Study of Neuroinflammation in the Rat Hippocampus during Ethanol Exposure and Pharmacologic Correction with Azithromycin: New Data and Future Perspectives

Full Text

Принятые сокращения: АЗМ – азитромицин; TLR – toll-подобные рецепторы.

ВВЕДЕНИЕ

С некоторой периодичностью в свет выходят новые публикации, которые позволяют расширить современные знания о нейровоспалительной теории алкоголизма, которая развивается уже более 20 лет, и ее суть заключается в том, что длительное поступление этанола в организм активирует механизмы нейровоспаления, которые ведут к развитию нейродегенерации в головном мозге и, как следствие, к нарушению согласованного исполнительного контроля над высшими психическими функциями мозга, что усугубляет течение заболевания [1–4]. То, что хроническое поступление алкоголя вызывает гибель нервных клеток, на данный момент мы можем признать установленным фактом [1–8], однако первые наблюдения в этом направлении мы встречаем еще в работах С.С. Корсакова [9]. Позже эти наблюдения были названы синдромом Корсакова (или корсаковский синдром алкогольный), который возникает вследствие хронической алкогольной интоксикации. При данном состоянии развиваются малообратимые нарушения памяти, лекарственная терапия неэффективна, и реабилитация при корсаковском синдроме направлена, прежде всего, на адаптацию больного к жизнедеятельности при ограниченных возможностях памяти [6, 8–10]. В эмоциональном плане у больных могут преобладать эйфория и благодушие или, наоборот, безразличие и вялость [11]. Такой синдром является тяжелым проявлением нейродегенерации, которая может развиваться на фоне хронического поступления этанола в организм, однако в работах последних лет имеются сведения о развитии признаков нейродегенерации при более коротких и легких формах воздействия этанола в эксперименте, т.е. значительно чаще, чем только при корсаковском синдроме алкогольном [8, 9]. Имеется предположение, что такие патогенетические процессы могут стоять на пути перехода от любителей алкоголя (пьянство) к алкоголизму в ранней его стадии, а далее, приводить к более тяжелым формам алкоголизма [8, 9]. Связано это, вероятно, с тем, что гибель клеток в различных структурах головного мозга при хроническом поступлении этанола нарушает согласованную работу головного мозга, внося изменения в психофизиологические механизмы контроля поведения организма, что формирует те симптомы, которые характерны для алкоголизма – непреодолимое желание к употреблению алкоголя, когнитивные и эмоциональные расстройства [1, 2, 12, 13].

Полученные данные при изучении посмертных образцов головного мозга у пациентов с хроническим употреблением алкоголя показали наличие нейровоспалительного процесса, который развивается в коре головного мозга [8, 9]. Такие сведения навели исследователей на предположение о том, что формирование алкогольной зависимости может быть сопряжено не только с дисфункциями в нейромедиаторных и нейропептидных системах, но также опосредовано различными факторами нейровоспаления [8–11]. Система toll-подобных рецепторов (TLR), являясь ключевым звеном врожденного иммунитета, участвует в регуляции синтеза многих факторов воспаления [1, 2, 14, 15]. Она включает в себя эндогенные агонисты TLR (например, Hmgb1 и ряд микроРНК), TLR-рецепторы и внутриклеточные адаптерные белки (в том числе MyD88, TRIF, IRF, NF-κB1 и др.), которые инициируют активацию генов нейровоспаления [1, 2, 14, 15].

Моделирование длительного воздействия этанола как in vitro, так и in vivo позволило получить сведения о том, что система toll-подобных рецепторов действительно реагирует в клетках нервной ткани на поступление этанола – отмечается рост экспрессии генов и белков TLR, их эндогенных агонистов, а также повышается уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов [1–4]. Однако, несмотря на наличие таких сведений, все еще не существует полного понимания того, как оказывает влияние длительно поступающий этанол на данную систему в разных структурах головного мозга. В первую очередь представляют интерес те структуры, которые являются элементами так называемой системы подкрепления и ассоциированы с развитием алкогольной аддикции [16–18]. Одной из таких ключевых структур является гиппокамп [16–18]. Представляется интересным оценить уровень экспрессии элементов системы TLR и связанных с ней молекул в гиппокампе при моделировании длительного воздействия этанола, а также в состоянии отмены этанола и при фармакологической коррекции с помощью азитромицина (АЗМ), который, по данным литературы, зарекомендовал себя эффективным соединением для снижения нейровоспаления [19–22], что и послужило целью нашей работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В эксперименте использовали 56 взрослых самцов крыс породы Вистар (средняя масса тела – 250–300 г, возраст – 3 месяца), которые были приобретены в питомнике «Рапполово» (Россия). Перед началом эксперимента животные были разделены на группы (по 8 животных в каждой группе): контрольная группа, группа длительного воздействия этанола, пять групп животных с отменой длительного воздействия этанола («отмена этанола, 7-е сутки»; «отмена этанола + вода»; «отмена этанола + АЗМ, 40 мг/кг»; «отмена этанола + АЗМ, 80 мг/кг»; «отмена этанола + АЗМ, 160 мг/кг»). Животные получали свободный доступ к стандартному корму для крыс.

Моделирование длительного воздействия этанола и состояния отмены. Способ моделирования был нами использован на основе имеющихся в литературе с некоторыми модификациями [23–25]. Длительное воздействие этанола выполнялось путем внутрижелудочного введения 20%-ного раствора этанола с помощью желудочного зонда из расчета 4 г/кг чистого этанола с понедельника по пятницу в течение 4-х недель (всего 20 введений). Контрольные животные получали эквивалентные объемы воды по такой же схеме. При этом все животные имели свободный доступ к воде. Декапитацию животных производили на последний день алкоголизации через 2 часа после последнего введения этанола (группа «этанол»). Для моделирования состояния отмены этанола животным прекращалось введение этанола, и на 7-е сутки отмены этанола животных выводили из эксперимента (группа «отмена этанола, 7-е сутки»).

Инъекции фармакологических средств. По окончании длительного воздействия этанола животным три дня внутрижелудочно через зонд вводили азитромицин (40 мг/кг, 80 мг/кг, 160 мг/кг; «Хемомицин», порошок для приготовления суспензии для приема внутрь («Hemofarm», Сербия)). Крысам контрольной группы вводили соответствующий объем воды (группа «отмены этанола + вода»). Декапитацию животных производили во всех группах на 7-е сутки отмены этанола.

Забор биоматериала. Границы необходимых структур мозга были определены в соответствии с атласом мозга крысы [26]. Образцы мозга немедленно замораживали и хранили при температуре −80 °C. Кровь извлекали в момент декапитации животных в специально подготовленные пробирки для проведения биохимического и клинического анализа крови.

Анализ крови. Измерение клинических показателей крови проводили в первые 2 часа после ее забора на ветеринарном гематологическом анализаторе («Mindray», Китай). Определение биохимических показателей в сыворотке крови было выполнено по стандартной методике на автоматическом биохимическом анализаторе («Erba mannheim xl-100», Германия).

Выделение РНК из образцов мозга. Выделение тотальной РНК выполняли, используя реагент ExtractRNA («Евроген», Россия), в полном соответствии с инструкцией производителя. Чистоту выделения и концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре Implen NanoPhotometer P330 («Implen», Германия); по отношению А260/А280 (в норме ≥ 1,8) оценивали чистоту выделенного продукта.

ОТ-ПЦР. Синтез кДНК проводили методом обратной транскрипции (ОТ) в 20 мкл с использованием набора реактивов MMLV RT kit («Евроген») в полном соответствии с инструкцией производителя. Перед проведением ОТ для микроРНК было выполнено полиаденилирование микроРНК с помощью поли(A)-полимеразы Escherichia coli («New England Biolabs Inc.», США) по ранее описанной методике [27]. ОТ для микроРНК проводили в 10 мкл с использованием набора реактивов MMLV RT kit и специфического PolyT-адаптера (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3′).

Концентрацию полученной кДНК в ходе ОТ измеряли на спектрофотометре Implen NanoPhotometer P330.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени проводили в амплификаторе Mx3005P («Stratagene», США) в 10 мкл реакционной смеси, содержащей SYBR Green («Евроген») и смесь специфических прямых и обратных праймеров (табл. 1) («Beagle», Россия). Относительный уровень содержания мРНК и miR рассчитывался методом 2ΔΔСt, содержание мРНК нормировали к уровню экспрессии гена Gapdh, уровень miR нормировали к уровню экспрессии гена U6. Все реакции проводили в трех повторах.

 

Таблица 1. Последовательность праймеров

Ген	Праймеры
	Прямой (5′→3′)	Обратный (5′→3′)
Tlr3	AACTGGAGAACCTCCAAGA	CACCCTGGAGAAAACTCTTT
Tlr4	ACTCTGATCATGGCATTGTT	GTCTCAATTTCACACCTGGA
Tlr7	TGAAAATGGTATTTCCAATGTG	TAAGGGTAAGGTTGGTGGTA
Nfκb1	ATACTGCTTTGACTCACTCC	AGGTATGGGCCATCTGTT
Hmgb1	CTCTGATGCAGCTTATACGA	AAAAGACTAGCTTCCCCTTG
Il1β	TGTCTGACCCATGTGAGCTG	TTTGGGATCCACACTCTCCAG
Ccl2	AAGATGATCCCAATGAGTCG	TGGTGACAAATACTACAGCTT
Tnfα	CACGTCGTAGCAAACCAC	TATGAAATGGCAAATCGGCT
Il13	TGTAACCAAAAGGCCTCGGA	TGGCCATAGCGGAAAAGTTG
Tgfβ	GGACTACTACGCCAAAGAAG	GGACTACTACGCCAAAGAAG
Il11	GGGACATGAACTGTGTTTGT	GGTAGGTAGGGAGTCCAGAT
Il6	ACTTCACAAGTCGGAGGCTT	AATTGCCATTGCACAACTCTTTTC
miR-182	TTTGGCAATGGTAGAACTCACACCG	GCGAGCACAGAATTAATACGAC
miR-155-5p	TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT	GCGAGCACAGAATTAATACGAC
miR-96-5p	TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT	GCGAGCACAGAATTAATACGAC
miR-let-7b	GCGGCGGCTATACAACCTACTGC	GCGAGCACAGAATTAATACGAC
U6	TGCTTCGGCAGCACATATAC	AGGGGCCATGCTAATCTTCT
Gapdh	GCCAGCCTCGTCTCATA	GTGGGTAGAGTCATACTGGA

 

Иммуноферментный анализ. Замороженные образцы гиппокампа мозга до проведения иммуноферментного анализа (ИФА) гомогенизировали на криомельнице («CRYOMILL», Китай); далее, полученный замороженный порошок ткани растворяли в 1 мл PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4) и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 g. Собираемые супернатанты аликвотировали по 100 мкл и хранили при −80 °С до проведения ИФА. Измерение белка IL-1β выполнено с помощью коммерческого набора для проведения ИФА («Cloud-Clone Corp.», США) по протоколу. По окончании реакции поглощение измеряли на планшетном фотометре Synergy 2 («Bio Tek», США). Общий белок определяли методом Бредфорда с использованием готового набора Bio-Rad Protein Assay Kit («Bio-Rad», США). Измерение проводили в трех повторах.

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных данных использовалась программа Graph Pad Prizm v.6. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для сравнения групп использовали U-критерий Манна–Уитни для малых независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при значении р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические и клинические показатели крови при длительном воздействии этанола. Для оценки общего состояния организма животных при моделировании длительного воздействия этанола мы посчитали целесообразным оценить биохимические и клинические показатели параметров крови у животных.

Результаты анализа позволили выявить повышенные уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) и альбумина в сыворотке крови у экспериментальных животных (табл. 2). Повышение уровня альбумина может отражать изменения в степени дегидратации организма, что характерно для пациентов с хроническим алкоголизмом, а повышение уровня АЛТ служит признаком возможного поражения гепатоцитов у животных в эксперименте, что также характерно для состояния организма с длительной алкогольной интоксикацией [8, 28, 29].

 

Таблица 2. Показатели биохимического анализа сыворотки крови крыс при длительном воздействии этанола

Показатель	Контроль (n = 8)	Этанол (n = 8)
АЛТ, МЕ/литр	18,63 ± 2,91	28,14 ± 5,64*
Глюкоза, ммоль/литр	4,39 ± 0,43	4,01 ± 1,08
Креатинин, мкмоль/литр	25,43 ± 7,65	28,16 ± 3,58
Мочевина, ммоль/литр	3,48 ± 0,54	4,07 ± 0,36
Альбумин, г/литр	44,87 ± 3,99	55,43 ± 4,86*
АСТ, МЕ/литр	69,53 ± 14,67	64,44 ± 6,35
Общий белок, г/литр	59,30 ± 8,59	67,38 ± 4,48

Примечание. АЛТ – аланинаминотрансфераза; АСТ – аспартатаминотрансфераза; * p ≤ 0,05 – по отношению к контрольной группе.

 

Результаты клинического анализа крови показали снижение уровня лимфоцитов и повышение уровня моноцитов у животных с длительным потреблением этанола (табл. 3).

 

Таблица 3. Показатели клинического анализа крови крыс при длительном воздействии этанола

Показатель	Контроль (n = 8)	Этанол (n = 8)
Лейкоциты, 109/литр	8,52 ± 1,82	6,12 ± 2,22
Нейтрофилы, 109/литр	0,61 ± 0,51	0,98 ± 0,53
Лимфоциты, 109/литр	7,37 ± 2,10	4,01 ± 1,76*
Моноциты, 109/литр	0,5 ± 0,46	1,10 ± 0,69*
Эозинофилы, 109/литр	0,03 ± 0,01	0,04 ± 0,02
Базофилы, 109/литр	0 ± 0,00	0 ± 0,00
Эритроциты, 1012/литр	8,04 ± 0,41	7,73 ± 0,51
Гемоглобин, г/литр	141,5 ± 8,10	145,0 ± 8,74
Гематокрит, %	41,4 ± 1,84	41,9 ± 2,44
Тромбоциты, 109/литр	977,33 ± 156,42	754,01 ± 265,26

Примечание. * p ≤ 0,05 – по отношению к контрольной группе.

 

Данные показатели отражают наличие ответной реакции со стороны иммунной системы, которая вызвана длительным поступлением этанола в организм животных. Повышение уровня моноцитов может отражать наличие в той или иной мере хронического периферического воспалительного ответа, а снижение уровня лимфоцитов может быть показателем общего снижения активности адаптивной иммунной системы, что нередко отмечается в условиях длительного поступления этанола в организм [29–31].

Таким образом, выполненное нами моделирование длительного воздействия этанола на организм привело к ряду изменений в параметрах крови у животных, что является признаком развития патологического состояния. Стоит отметить тот факт, что масса тела животных не имела значимых различий между экспериментальной и контрольной группами животных на протяжении всего эксперимента, а животные, которые проявляли признаки той или иной болезни (например, приобретенная травма в ходе эксперимента), были выведены из эксперимента.

Экспрессия генов цитокинов и генов системы TLR в гиппокампе мозга крыс при длительном воздействии этанола. Длительное воздействие этанола вызвало повышение уровня экспрессии гена Il1β и снижение уровня экспрессии генов Tnfα и Il11 в гиппокампе мозга крыс (рис. 1). Нами не выявлено значимых изменений на уровне мРНК в экспрессии генов Il6, Tgfβ и Il13 (рис. 1). Продукт гена Il1β является ключевым провоспалительным цитокином, и его повышение часто ассоциируют с развитием нейровоспаления. Ранее исследователи указывали на повышение уровня его экспрессии в головном мозге при длительном воздействии этанола [12, 32, 33]. Полученные нами данные о повышенном уровне экспрессии этого гена в гиппокампе мозга крыс при длительном воздействии этанола имеют сходный характер с имеющимися ранее результатами, которые были получены другими исследователями в структурах мозга, а также в гиппокампе, но в других условиях моделирования длительного воздействия этанола [12, 32, 33]. Уровень экспрессии гена Il6 в нашем эксперименте не был изменен в гиппокампе, а экспрессия гена Tnfα снижена (рис. 1). Оба цитокина, по данным последних лет, обладают двойственными эффектами в отношении развития воспалительных событий – при одних состояниях они выступают как провоспалительные, а при других – могут проявлять противонейровоспалительные эффекты [15, 34]. Таким образом, относительно снижения уровня экспрессии гена Tnfα делать однозначные выводы не представляется возможным, здесь потребуются дополнительные наблюдения в будущем.

 

Рис. 1. Содержание мРНК цитокинов в гиппокампе мозга у крыс с длительным потреблением этанола; * p ≤ 0,05 – по отношению к контрольной группе

 

Интересным для нас наблюдением служит сниженная экспрессия гена Il11 (рис. 1). Имеются сведения, что этот цитокин в нервной ткани проявляет противовоспалительные эффекты, что было показано в исследованиях при моделировании различных патологий [35]. Возможно, мы наблюдаем проявление сниженных механизмов сдерживания провоспалительных процессов, которые развиваются на фоне хронического поступления этанола в организм. Сниженный уровень экспрессии гена Il11 может являться одной из причин дисфункций в этих механизмах, и изучение этого цитокина в будущем может позволить найти новую молекулярную мишень для коррекции нейровоспаления. Эти предположения требуют дальнейших исследований.

Кроме цитокинов, мы оценивали экспрессию некоторых генов системы toll-подобных рецепторов. Нами не было выявлено значимых изменений в экспрессии генов Tlr4, Hmgb1 и Nfκb1, однако мы выявили пониженные уровни экспрессии генов Tlr3 и Tlr7 (рис. 2). Ранее в работах исследователей сообщалось о повышении уровня экспрессии гена Tlr7, и это повышение было связано с проявлениями нейродегенеративного процесса [1, 5]. Возможно, получение результата, отличающегося от ранее описанных, характеризует региональную особенность экспрессии данного гена или используемая нами модель длительного воздействия этанола умеренными дозами позволила получить иные сведения.

 

Рис. 2. Относительный уровень содержания мРНК генов системы TLR в гиппокампе мозга крыс с длительным потреблением этанола; * p ≤ 0,05 – по отношению к контрольной группе

 

В предыдущих наших работах также был замечен тот факт, что в условиях длительного воздействия этанола система TLR подвержена минимальным изменениям, однако отмена длительной алкоголизации вызывает резкий дисбаланс в их экспрессии [36–38]. Так, например, подобные результаты мы получили в прилежащем ядре головного мозга крыс в аналогичной модели длительного воздействия этанола [37]. Таким образом, представляется интересным изучение содержания мРНК и белков цитокинов и других компонентов TLR-сигнализации в гиппокампе не только в условиях длительной алкоголизации, но и при отмене.

Изучение содержания микроРНК в гиппокампе головного мозга крыс при длительном воздействии этанола. Анализ относительного содержания молекул микроРНК в гиппокампе головного мозга крыс показал, что miR-let-7b, miR-96 и miR-155 были значимо изменены в группе животных с длительным воздействием этанола – уровень miR-let-7b понизился в 1,8 раза, miR-96 – понизился в 2,8 раза, miR-155 – понизился в 1,9 раза (табл. 4).

 

Таблица 4. Относительный уровень экспрессии микроРНК в гиппокампе мозга крыс в эксперименте, усл. ед.

miR	Контроль (n = 8)	Этанол (n = 8)
miR-let-7b	0,78 ± 0,13	0,43 ± 0,19*
miR-96	1,08 ± 0,34	0,38 ± 0,15*
miR-155	0,96 ± 0,37	0,51 ± 0,25*
miR-182	1,01 ± 0,25	0,79 ± 0,17

Примечание. * p < 0,05 – по отношению к контрольной группе.

 

Исследуемые в работе молекулы miR были нами отобраны из тех соображений, что они имеют функциональную связь с TLR-сигнальными путями [39–43]. Известно, что miR-let-7b является эндогенным агонистом TLR7 [1, 12]. Сообщается, что изменение экспрессии miR-let-7b может иметь функциональную связь с TLR7-сигнальным каскадом реакций [5, 12].

При повышении активности TLR4-сигнализации наблюдается повышение miR-155 в клетках микроглии головного мозга мышей, тогда как у нокаутных мышей по гену Tlr4 (TLR4-KO) этого не отмечается [41]. У мышей TLR4-KO не изменяется содержание miR-96 в коре головного мозга, тогда как длительная алкоголизация у мышей дикого типа снижала уровень miR-96 [42, 43]. Имеются данные на примере miR-182-5p, где сообщается о наличии функциональных взаимодействий кластера miR-183C (в него входят miR-96 и miR-182) с белком TLR4 [42, 43]. Стоит отметить и тот факт, что не только miR-let7b (эндогенный агонист TLR7) был снижен в нашем эксперименте, но и уровень мРНК Tlr7, что вызывает интерес к дальнейшим исследованиям для установления возможной функциональной связи между наблюдаемыми изменениями.

Экспрессия генов цитокинов и генов системы TLR в гиппокампе мозга крыс в условиях отмены длительного воздействия этанола. О состоянии исследуемой нами системы генов в условиях отмены этанола практически ничего не известно. Имеющиеся небольшие сведения в этом направлении в основном получены при моделировании хронических и субхронических форм воздействия этанола либо на следующий день после отмены [2, 13]. В текущем эксперименте мы выполнили анализ экспрессии исследуемых генов через 7 дней после отмены длительной алкоголизации (рис. 3).

 

Рис. 3. Содержание мРНК цитокинов и генов системы TLR в гиппокампе мозга у крыс при отмене этанола; * p ≤ 0,05 – по отношению к контрольной группе

 

Результаты позволили получить сведения о том, что через 7 дней после отмены уровни экспрессии генов Tlr3, Tlr4, Tlr7 и Hmgb1 были повышены, уровень экспрессии гена Nfκb1 не был подвержен изменениям (рис. 3). Наиболее значимое повышение экспрессии было характерно для гена Tlr4. Полученные сведения позволяют сделать предположение о вовлеченности системы toll-подобных рецепторов в патогенетические механизмы в гиппокампе мозга, развивающиеся на фоне длительного поступления этанола в организм. Нами были получены данные, что в группе животных с длительным воздействием этанола уровни экспрессии генов Tlr3 и Tlr7 были понижены (рис. 2), тогда как в условиях отмены этанола наблюдается повышение уровня их экспрессии (рис. 3). Полученные результаты согласуются с теми данными, что были ранее получены исследователями в других структурах головного мозга, а также на аутопсийном материале от пациентов с хронической алкогольной интоксикацией [2, 13, 24]. В серии работ, целью которых служило определение функционального значения таких изменений, были получены сведения о том, что повышение экспрессии генов Tlr4 и Hmgb1 приводит к активации генов провоспалительных цитокинов и, как следствие, к развитию нейровоспаления [12, 13, 24, 33, 41]. Повышение активности генов Hmgb1 и Tlr7 ведет к активации механизмов запрограммированной клеточной гибели в нейрональных культурах (в исследованиях in vitro), т.е. к проявлению признаков нейроденерации [5]. Что касается гена Tlr3, то имеются сведения о том, что активация продукта экспрессии данного гена, эндосомального белка-рецептора TLR3, специфическими агонистами ведет к повышению уровня добровольного потребления этанола у животных [2]. Таким образом, отмеченное нами изменение в экспрессии данных генов свидетельствует о наличии стойких патологических процессов в гиппокампе мозга крыс через 7 дней после отмены этанола, и система исследуемых нами генов участвует в их реализации. Полученные данные еще раз указывают на значимость проведения исследований в этом направлении.

Применение азитромицина для коррекции экспрессии генов цитокинов и генов системы toll-подобных рецепторов в условиях отмены длительного воздействия этанола. Мы представляем результаты своих первых наблюдений, в задачи которых входила оценка экспрессии генов цитокинов и генов системы TLR в гиппокампе мозга крыс в условиях отмены длительного воздействия этанола и при фармакологической коррекции азитромицином. На различных моделях патологических состояний нервной системы АЗМ зарекомендовал себя как эффективный нейропротектор, который снижает уровень факторов воспаления и замедляет процесс гибели нервных клеток [19–22]. Точный механизм остается не известен. Так, например, существуют предположения, что эффект может реализовываться через белковый комплекс NF-κB [19–22], который является ключевым на пути передачи внеклеточных сигнальных путей от TLR [14, 15]. Мы поставили задачу оценить возможное нейропротекторное влияние АЗМ на исследуемую нами систему генов TLR в гиппокампе мозга в условиях отмены длительного воздействия этанола.

В данном исследовании нами также были получены данные по экспрессии генов Tlr3, Hmgb1 и Nfκb1 на 7-е сутки отмены длительного воздействия этанола – экспрессия генов Tlr3 и Hmgb1 повышена, а уровень экспрессии гена Nfκb1 не изменен (рис. 4). Выполненное введение АЗМ позволило скорректировать уровень экспрессии генов Tlr3 и Hmgb1 (рис. 4). По отношению к гену Hmgb1 положительным эффектом обладали все три используемые дозировки препарата, однако по отношении к гену Tlr3 АЗМ в самой низкой дозировке (40 мг/кг) не оказал эффекта (рис. 4). На уровень экспрессии гена Nfκb1 препарат не оказал влияния (рис. 4). Кроме того, мы оценили влияние АЗМ на уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов Il1β и Ccl2 в условиях отмены этанола (рис. 5). Ранее эффект АЗМ исследовали по отношению к этим цитокинам при других патологических состояниях, были получены сведения о способности АЗМ корректировать уровень содержания этих цитокинов [19–22]. В более ранней нашей работе мы также представили результаты наблюдений за экспрессией генов этих цитокинов на 7-е сутки отмены этанола, однако там были получены иные сведения о состоянии их экспрессии – было выявлено повышение уровня экспрессия гена Сcl2, а экспрессия гена Il1β была без значимых изменений [36]. Можем предполагать, что такие расхождения могут быть вызваны разными способами моделирования длительного воздействия этанола. Результаты анализа данного эксперимента показали повышение уровня экспрессии гена Il1β и отсутствие значимых изменений в экспрессии гена Сcl2 (рис. 5). Выполненное введение АЗМ позволило снизить повышенный уровень экспрессии гена Il1β при всех используемых нами дозировках (рис. 5).

 

Рис. 4. Содержание мРНК генов системы TLR в гиппокампе мозга крыс при фармакологической коррекции азитромицином в условиях отмены этанола; * p < 0,05 – по отношению к контрольной группе; # p < 0,05 – по отношению к группе «отмена этанола + вода»

 

Рис. 5. Содержание мРНК цитокинов в гиппокампе мозга крыс при фармакологической коррекции азитромицином в условиях отмены этанола; * p < 0,05 – по отношению к контрольной группе; # p < 0,05 – по отношению к группе «отмена этанола + вода»

 

Уровень белка IL-1β при длительном воздействии этанола, отмене этанола и фармакологической коррекции азитромицином в гиппокампе мозга крыс. Мы сосредоточили свое внимание на измерении уровня белка IL-1β в гиппокампе мозга крыс. Данный белок является ключевым провоспалительным цитокином – при развитии нейровоспаления уровень белка повышается в тканях мозга [1, 2, 13].

Роль белка IL-1β, опосредующего развитие дисфункций со стороны когнитивных и эмоциональных проявлений, исследуется при различных патологиях. Так, в эксперименте у мышей, подвергнутых психосоциальному стрессу, наблюдалось снижение социального взаимодействия и нарушение рабочей памяти, но эти изменения были предотвращены нокаутом Il1r1 (ген белка-рецептора к IL-1), а вирусно-опосредованная селективная делеция Il1r1 в нейронах гиппокампа также показала, что этот рецептор в гиппокампе имеет решающее значение для стресс-индуцированных поведенческих дисфункций. Кроме того, показано даже то, что вызванный стрессом транспорт моноцитов в мозг блокируется нокаутом Il1r1 [44]. В другом исследовании использовали лентивирусную конструкцию для индуцирования гиперэкспрессии IL-1β в дорсальном гиппокампе крыс. Наблюдалось снижение нейрогенеза в гиппокампе наряду со снижением уровня ветвления нейритов на нейронах [45]. Имеются сведения, что провоспалительные цитокины подавляют долговременную потенциацию в гиппокампе, тем самым внося изменения в ключевые механизмы формирования памяти. Используя синаптосомы и культуры нейронов, исследователи выявили, что IL-1β напрямую подавляют пластичность гиппокампа через нейрон-специфические механизмы. В исследовании также сообщается, что IL-1β может подавлять долговременную потенциацию непосредственно в синапсах у мышей [46]. Кроме того, известно, что нейроны гиппокампа экспрессируют высокие уровни IL-1R1 [46]. Эти данные указывают на вовлеченность цитокина в нарушение механизмов функционирования памяти. Имеется еще целый ряд исследований в подтверждение этих предположений, полученных на различных моделях в экспериментах на животных [46].

Результаты нашего исследования показали, что как в группе длительного воздействия этанола, так и в группе отмены этанола на 7-е сутки отмечаются повышенные уровни белка IL-1β (рис. 6). Таким образом, исходя из имеющихся сведений об IL-1β, можем делать выводы, что наблюдаемое нами повышение данного белка в гиппокампе (более чем в 2 раза) при длительном поступлении этанола в организм может быть причиной развития эмоциональных и когнитивных расстройств, а также проблем со стороны функционирования механизмов памяти.

 

Рис. 6. Содержание белка IL-1β в гиппокампе мозга крыс; * p < 0,05 – по отношению к контрольной группе; # p < 0,05 – по отношению к группе «отмена этанола + вода»

 

Кроме того, в эксперименте нами были применены две дозировки азитромицина для проверки его эффективности в отношении коррекции содержания белка IL-1β. Использование азитромицина в дозировке 40 мг/кг не оказало значимого эффекта, но в дозировке 160 мг/кг снизился уровень белка (почти до уровня контрольных значений), как по отношению к группе отмены этанола, так и по отношению к группе длительно алкоголизированных животных (рис. 6). При этом выполненный нами анализ на уровне мРНК показал эффективность при обоих использованных дозировках (40 мг/кг и 160 мг/кг) препарата (рис. 5). Таким образом, дозировка 40 мг/кг, которая достаточна для снижения уровня экспрессии гена Il1β, является недостаточной для снижения уровня белкового продукта. Наблюдаемый эффект может быть опосредован влиянием азитромицина на механизмы созревания или деградации белка IL-1β. Белок IL-1β образуется в ходе протеолиза из своего предшественника про-IL-1β, и, несмотря на наблюдаемое нами снижение уровня продуктов транскрипции его гена в конкретный момент времени, повышенный уровень белка IL-1β может поддерживаться за счет его образования из молекул про-IL-1β в ходе посттрансляционных механизмов. Кроме того, известно, что механизмы деградации белка IL-1β также имеют сложный путь регуляции, которая опосредуется, в частности, белками матриксными металлопротеиназами [47, 48]. В будущем представляется интересным исследовать возможный вклад азитромицина в регуляцию путей, направленных на скорость деградации белка IL-1β. Можем предположить, что наблюдаемое сохранение повышенных уровней белка IL-1β при снижении уровня экспрессии его гена может быть объяснено активацией путей, ведущих к снижению скорости деградации белка. Имеются корреляционные данные в динамике, которые также свидетельствуют о наличии в расхождении со временем в уровнях мРНК и белка IL-1β – при снижении уровня мРНК наблюдается тенденция к повышению уровня его белка [49].

Резюмируя полученные результаты по содержанию белка ключевого провоспалительного цитокина IL-1β, мы наблюдаем наличие элементов нейровоспаления в гиппокампе мозга крыс при длительном воздействии этанола и при его отмене. Используемое нами соединение азитромицин, как и в работах других исследователей, при определенных дозировках обладает положительным эффектом в отношении снижения уровня нейровоспалительного медиатора IL-1β.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненное нами моделирование длительного воздействия этанола умеренными дозами вызвало ряд изменений как в биохимических (повышение уровня АЛТ и альбуминов), клинических (повышение уровня моноцитов и снижение уровня лимфоцитов) параметрах крови, так и в системе нейровоспаления в гиппокампе мозга крыс. Мы анализировали уровень активности генов системы toll-подобных рецепторов, а также функционально связанные с этой системой молекулы микроРНК (miR-let-7b, miR-96, miR-155, miR-182) и цитокины. Длительная алкоголизация послужила причиной повышенных уровней мРНК и белка цитокина IL-1β, пониженных уровней мРНК Tnfα, Il11, Tlr3 и Tlr7. На 7-е сутки отмены этанола сохраняется повышенный уровень мРНК и белка цитокина IL-1β, а также уровень мРНК Hmgb1. Уровень мРНК Tlr3 при отмене этанола, напротив, был повышен. Выполненное пероральное введение азитромицина позволило скорректировать некоторые биохимические изменения, развивающиеся при отмене этанола – были снижены повышенные уровни мРНК Il1β, Tlr3 и Hmgb1, а при более высоких дозировках было достигнуто снижение повышенного уровня белка IL-1β в гиппокампе мозга крыс. Содержание miR-let-7b, miR-96, miR-155 было понижено в гиппокампе в результате длительной алкоголизации. Данные молекулы функционально связаны с TLR, и изменения в их содержании могут отражать или опосредовать (что первично, на данный момент не установлено) дисфункции в молекулярных механизмах функционирования toll-подобных рецепторов.

Изучение биохимических изменений в гиппокампе головного мозга крыс при моделировании длительного воздействия этанола и состояния отмены представляет большой интерес по причине наличия у пациентов с алкогольной аддикцией нарушений в механизмах запоминания и в эмоциональном спектре. Гиппокамп в этих процессах играет, несомненно, значимую роль, а оценка биохимических изменений может позволить получить новые сведения, которые пополнят понимание патофизиологических механизмов, развивающихся в этой структуре мозга при длительном поступлении этанола в организм.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: М.И. Айрапетов, С.О. Ереско, С.А. Шамаева, Е.Р. Бычков – получение и анализ данных, подготовка и написание статьи; А.А. Лебедев, П.Д. Шабанов – разработка общей концепции исследования, подготовка финальной версии статьи.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «ИЭМ» FGWG-2024-0015: «Нейробиологические механизмы патогенеза социально-значимых заболеваний и посттравматических расстройств. Новые подходы к моделированию патологических процессов и коррекции нарушений».

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам учреждения, в котором проводились исследования, и утвержденным правовым актам РФ и международных организаций. Работа рассмотрена и одобрена Этическим комитетом в области исследований на животных СПбГУ (заключение № 131-03-8 от 29.04.2024 г.).

About the authors

M. I. Airapetov

Institute of Experimental Medicine; Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg; 194044, Saint Petersburg

S. O. Eresko

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics

Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg; 197022, Saint Petersburg

S. A. Shamaeva

Institute of Experimental Medicine

Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg

E. R. Bychkov

Institute of Experimental Medicine

Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg

A. A. Lebedev

Institute of Experimental Medicine

Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg

P. D. Shabanov

Institute of Experimental Medicine; Kirov Military Medical Academy

Email: interleukin1b@gmail.com
Russian Federation, 197376, Saint Petersburg; 194044, Saint Petersburg

References

Supplementary files