Characterization of Structural Properties and Antimicrobial Activity of Complement System C3f Peptide

Full Text

Принятые сокращения: АМП – антимикробные пептиды; HNP – α-дефенсины человека.

ВВЕДЕНИЕ

Комплемент, центральное гуморальное звено врожденного иммунитета, участвует в опсонизации патогенов, стимуляции клеточного ответа, оказывает прямой бактерицидный эффект. Хотя последний обычно связывают с действием мембраноатакующего комплекса [1–3], возрастает объем сведений о том, что антимикробной активностью могут обладать и другие продукты активации комплемента. Ввиду локального характера их генерации вблизи таргетных клеток их эффекты могут вносить вклад в инактивацию патогенов [4].

Наряду с системой комплемента важными эффекторными молекулярными факторами врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП) [5, 6]. АМП привлекают внимание как перспективные противоинфекционные агенты в условиях неуклонно растущей антибиотикорезистентности. Большинство АМП характеризуется положительным зарядом и пространственным разобщением катионных и гидрофобных аминокислотных остатков. Наиболее распространенный механизм действия АМП состоит во взаимодействии с отрицательно заряженными мембранами патогенов, приводящем к повышению их проницаемости и утечке жизненно важных компонентов из клетки [7, 8]. Представителями основных АМП человека являются α-дефенсины (HNP; human neutrophil peptides), β-дефенсины, гистатины, кателицидин LL-37, дермцидин, а также пептиды, известные в первую очередь по другим функциональным активностям (например, хемокины и гепсидин). В роли АМП могут также выступать производные некоторых из этих и других пептидов и белков [9]. Среди подходов к классификации АМП целесообразно подчеркнуть разделение на классы α-спиральных, β-структурных, включающих и α-, и β-структуры, неструктурированных АМП, а также выделение АМП, обогащенных той или иной аминокислотой [10].

В литературе отмечен функциональный параллелизм комплемента и АМП [11]. Система комплемента сама по себе является продуцентом АМП, в качестве которых могут функционировать C3a и C4a [12, 13]. В настоящей работе мы стремимся уточнить это представление. Ключевой этап в развертывании каскада комплемента – конвертация белка C3 с образованием анафилатоксина C3a и белка C3b. После ковалентной фиксации к поверхностным молекулам клеток за счет содержащейся в белке высокореактивной тиоэфирной связи C3b может участвовать в дальнейшей деятельности комплемента. Однако, связавшись с хозяйской клеткой, содержащей CD35, CD46 или привлекающей циркулирующий фактор H, C3b инактивируется фактором I. Эта протеаза при участии названных кофакторов вносит два разрыва в полипептидную цепь белка, образуя iC3b и высвобождая пептид C3f (SSKITHRIHWESASLLR; ~2 кДа) [14, 15]. В аминокислотной последовательности C3f обращает на себя внимание наличие двух остатков гистидина (11,8% от общего числа аминокислотных остатков), что потенциально может быть важным для реализации его функциональной активности. Хотя некоторые эффекты, оказываемые пептидом C3f, были описаны [16–19], его собственная физиологическая роль остается неясной. Аминокислотный состав и физико-химические свойства С3f в целом соответствуют характеристикам типичных АМП. Ранее методом радиальной диффузии мы впервые показали умеренную антимикробную активность C3f в отношении некоторых грамположительных бактерий. Самым чувствительным объектом оказалась Listeria monocytogenes (минимальная ингибирующая концентрация – 70 мкМ) [20]. Активность пептида исследовалась в среде с низкой ионной силой и нейтральным рН, что не соответствует условиям in vivo, в частности, в очаге воспаления. Среди факторов, которые могут влиять на активность АМП в очагах воспаления, можно отметить слабокислые значения pH [21, 22]. Также важную роль может играть и наличие в среде катионов металлов, в частности цинка. Изменение концентрации ионов цинка может быть разнонаправленным. Хотя воспаление инфекционной природы сопровождается снижением уровня ионов цинка в циркуляции на 30–40% [23, 24], некоторые данные свидетельствуют о том, что возможно, напротив, повышение концентрации цинка в сайтах локализации патогенных бактерий [25].

С учетом значимости электростатических взаимодействий в реализации антимикробных свойств АМП ионная сила способна существенно влиять на их активность [26]. Кроме того, значение рН среды модулирует активность АМП за счет протонирования/депротонирования α-аминогруппы, α-карбоксильной группы, боковых групп аминокислотных остатков [27]. Важная роль принадлежит остаткам гистидина, значение pK_a боковой группы которого сопоставимо с pH внутренней среды организма [28]. Повышение антимикробной активности при снижении рН было описано для таких гистидин-содержащих АМП, как гистатины слюны человека [29, 30], гепсидин человека и его укороченная изоформа [31], фрагменты тромбина [32], пептиды Gad-1 и Gad-2 из атлантической трески Gadus morhua [33], ченсинин-1 из дальневосточной лягушки Rana chensinensis [34] и др.

Взаимодействие с ионами металлов также способно модулировать активность АМП [35]. Особенно часто встречаются примеры усиления активности АМП в присутствии ионов цинка. Взаимоотношения между АМП и Zn²⁺ могут реализовываться посредством образования комплекса либо взаимодействия без образования координационных связей [36]. В ряде случаев ключевую роль в координации ионов Zn²⁺ играют остатки гистидина [37, 38]. Повышение антимикробной активности в присутствии ионов цинка было показано для гистатина-5 [39], фрагментов кининогена [39] и семеногелинов [40] человека, клаванина A из асцидии Styela clava [41] и других гистидин-содержащих пептидов. Наличие двух остатков гистидина в структуре C3f позволяет предположить влияние pH и Zn²⁺ на его антимикробную активность.

Поскольку пространственная структура пептида C3f и его физиологическая роль остаются не исследованными, целью настоящей работы было охарактеризовать структурные свойства и антимикробную активность C3f в различных условиях. В ходе работы антимикробную активность пептида исследовали в условиях, которые могут соответствовать условиям очага воспаления (значения pH в слабокислой области, присутствие катионов двухвалентных металлов), где происходит активация комплемента и образуется C3f. Чтобы оценить роль остатков гистидина в антимикробной активности C3f, наряду с этим пептидом были исследованы также его аналоги с заменами гистидинов лизинами или серинами. Поскольку при различных значениях pH боковая группа гистидина может быть положительно заряженной или незаряженной, в качестве замещающих аминокислот были использованы лизин (катионная боковая группа) и серин (незаряженная гидрофильная боковая группа). Включение в работу аналогов пептида с замененными остатками гистидинов позволяло оценить их функциональную роль, в частности, в предполагаемом взаимодействии C3f с ионами цинка и зависимости его антимикробной активности от pH.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды. Пептид C3f и его аналоги с замененными остатками гистидина, C3f[H/K] и C3f[H/S], получали методом твердофазного синтеза по ортогональной Fmoc/tBu (флуоренилметилоксикарбонил/трет-бутил) стратегии по стандартному протоколу [42]. Для синтеза использовали смолу Ванга с предварительно связанной С-концевой аминокислотой («Iris Biotec», Германия) и Fmoc-производные аминокислот («Iris Biotec»).

Удаление примесей и аналитический контроль чистоты пептидов проводили с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) в градиенте ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Препаративную ОФ ВЭЖХ проводили на колонке Waters Symmetry С-18, 300 × 19 мм, 7 мкм («Waters Corp», США), аналитическую – на колонке Luna С-18, 250 × 4,6 мм, 5 мкм («Phenomenex Inc.», США). Соответствие расчетной и фактической молекулярной массы пептидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии с времяпролетным детектором на основе матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI TOF; matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) на приборе Ultraflex («Bruker», Германия).

Тотальную фракцию HNP получали из лейкоцитов человека, как описано ранее [20].

Спектроскопия кругового дихроизма (КД). Для определения вторичной структуры пептида С3f при отсутствии и в присутствии ZnCl₂ измеряли спектры КД на приборе Chirascan («Applied Photophysics», Великобритания). Концентрация C3f в пробах была 0,19 мг/мл (94 мкМ); концентрация ZnCl₂ – 113 мкМ (соответствует 20%-ному молярному избытку ионов цинка по отношению к пептиду); в качестве растворителя использовали деионизованную воду. В ходе оптимизации условий измерения выбрали следующие параметры: кювета с длиной оптического пути 0,5 мм; диапазон измерений – 180–260 нм с шагом 1,0 нм; усреднение по 5 спектрам для каждого образца; время накопления – 1,0 с на точку; ширина спектральной щели – 1,0 нм. После регистрации спектры усредняли, фон вычитали, спектры конвертировали в единицы молярного коэффициента экстинкции Δε (М−1·см−1). Для деконволюции спектров применяли алгоритм BeStSel, имплементированный на одноименном сервере (https://bestsel. elte.hu/index.php) [43].

Определение антимикробной активности. Антимикробную активность пептидов и катионов металлов исследовали в отношении следующих микроорганизмов: грамположительные бактерии Listeria monocytogenes EGD, Micrococcus luteus A270, Staphylococcus aureus ATCC 25923; грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa ATCC 27583, Escherichia coli ESBL 521/17 (клинический изолят из мочи). В работе использовали штаммы St. aureus и Ps. aeruginosa из коллекции отдела молекулярной микробиологии Института экспериментальной медицины, Санкт-Петербург; культуры остальных микроорганизмов были любезно предоставлены проф. Р. Лерером, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, США (L. monocytogenes), д.б.н. С.И. Чернышом, Санкт-Петербургский государственный университет (M. luteus), д.б.н. А.Г. Афиногеновой, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург (E. coli).

Для определения антимикробной активности использовали метод подсчета колоний [44]. Инокулят объемом 20 мкл содержал суспензию бактерий в логарифмической (L. monocytogenes, M. luteus, St. aureus, Ps. aeruginosa) или стационарной (E. coli) фазе роста (конечная концентрация – ~1 × 10⁴ колониеобразующих единиц на 1 мл) и исследуемые вещества в рабочем буфере. При изучении зависимости антимикробной активности от pH в качестве рабочего буфера использовали 10 мМ натрий-фосфатный буфер с различными значениями pH в диапазоне 4,5–8,0; в остальных экспериментах – 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4). Если не указано иное, концентрация ионов металлов в пробах превосходила концентрацию пептидов в 1,2 раза. Инкубацию проводили в круглодонном 96-луночном планшете («Sarstedt», Германия) при +37 °C в течение часа с перемешиванием на шейкере. По окончании инкубации по 10 мкл содержимого лунок смешивали с 2 мл расплавленной среды Trypticase soy agar («Himedia», Индия), термостатированной при +45 °C, в чашках Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали в течение ночи (+37 °C), затем подсчитывали число выросших колоний. Выживаемость бактерий выражали в % от числа колоний, соответствующих контрольным пробам без добавления пептидов и ионов металлов.

Нарушение структурной целостности бактериальной оболочки в присутствии пептидов оценивали с помощью окрашивания клеток йодидом пропидия, образующего флуоресцирующий комплекс с нуклеиновыми кислотами, но не способного проникать через интактные мембраны [45, 46]. В лунки плоскодонного планшета («Jet Bio-Filtration», Китай) вносили суспензию бактериальных клеток (L. monocytogenes или Ps. aeruginosa в логарифмической фазе роста; конечная концентрация – ~2,5 × 107 колониеобразующих единиц на 1 мл) и раствор пептида в 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4); общий объем – 100 мкл. Планшет инкубировали при +37 °C в течение часа с перемешиванием на шейкере, затем добавляли 2 мкл 750 мкМ раствора йодида пропидия и инкубировали при комнатной температуре еще 15 мин. Флуоресценцию измеряли на приборе SpectraMax Gemini EM («Molecular Devices», США), длина волны возбуждения – 535 нм, эмиссии – 615 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции вычитали значение фоновой флуоресценции йодида пропидия в буфере и выражали их в процентах по отношению к пробе с положительным контролем. Для получения этой пробы к бактериальным клеткам добавляли изопропанол до конечной концентрации 50% и инкубировали в течение часа. Перед внесением в планшет и добавлением йодида пропидия контрольную пробу центрифугировали и ресуспендировали осадок в 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4).

Обработка данных и программное обеспечение. При определении антимикробной активности в каждой серии экспериментов проводили не менее трех независимых опытов. Данные обрабатывали c помощью языка R v4.3.0 в интегрированной среде разработки RStudio v2023.03.0. Для визуализации данных использовали пакеты ggplot2 v3.4.2 и ggpubr v0.6.0. На рисунках результаты представлены в виде экспериментальных точек и среднего арифметического.

Теоретическую моноизотопную молярную массу пептидов рассчитывали при помощи сервера Peptide Mass Calculator (https://www.peptidesynthetics.co.uk/tools/). Для расчета заряда пептидов при различных значениях pH использовали пакет Peptides v2.4.5 [47]. Трехмерную структуру белка C3 [48] визуализировали с помощью программы Visual Molecular Dynamics v1.9.3 (https:// www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) [49]. Предсказание наличия и положения β-поворота в молекуле пептида осуществляли при помощи сервера NetTurnP (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetTurnP-1.0/) [50].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез пептидов. Перечень синтезированных пептидов, их первичные структуры и характеристики приведены в табл. 1. Результаты аналитической ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа приведены на рис. П1 и П2 в Приложении.

 

Таблица 1. Синтезированные пептиды и их характеристики

Пептид	Первичная структура	Молярная масса, г/моль	Молярная масса, MALDI, г/моль	Чистота, %
C3f	SSKITHRIHWESASLLR	2020,09	2021,06	97,34
C3f[H/K]	SSKITKRIKWESASLLR	2002,16	2003,22	97,18
C3f[H/S]	SSKITSRISWESASLLR	1920,03	1920,99	98,95

Примечание. Молярная масса – теоретическая моноизотопная молярная масса пептида; молярная масса, MALDI – моноизотопная молярная масса однозарядного иона (М + Н)+, экспериментально определенная масс-спектрометрией. Чистоту препаратов пептидов определяли с помощью ОФ ВЭЖХ.

 

Структурная характеристика C3f. Результаты спектроскопии КД показали, что спектры образцов С3f при отсутствии и в присутствии ZnCl₂ имеют одинаковую форму (рис. 1).

 

Рис. 1. Спектры КД пептида С3f при отсутствии и в присутствии ZnCl₂

 

Оценка компонентов вторичной структуры С3f по спектральным данным алгоритмом BeStSel показала, что пептид содержит антипараллельный β-складчатый слой, но значительная часть молекулы представлена неупорядоченной структурой. При сравнении спектров пептида при отсутствии и в присутствии ионов цинка изменения содержания структурных элементов не наблюдается (табл. 2). С учетом длины пептида (17 а.о.) можно утверждать, что молекула C3f содержит антипараллельную β-шпильку, включающую по 3 а.о. в каждом из тяжей, соединенных β-поворотом из 4 а.о.; остальные 7 а.о. участвуют в формировании неупорядоченных структур.

 

Таблица 2. Количественная оценка содержания элементов вторичной структуры C3f (в %) при отсутствии и в присутствии ZnCl₂ с помощью алгоритма BeStSel

Тип вторичной структуры	С3f без ZnCl2	С3f в присутствии ZnCl2
α-Спираль	0	0
Антипараллельный β-лист	33,8	35,5
Параллельный β-лист	0	0
β-Изгиб	22,1	22,1
Неупорядоченные структуры	44,1	42,5

 

По результатам предсказания β-изгиба сервером NetTurnP можно предположить, что антипараллельная β-шпилька локализуется в C-концевом участке пептида, а β-поворот с наибольшей вероятностью приходится на область WESAS (табл. П1 в Приложении). N-Концевой участок пептида образует неупорядоченные структуры. Предположительное расположение элементов вторичной структуры в полипептидной цепи C3f представлено на рис. 2.

 

Рис. 2. Предполагаемая вторичная структура C3f

 

Антимикробная активность пептидов в различных условиях. В предшествующей работе наиболее чувствительными к антимикробному действию C3f бактериями оказались L. monocytogenes и M. luteus [20]. В настоящем исследовании мы расширили спектр исследованных микробов и обнаружили активность C3f против St. aureus и Ps. aeruginosa, как минимум не уступающую активности против L. monocytogenes (рис. 3, а; рис. 4, б). Тем не менее из четырех перечисленных видов бактерий только L. monocytogenes оказалась устойчивой к действию ионов Zn2+, а также ионов Cu2+ (рис. 3, б; рис. 4, а). Поэтому именно L. monocytogenes была выбрана в качестве основного объекта для исследования антимикробной активности пептида в различных условиях, включая присутствие ионов металлов.

 

Рис. 3. Антимикробная активность пептида C3f и ионов цинка в отношении M. luteus, St. aureus и Ps. aeruginosa. а – Выживаемость бактерий в присутствии C3f; б – выживаемость бактерий в присутствии Zn²⁺

 

Рис. 4. Антимикробная активность C3f и его аналогов в отношении L. monocytogenes при отсутствии и в присутствии ионов металлов. а – Выживаемость бактерий в присутствии Zn²⁺ и Cu²⁺; б – действие C3f в зависимости от присутствия Zn²⁺ и 0,15 М NaCl; в – действие C3f при различном молярном избытке Zn²⁺; г – действие C3f в зависимости от присутствия Cu²⁺; д и е – действие C3f[H/S] и C3f[H/K] при отсутствии и в присутствии Zn²⁺

 

При отсутствии ионов цинка пептид C3f проявлял антимикробную активность в отношении L. monocytogenes, зависящую от концентрации, причем в присутствии 16 мкМ пептида выживаемость бактерии составляла около половины от контрольного уровня, а в присутствии 32 мкМ она была близка к нулю. Активность C3f в присутствии 20%-ного молярного избытка Zn²⁺ заметно усиливалась: 2-кратное снижение выживаемости достигалось уже в присутствии 4 мкМ пептида, а при 16 мкМ наблюдалась почти полная утрата жизнеспособности бактерии. Добавление в буфер 0,15 М NaCl полностью ингибировало антимикробную активность C3f независимо от присутствия Zn²⁺ (рис. 4, б). Увеличение концентрации Zn²⁺ до 4-кратного и 8-кратного молярного избытка по отношению к пептиду не приводило к усилению антимикробной активности C3f в большей степени, чем в присутствии 20%-ного избытка ионов цинка (рис. 4, в). В отличие от Zn2+, ионы Cu2+ влияния на антимикробное действие C3f не оказывали (рис. 4, г).

Пептид C3f[H/S] обладал сопоставимой с исходным пептидом активностью в отношении L. monocytogenes. Несмотря на отсутствие остатков гистидина в структуре пептида, ионы Zn²⁺ заметно усиливали его активность (рис. 4, д). Пептид C3f[H/K] проявлял более выраженное антимикробное действие: почти полное ингибирование роста бактерий достигалось уже при 8 мкМ пептида. Ионы Zn²⁺ также в некоторой степени усиливали его действие (рис. 4, е).

Бактерия E. coli ESBL 521/17, так же как M. luteus, St. aureus и Ps. aeruginosa, проявляет чувствительность к ионам цинка, но при этом она устойчива к действию самого C3f. ZnCl₂ в концентрациях 20–80 мкМ приводил к выраженному снижению выживаемости бактерии, однако присутствие C3f противостояло этому эффекту (рис. 5).

 

Рис. 5. Антимикробное действие ZnCl₂ в отношении E. coli ESBL 521/17 при отсутствии и в присутствии 20%-ного молярного избытка C3f

 

Зависимость антимикробной активности пептидов в отношении L. monocytogenes от pH исследовали в диапазоне значений pH 4,5–8,0. По результатам предварительных экспериментов в этих условиях бактерия обладает одинаковой выживаемостью (данные не показаны). Характер зависимости антимикробной активности C3f в отношении L. monocytogenes от значения pH буферного раствора оказался противоположным ожидаемому. В концентрации 16 мкМ пептид не проявлял усиления антимикробной активности при снижении pH от 8,0 до 6,0. В более высоких концентрациях (32 и 64 мкМ) пептид приводил к почти полному ингибированию роста бактерии в диапазоне pH 5,5–8,0, однако при pH 5,0 бактерия оказалась резистентной к действию C3f; некоторое снижение устойчивости наблюдали при pH 4,5 (рис. 6, а). Предположив, что такой результат принципиально может быть обусловлен особенностями либо антимикробного действия пептида, либо L. monocytogenes как модельного объекта, провели две серии опытов. В первой серии (рис. 6, б) протестировали действие АМП, отличающихся от C3f по структуре, а именно HNP. Во второй – протестировали действие C3f против другого объекта – M. luteus (рис. 6, в). Оказалось, что L. monocytogenes похожим образом обладает устойчивостью к действию HNP при pH 6,0 с дальнейшим снижением устойчивости при pH 5,0. M. luteus оказался более чувствительным к кислотности среды сам по себе, из-за чего не проводили эксперименты с ним при pH ниже 6,0. Против M. luteus C3f действовал ожидаемым образом, то есть его активность была заметно выше при более низких значениях pH, чем при более высоких. Такую закономерность четко наблюдали для концентраций 16–64 мкМ, а для 128 мкМ пептида выявили почти полное ингибирование роста при всех трех значениях pH, хотя и в этой концентрации активность была несколько снижена при pH 8,0.

 

Рис. 6. Антимикробная активность пептидов при различных значениях pH. а – Действие C3f в отношении L. monocytogenes; б – действие HNP в отношении L. monocytogenes; в и г – действие C3f и C3f[H/K] в отношении M. luteus

 

Пептид C3f[H/K] также был более активен в отношении M. luteus при более низких значениях pH (рис. 6, г). Вместе с тем зависимость его активности от pH оказалась менее выраженной по сравнению с исходным пептидом. В частности, C3f в концентрации 32 мкМ приводил к почти полному ингибированию роста бактерий при pH 6,0 и к выживаемости ~70% бактерий при pH 8,0, в то время как для 16 мкМ более активного C3f[H/K] при тех же значениях pH наблюдали 10%-ную и 50%-ную выживаемость бактерий (рис. 6, в и г).

При действии C3f на L. monocytogenes и Ps. aeruginosa происходит дезинтеграция бактериальных мембран, поскольку в экспериментах с использованием йодида пропидия наблюдалось зависящее от концентрации повышение интенсивности флуоресценции в пробах, содержащих 16–128 мкМ пептида (рис. 7). Пептид C3f[H/K] приводил к более выраженному усилению флуоресценции в пробах с L. monocytogenes по сравнению с C3f. При отсутствии бактериальных клеток пептиды, взятые в максимальных концентрациях, не приводили к усилению сигнала (данные не показаны).

 

Рис. 7. Действие пептидов на проницаемость мембран бактериальных клеток, выявляемое по флуоресценции комплекса йодида пропидия с нуклеиновыми кислотами

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Пептид C3f не обладает однозначно установленными физиологическими функциями, и, вероятно, по этой причине не привлекает большого внимания исследователей. Насколько нам известно, в настоящей работе пространственная структура C3f была экспериментально исследована впервые. В предшествующей работе, основываясь на предсказании in silico, мы предположили α-спиральную конформацию C3f [20], однако анализ структуры пептида методом спектроскопии КД не выявил участков α-спирали в молекуле. Результаты показывают, что пептид содержит участок с неупорядоченной структурой и антипараллельную β-шпильку (табл. 2), локализованные, по всей видимости, в N- и C-концевых частях молекулы соответственно (рис. 2). Нельзя исключать, что расхождения между данными моделирования и спектроскопии КД объясняются зависимостью структуры пептида от условий (растворитель, липидное окружение, концентрация, олигомеризация). Известно, что многие АМП, имеющие неупорядоченную структуру в водных растворах, приобретают конформацию α-спирали при контакте с липидными мембранами [51].

Склонность аминокислотной последовательности C3f к формированию β-складчатой структуры косвенно подтверждается конформацией участка полипептидной цепи белка C3, соответствующего пептиду. Этот участок занимает позиции 1282–1298 в пределах преимущественно β-структурного домена CUBf α-цепи молекулы C3. Остатки SSK переходят в тяж ITHRIH поверхностного антипараллельного β-слоя, за которыми следует линкерная последовательность WESASL, а остатки LR, соответствующие C-концу C3f, входят в состав тяжа, принадлежащего другому, более глубокому, антипараллельному β-слою. Таким образом, в составе C3 β-складчатая структура не формируется за счет водородных связей между остатками, составляющими сам фрагмент C3f (рис. П3 в Приложении).

Наше предположение о способности пептида C3f связывать ионы цинка не получило экспериментального подтверждения методом спектроскопии КД: присутствие Zn2+ не оказывало заметного влияния на конформацию пептида (рис. 1). Тем не менее такой результат не опровергает возможность взаимодействия C3f с Zn2+. Пептид может изначально находиться в благоприятной для связывания Zn²⁺ конформации, либо индуцируемые конформационные изменения могут затрагивать только N-концевой участок, не содержащий элементов упорядоченной вторичной структуры, и не отражаться в спектре КД.

В данной работе мы подтвердили бактерицидное действие C3f в отношении L. monocytogenes и M. luteus с хорошим соответствием данным, полученным ранее другим методом [20]. Кроме того, мы впервые показали антимикробную активность C3f против St. aureus и Ps. aeruginosa (рис. 3, а). Стоит отметить, что ранее была описана активность C3f только в отношении грамположительных бактерий, но в настоящей работе именно грамотрицательная Ps. aeruginosa проявила наибольшую чувствительность.

Мы уточнили характер антимикробного действия C3f в отношении L. monocytogenes, приблизив условия к реализующимся в очаге воспаления. Добавление 0,15 М NaCl полностью ингибировало бактерицидный эффект пептида (рис. 4, б), что указывает на важность электростатических взаимодействий с компонентами бактериальной оболочки в реализации действия C3f. Ингибирование антимикробной активности физиологическими значениями ионной силы характерно для многих умеренно катионных АМП, например, некоторых α-дефенсинов [52]. Значимость электростатических взаимодействий также согласуется с уровнем антимикробной активности исходного пептида C3f в сравнении с его аналогами. Антимикробная активность более катионного C3f[H/K] была значительно более выраженной, чем исходного C3f и C3f[H/S] (рис. 4, б, д и е).

В присутствии 20%-ного молярного избытка Zn²⁺ активность C3f возрастала. В то же время добавление ионов Cu²⁺, уровень которых повышается при воспалении, не влияло на активность пептида, что показывает специфичность эффекта по отношению к природе двухвалентного катиона металла (рис. 4, б и г). Важно отметить, что повышенная активность C3f наблюдалась при концентрациях ионов цинка, не превышающих его уровень в плазме крови человека, который составляет ~20 мкМ [24]. В соответствии с предложенным ранее механизмом для связывающих цинк АМП [39] можно предположить, что возрастание антимикробной активности C3f в присутствии Zn²⁺ вызвано образованием комплекса пептида с ионами, что повышает суммарный заряд пептида и аффинность к бактериальной мембране. Поскольку увеличение концентрации ионов цинка не приводило к дальнейшему возрастанию активности C3f (рис. 4, в), комплекс пептида с Zn²⁺, вероятно, формируется в стехиометрическом соотношении 1/1 подобно тому, как это было показано для гистатинов и клаванинов [37, 38]. Также эти данные свидетельствуют об относительно высокой аффинности предполагаемого взаимодействия C3f и Zn²⁺. Для оценки роли остатков гистидина во взаимодействии пептида с ионами цинка исследовали также антимикробную активность синтетических аналогов C3f. Ионы цинка усиливали антимикробную активность не только исходного пептида, но и его аналогов с замещенными остатками гистидина (рис. 4, д и е). Это позволяет предположить основной вклад в связывание Zn²⁺ не столько гистидинов, сколько других остатков C3f, в первую очередь глутаминовой кислоты, боковая группа которой участвует в координации ионов цинка у многих белков [53], или α-карбоксильной группы C-концевого аргинина. Усиливающее действие Zn²⁺ на активность C3f[H/K] оказалось менее выраженным, чем на активность исходного пептида и C3f[H/S], однако это может быть связано с более высокой собственной активностью C3f[H/K].

Несмотря на показанную нами ранее устойчивость E. coli к антимикробному действию C3f [20], токсичность ионов цинка для некоторых штаммов E. coli [54, 55] дала возможность исследования совместного действия C3f и Zn²⁺ в отношении и этого вида бактерий. Действительно, E. coli ESBL 521/17 была чувствительна к Zn²⁺, но присутствие C3f повышало выживаемость бактерии (рис. 5), что может объясняться нейтрализацией антимикробных свойств Zn2+ вследствие его связывания пептидом.

Протонирование АМП при снижении pH среды способно усилить их действие (теоретические значения зарядов C3f, C3f[H/K], C3f[H/S] и HNP1 при разных значениях pH приведены в табл. П2 в Приложении). Исследуя активность C3f в отношении L. monocytogenes, против ожиданий мы выявили выраженное возрастание устойчивости бактерии при снижении pH с 8,0 до 5,0 с некоторой потерей устойчивости при pH 4,5 (рис. 6, а). Для HNP, структурно отличающихся от C3f АМП, паттерн зависимости их антимикробной активности от pH в отношении L. monocytogenes выглядел сходным образом (рис. 6, б). Ранее были опубликованы аналогичные результаты о действии АМП Css54 из яда скорпиона Centruroides suffuses, активность которого против L. monocytogenes слабо падает при снижении pH с 10 до 6 и затем несколько возрастает при pH 4 [56]. Эти данные указывают на уникальность L. monocytogenes как модельного объекта для такого рода исследований. Действительно, на протяжении жизненного цикла эта бактерия существует в широком диапазоне pH и после кислотной адаптации проявляет устойчивость к действию лантибиотика низина [57–60]. На другом объекте, M. luteus, мы наблюдали закономерное возрастание антимикробной активности C3f при снижении pH (рис. 6, в). Сходную, но менее выраженную зависимость от pH продемонстрировал и пептид C3f[H/K] (рис. 6, г). Разница между двумя пептидами может объясняться более сильным возрастанием заряда C3f по сравнению с C3f[H/K] при снижении pH с 8,0 до 6,0 (табл. П2 в Приложении), что обусловлено наличием двух остатков гистидина в молекуле C3f.

Мы изучили механизм антимикробного действия C3f и C3f[H/K] против грамположительной бактерии L. monocytogenes, а также C3f против грамотрицательной Ps. aeruginosa. Увеличение сигнала флуоресценции в экспериментах с йодидом пропидия (рис. 7) свидетельствует о нарушении структурной целостности бактериальных мембран и находится в соответствии с данными об ингибирующей роли NaCl (рис. 4, б). Поскольку для проникновения красителя в цитоплазму грамотрицательной бактерии ему необходимо последовательно преодолеть и наружную, и внутреннюю мембрану, можно заключить, что C3f нарушает барьерные свойства обеих мембран Ps. aeruginosa. В опытах по оценке структурной целостности бактериальных мембран использовали более высокие концентрации пептидов, чем в опытах по определению антимикробной активности методом подсчета колоний, что отражает различную концентрацию бактериальных клеток. При этом в экспериментах обоих типов более катионный пептид C3f[H/K] оказался более эффективным по сравнению с C3f (рис. 4, б и е; рис. 7). Таким образом, электростатические взаимодействия пептида с мембраной и последующий ее лизис лежат в основе механизма антимикробного действия C3f.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые охарактеризована пространственная структура пептида C3f, производного белка C3 системы комплемента. Наряду с неупорядоченной структурой молекула пептида включает антипараллельную β-шпильку, локализованную, по-видимому, в C-концевой области.

Ранее мы показали наличие у C3f антимикробных свойств [20]. В настоящей работе установлен мембранолитический механизм антимикробного действия C3f. В то же время можно сделать вывод о слабой физиологической значимости C3f как эндогенного АМП. Несмотря на то что ряд факторов, которые могут действовать в условиях воспаления (пониженные значения pH, присутствие ионов цинка), повышают активность пептида, физиологические значения ионной силы ее ингибируют. Если α-дефенсины, которые также инактивируются солью, вероятно, выполняют антимикробную функцию в фагосомной вакуоли нейтрофилов [26], то C3f вряд ли достигает достаточно высоких локальных концентраций в организме, чтобы преодолевать ингибирующее действие ионной силы.

Некоторые полученные данные (повышение антимикробной активности C3f в отношении L. monocytogenes в присутствии Zn²⁺, ингибирование пептидом активности Zn²⁺ в отношении E. coli) косвенно свидетельствуют о взаимодействии C3f с ионами цинка. С другой стороны, присутствие Zn²⁺ не приводило к изменению спектра КД пептида, а усиление антимикробной активности имело место не только для C3f, но и для его аналогов, лишенных гистидина. На основании полученных результатов мы предполагаем гистидин-независимое формирование комплексов C3f–Zn²⁺ в стехиометрическом соотношении 1/1, приводящее к повышению суммарного заряда и активности пептида. Необходимо проведение дальнейших исследований, например, методом ЯМР-спектроскопии, чтобы сделать однозначный вывод о возможности связывания ионов цинка пептидом C3f.

Вклад авторов. И.А. Кренев – дизайн исследования, исследование антимикробной активности, написание статьи; Е.В. Егорова – исследование антимикробной активности, написание статьи; М.М. Хайдукова – синтез и очистка пептидов; А.Д. Микушина – проведение КД-спектроскопии; Я.А. Забродская – проведение масс-спектрометрии; А.С. Комлев – методология; И.Е. Елисеев – методология, обсуждение результатов; О.В. Шамова – координация работы, обсуждение результатов; М.Н. Берлов – дизайн исследования, координация работы, обсуждение результатов, написание статьи. Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант статьи.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (государственное задание № 122020300189-6).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

About the authors

I. A. Krenev

Institute of Experimental Medicine

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg

E. V. Egorova

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg State University

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 199034, Saint Petersburg

M. M. Khaydukova

Institute of Experimental Medicine; Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 192019, Saint Petersburg

A. D. Mikushina

Institute of Experimental Medicine; Alferov University

Email: berlov.mn@iemspb.ru4
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 194021, Saint Petersburg

Ya. A. Zabrodskaya

Institute of Experimental Medicine; Smorodintsev Research Institute of Influenza; Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 197376, Saint Petersburg; 195251, Saint Petersburg

A. S. Komlev

Institute of Experimental Medicine

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg

I. E. Eliseev

Institute of Experimental Medicine; Alferov University

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 194021, Saint Petersburg

O. V. Shamova

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg State University

Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 199034, Saint Petersburg

M. N. Berlov

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: berlov.mn@iemspb.ru
Russian Federation, 197022, Saint Petersburg; 199034, Saint Petersburg

References

Supplementary files