала концепцию и дизайн исследования, руководила проектом и написала текст статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Государственной темы AAAA-A19-119042590056-2.

Конфликт интересов. Авторы данной работы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Данная работа не содержит исследований с участием людей. Все эксперименты на животных были одобрены Биоэтическим комитетом МГУ имени М.В. Ломоносова (протокол 137-д от 11.11.2022).

作者简介

A. Graf

Lomonosov Moscow State University

Email: bunik@belozersky.msu.ru
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

A. Artiukhov

Lomonosov Moscow State University; Sechenov Medical University

Email: bunik@belozersky.msu.ru
俄罗斯联邦, 119234, Moscow; 105043, Moscow

O. Solovyeva

Lomonosov Moscow State University

Email: bunik@belozersky.msu.ru
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

A. Ksenofontov

Lomonosov Moscow State University

Email: bunik@belozersky.msu.ru
俄罗斯联邦, 119234, Moscow

V. Bunik

Lomonosov Moscow State University; Sechenov Medical University

编辑信件的主要联系方式.
Email: bunik@belozersky.msu.ru
俄罗斯联邦, 119234, Moscow; 105043, Moscow

参考

补充文件