Том 88, № 5 (2023)
Статьи
Глюкокортикоиды - регуляторы пластичности взрослого гиппокампа: точки роста и трансляционные аспекты
Аннотация
В обзоре проанализированы современные представления о контроле глюкокортикоидами различных механизмов пластичности гиппокампа взрослых млекопитающих и человека. Глюкокортикоидные гормоны обеспечивают согласованное функционирование ключевых компонентов и механизмов гиппокампальной нейропластичности: нейрогенеза, глутаматергической нейротрансмиссии, микроглии и астроцитов, систем нейротрофических факторов, нейровоспаления, протеаз, метаболических гормонов, нейростероидов. Регуляторные механизмы многообразны: наряду с прямым действием глюкокортикоидов через специфические рецепторы, описаны опосредованные глюкокортикоид-зависимые воздействия, а также многочисленные взаимодействия между различными системами и компонентами, опосредующими нейропластичность. Несмотря на то что многие связи в этой сложной регуляторной схеме до сих пор не установлены, изучение рассмотренных в работе факторов и механизмов формирует точки роста в области исследований регулируемых глюкокортикоидами процессов в мозге и в первую очередь в гиппокампе. Эти исследования принципиально важны для трансляции в клинику и потенциального лечения/предупреждения распространенных заболеваний эмоциональной и когнитивной сфер и коморбидных им состояний.
Биохимия. 2023;88(5):693-724
693-724
Рекомбинантный циклофилин А человека в комбинации с адоптивной Т-клеточной терапией усиливает эффективность противоопухолевой иммунотерапии в экспериментальных моделях in vivo;
Аннотация
Адоптивная Т-клеточная терапия (АКТ) успешно внедряется в лечение онкологических заболеваний. Основные ограничения эффективности АКТ обусловлены низкой жизнеспособностью, коротким временем персистенции и потерей функциональной активности Т-клеток после адоптивного переноса. Поиск новых иммуномодуляторов, способных улучшить выживаемость, экспансию и функции Т-лимфоцитов при адоптивном переносе с минимальным развитием побочных эффектов, позволит создать более успешные и безопасные стратегии АКТ. Особый интерес в этом отношении представляет рекомбинантный циклофилин А человека (рчЦфА), который обладает плейотропным иммуномодулирующим действием, направленным на стимуляцию врожденного и адаптивного противоопухолевого иммунитета. В настоящей работе изучали влияние рчЦфА на эффективность АКТ. В исследованиях использовали ранее разработанную экспериментальную систему адоптивной терапии лимфомы EL-4 мыши, в которой источником опухолеспецифических Т-клеток для АКТ служили лимфоциты трансгенных мышей 1D1a с врожденным пулом Т-лимфоцитов, способных распознавать антигены данной опухоли. В моделях иммунокомпетентных и иммунодефицитных трансгенных мышей было показано, что 3-дневное введение рчЦфА значительно стимулировало отторжение лимфомы EL-4 и улучшало выживаемость животных-опухоленосителей после адоптивного переноса лимфоцитов трансгенных мышей 1D1a в сниженных дозах. Наши исследования показали, что рчЦфА способен значительно повышать эффективность АКТ посредством усиления эффекторных функций опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов. Полученные результаты открывают широкие перспективы для разработки новых подходов адоптивной Т-клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований с использованием рчЦфА как альтернативы существующей цитокиновой терапии.
Биохимия. 2023;88(5):725-736
725-736
О-Ацетилгомосеринсульфгидрилаза из Clostridioides difficile: роль остатков тирозина активного центра
Аннотация
О-ацетилгомосеринсульфгидрилаза является одним из ключевых ферментов в биосинтезе метионина в Clostridioides difficile. Механизм реакции γ-замещения О-ацетил-L-гомосерина, катализируемой этим ферментом, наименее изучен среди пиридоксаль-5′-фосфат-зависимых ферментов, участвующих в метаболизме цистеина и метионина. Для выяснения роли остатков активного центра Tyr52 и Tyr107 получены четыре мутантные формы фермента с заменами на фенилаланин и аланин. Исследованы каталитические и спектральные свойства мутантных форм. Скорость реакции γ-замещения, катализируемой мутантными формами с заменой остатка Tyr52, уменьшилась более чем на три порядка по сравнению с ферментом дикого типа. Мутантные формы Tyr107Phe и Tyr107Ala практически не катализировали данную реакцию. Замены остатков Tyr52 и Tyr107 привели к уменьшению сродства апофермента к кофактору на три порядка и изменениям ионного состояния внутреннего альдимина фермента. Полученные результаты позволили сделать предположение, что остаток Tyr52 участвует в обеспечении оптимального положения каталитического кофактор-связывающего остатка лизина на стадиях отрыва С-α-протона и элиминирования боковой группы субстрата. Остаток Tyr107 может выполнять роль общего кислотного катализатора на стадии элиминирования ацетата.
Биохимия. 2023;88(5):737-747
737-747
Влияние нейродегенеративных мутаций в гене NEFL на тепловую денатурацию белка лёгкой цепи нейрофиламентов
Аннотация
Проведено исследование влияния аминокислотных замен E90K, N98S и A149V на структуру и тепловую денатурацию молекулы белка лёгкой цепи нейрофиламентов (NFL). Методом кругового дихроизма показано, что данные замены не приводят к изменению в спиральной структуре NFL, однако оказывают заметное влияние на стабильность молекулы. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии были идентифицированы калориметрические домены в структуре NFL и показано, что внесение замены E90K приводит к исчезновению низкотемпературного теплового перехода (домен 1). Внесение всех аминокислотных замен приводит к изменениям энтальпии плавления доменов NFL, а также к существенным изменениям температуры плавления некоторых калориметрических доменов. Таким образом, несмотря на то что все указанные аминокислотные замены, вызванные мутациями в гене NEFL, связаны с развитием нейропатии Шарко-Мари-Тута, а две из них даже располагаются очень близко друг к другу в суперспиральном участке 1A, они оказывают различное влияние на структуру и стабильность молекулы NFL.
Биохимия. 2023;88(5):748-760
748-760
Профили оксилипинов в крови как маркеры патогенеза онкологических заболеваний
Аннотация
Оксилипины - сигнальные липиды, производные полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), образующиеся по разным полиферментным путям метаболизма (циклооксигеназный, липоксигеназный, эпоксигеназный, анандамидный), а также неферментативно. Эти пути трансформации ПНЖК активируются параллельно, образуя смесь физиологически активных веществ. Хотя связь оксилипинов с различными опухолевыми заболеваниями известна давно, только недавно совершенствование методов инструментального анализа позволило одновременно количественно изучать оксилипины разных классов (профили). В обзоре разобраны подходы к получению профилей оксилипинов методом ВЭЖХ-МС/МС. Проведено сравнение профилей оксилипинов в образцах крови пациентов с онкологическими заболеваниями (рак груди, яичников, легкого, предстательной железы, печени и колоректальный рак). Делается заключение о потенциальной возможности использования профилей оксилипинов крови как маркеров онкозаболеваний. Понимание общих закономерностей метаболизма ПНЖК и физиологической активности смесей оксилипинов будет способствовать совершенствованию ранней диагностики и прогнозированию протекания опухолевых заболеваний.
Биохимия. 2023;88(5):761-772
761-772
Прогнозирование неблагоприятных эффектов межлекарственных взаимодействий на сердечно-сосудистую систему на основе анализа связей "структура-активность"
Аннотация
Совместное применение лекарственных средств часто приводит к межлекарственным взаимодействиям, которые могут сопровождаться различными нежелательными лекарственными реакциями (НЛР), представляющими угрозу для жизни и здоровья пациентов. Воздействие, обусловленное НЛР на сердечно-сосудистую систему, является одним из наиболее значимых проявлений межлекарственных взаимодействий (МЛВ). Клиническая оценка НЛР, возникающих в результате МЛВ между всеми использующимися в терапевтической практике парами лекарств, невозможна. Цель данной работы заключалась в построении при помощи анализа «структура-активность» (Q)SAR-моделей для прогнозирования НЛР со стороны сердечно-сосудистой системы, опосредованных взаимодействиями между парами лекарств при их совместном приёме. Данные о неблагоприятных эффектах, возникающих в результате МЛВ, были получены из базы данных DrugBank. Необходимые для построения точных (Q)SAR-моделей данные о парах лекарств, которые не вызывают соответствующие эффекты, получены из базы данных TwoSides, содержащей результаты анализа спонтанных сообщений. Для описания пары структур лекарств были использованы два типа дескрипторов: PoSMNA-дескрипторы и вероятностные оценки прогноза биологических активностей, полученные при помощи программы PASS. Связи «структура-активность» были установлены с использованием метода «Random Forest». Точность прогноза была вычислена посредством пятикратного скользящего контроля. Наибольшие значения точности были получены с использованием вероятностных оценок PASS в качестве дескрипторов. Площадь под ROC-кривой составила 0,94 - для брадикардии, 0,96 - для тахикардии, 0,90 - для аритмии, 0,90 - для удлинения QT-интервала на ЭКГ, 0,91 - для гипертонии и 0,89 - для гипотонии.
Биохимия. 2023;88(5):773-784
773-784
Нуклеоид-ассоциированные белки HU и IHF: олигомеризация в растворе и гидродинамические свойства
Аннотация
Структура и функция бактериального нуклеоида контролируются нуклеоид-ассоциированными белками NAP. В любой фазе роста различные NAP, действуя последовательно, уплотняют нуклеоид и обеспечивают его транскрипционно активную структуру. Однако в поздней стационарной фазе происходит мощная экспрессия только одного из NAP, белка Dps, и формируются ДНК-белковые кристаллы, трансформирующие нуклеоид в статическую структуру, эффективно защищённую от внешних воздействий. Обнаружение кристаллических структур в живых клетках и связь этого феномена с бактериальной резистентностью к антибиотикам вызвало огромный интерес к изучению этого явления. Целью настоящей работы является получение и сравнительное исследование структур двух родственных NAP (HU и IHF), поскольку именно они накапливаются в клетке на поздней стационарной стадии роста, предшествующей началу формирования защитного ДНК-Dps кристаллического комплекса. Для структурных исследований в работе применялись два взаимодополняющих метода: малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР) в качестве основного метода изучения структуры белков в растворе и динамическое рассеяние света - в качестве дополнительного. Для интерпретации данных МУРР использовались различные подходы и компьютерные программы (в частности, использовался анализ структурных инвариантов, метод молекулярной тектоники и анализ олигомерных смесей в терминах объёмных долей компонентов), что позволило определить макромолекулярные характеристики и получить структурные 3D-модели различных олигомерных форм белков HU и IHF с типичным для МУРР разрешением ~2 нм. Было показано, что эти белки олигомеризуются в растворе в разной степени, и для IHF характерно присутствие крупных олигомеров, состоящих из исходных димеров, выстроенных в цепочку. Анализ экспериментальных и литературных данных позволил высказать гипотезу, что именно этот белок непосредственно перед экспрессией Dps формирует наблюдавшиеся ранее in vivo тороидальные структуры и подготавливает платформу для образования кристаллов ДНК-Dps. Полученные результаты необходимы для дальнейшего исследования феномена формирования биокристаллов в бактериальных клетках и нахождения путей преодоления резистентности различных патогенов к внешнему воздействию.
Биохимия. 2023;88(5):785-802
785-802
Использование биохимических особенностей сперматозоидов, несущих X- или Y-хромосому, для их разделения на клетки одного типа
Аннотация
В обзоре собрана информация о биохимических особенностях сперматозоидов, несущих X- или Y-хромосому, которые позволяют получить фракцию спермы с определённой половой хромосомой. Практически единственная используемая на сегодняшний день технология такого разделения (сексирования) основана на сортировке сперматозоидов по содержанию ДНК методом проточной цитофлуориметрии. Помимо прикладных аспектов, эта технология дала возможность проводить анализ свойств изолированных популяций сперматозоидов, несущих X- или Y-хромосому. В последние годы появился ряд работ, доказавший существование различий между этими популяциями на уровне транскриптома и протеома. Примечательно, что эти различия связаны главным образом с энергетическим метаболизмом и структурными белками жгутика. На различиях в подвижности между сперматозоидами с разными половыми хромосомами основаны новые методы обогащения спермы клетками с X- или Y-хромосомой. Сегодня сексирование спермы является важной составной частью протокола искусственного осеменения коров с использованием криоконсервированного семени, позволяющего увеличить долю потомства нужного пола. Кроме того, успехи в разделении X- и Y-сперматозоидов могут позволить применять этот подход в медицине в тех случаях, когда необходимо избежать опасных заболеваний, сцепленных c полом.
Биохимия. 2023;88(5):803-816
803-816
Глутаредоксин 1 эволюционно древней гидры: свойства фермента и его возможные внутриклеточные функции
Аннотация
Глутаредоксин (Grx) является антиоксидантным редокс-белком, который использует глутатион в качестве донора электронов. Grx играет важную роль в различных внутриклеточных процессах, включая антиоксидантную защиту, клеточный редокс-статус, редокс-контроль процесса транскрипции, обратимое S-глутатионилирование специфических белков, апоптоз, дифференцировка клеток и др. В настоящем исследовании нами был выделен и охарактеризован дитиольный глутаредоксин из Hydra vulgaris Ind-Pune (HvGrx1). Анализ аминокислотной последовательности показал, что HvGrx1 принадлежит к семейству Grx с классическим мотивом Grx (CPYC). Филогенетический анализ и моделирование гомологии свидетельствуют о близком родстве HvGrx1 с белком Grx2 Danio rerio. Ген, кодирующий HvGrx1, был клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli; очищенный белок имел молекулярную массу 11,82 кДа. HvGrx1 эффективно восстанавливал β-гидроксиэтилдисульфид (HED) с температурным оптимум 25 °C и рН-оптимум - 8,0. Экспрессия HvGrx1 наблюдалась во всех частях тела Hydra. Экспрессия мРНК HvGrx1 и ферментативная активность HvGrx1 значительно повышались после воздействия H2O2. При экспрессии в культуре клеток человека HvGrx1 защищал клетки от окислительного стресса и усиливал пролиферацию и миграцию клеток. Несмотря на то что Hydra является простым беспозвоночным, HvGrx1 эволюционно ближе к своим гомологам из высших позвоночных (как и многие другие белки Hydra).
Биохимия. 2023;88(5):817-831
817-831
Обнаружение специфических РНК-мишеней с помощью мультимеризации
Аннотация
Обнаружение специфических РНК-мишеней с помощью методов, основанных на амплификации, широко используется в фундаментальных исследованиях и медицине ввиду высокой значимости роли, которую молекулы РНК играют при реализации генетической информации и развитии заболеваний. В данной работе описан подход к обнаружению РНК-мишеней, в основе которого лежит особый вид изотермической амплификации - реакция мультимеризации нуклеиновых кислот. Предлагаемый метод требует использования только одного фермента - ДНК-полимеразы, обладающей активностями обратной транскриптазы и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, а также цепь-вытесняющей активностью. Определены условия реакции, обеспечивающие эффективную детекцию целевых РНК. Подход был апробирован на генетическом материале коронавируса SARS-CoV-2, взятом в качестве модельной мишени. Реакция мультимеризации позволила с высокой достоверностью дифференцировать SARS-CoV-2-положительные и SARS-CoV-2-отрицательные образцы. Предлагаемый способ позволяет обнаруживать РНК даже в образцах, подвергшихся многократному замораживанию.
Биохимия. 2023;88(5):832-840
832-840
Механизм ингибирования D-циклосерином трансаминазы D-аминокислот из Haliscomenobacter hydrossis
Аннотация
D-Циклосерин ингибирует пиридоксаль-5′-фосфат (PLP)-зависимые ферменты с различной эффективностью в зависимости от организации активного центра фермента и механизма катализируемого превращения. D-Циклосерин взаимодействует с PLP-формой фермента подобно субстратам (аминокислотам) и преимущественно обратимо. Известно несколько продуктов взаимодействия PLP c D-циклосерином, при этом для некоторых ферментов образование стабильного ароматического гидроксиизоксазол-пиридоксамин-5′-фосфата при определённых значениях рН приводит к необратимому ингибированию. Цель данной работы состояла в определении механизма ингибирования D-циклосерином PLP-зависимой трансаминазы D-аминокислот из бактерии Haliscomenobacter hydrossis, которая характеризуется иной, чем у канонических трансаминаз D-аминокислот, организацией активного центра. Спектральными методами обнаружено несколько продуктов взаимодействия D-циклосерина и PLP в активном центре трансаминазы: оксим, образованный PLP и β-аминоокси-D-аланином; кетимин, образованный пиридоксамин-5′-фосфатом и D-циклосерином в циклической форме; и пиридоксамин-5′-фосфат. Образование гидроксиизоксазол-пиридоксамин-5′-фосфата не установлено. Методом рентгеноструктурного анализа получена пространственная структура комплекса трансаминазы с D-циклосерином. В активном центре трансаминазы обнаружен кетимин, образованный пиридоксамин-5′-фосфатом и циклической формой D-циклосерина. Кетимин находится в двух положениях, в которых он образует водородные связи с разными остатками активного центра. Кинетическими и спектральными методами показаны обратимость ингибирования D-циклосерином трансаминазы из H. hydrossis и восстановление активности фермента как избытком кетосубстрата, так и избытком кофактора. Полученные результаты подтверждают взаимопревращение аддуктов D-циклосерина и PLP, а также обратимость ингибирования D-циклосерином PLP-зависимых трансаминаз.
Биохимия. 2023;88(5):841-853
841-853
Адсорбция ацилгидроперокси-производных фосфолипидов биомембран липопротеидами плазмы крови
Аннотация
Установлено, что ацилгидроперокси-производные фосфолипидов окисленных митохондрий печени крысы при совместной инкубации с липопротеидами плазмы крови захватываются преимущественно частицами липопротеидов низкой плотности (ЛНП), но не липопротеидов высокой плотности (ЛВП), что опровергает ранее высказанную гипотезу об участии ЛВП в обратном транспорте окисленных фосфолипидов и подтверждает возможность различных механизмов накопления липогидропероксидов в ЛНП при окислительном стрессе.
Биохимия. 2023;88(5):854-860
854-860
Фемтосекундная экситонная релаксация в хлоросомах фотосинтезирующей зелёной бактерии Chloroflexus aurantiacus
Аннотация
В зелёных бактериях Chloroflexus (Cfx.) aurantiacus процесс фотосинтеза начинается с поглощения света хлоросомами - периферическими антеннами, состоящими из тысяч молекул бактериохлорофилла c (БХл c), объединённых в олигомерные структуры. При этом в БХл c образуются возбуждённые состояния, энергия которых мигрирует по хлоросоме по направлению к базовой пластинке и далее к реакционному центру, где происходит первичное разделение зарядов. Миграция энергии сопровождается безызлучательными электронными переходами между многочисленными экситонными состояниями, то есть экситонной релаксацией. В настоящей работе мы изучали динамику экситонной релаксации в хлоросомах Cfx. aurantiacus с помощью разностной фемтосекундной спектроскопии при криогенной температуре (80 К). Хлоросомы возбуждались световыми импульсами длительностью 20 фс на длинах волн в диапазоне от 660 до 750 нм, а разностные (свет-темнота) кинетики поглощения измерялись на длине волны 755 нм. Математический анализ полученных данных выявил кинетические компоненты с характерными временами 140, 220 и 320 фс, отвечающие за экситонную релаксацию. По мере уменьшения длины волны возбуждения количество и относительный вклад этих компонент увеличивались. Теоретическое моделирование полученных данных было проведено на основе представлений о цилиндрическом строении агрегатов БХл c. Безызлучательные переходы между группами экситонных полос описывались системой кинетических уравнений. Наиболее адекватной оказалась модель, учитывающая энергетический и структурный беспорядок хлоросом.
Биохимия. 2023;88(5):861-874
861-874
Дисплей олиго-α-1,6-гликозидазы Exiguobacterium sibiricum на поверхности клеток Escherichia coli
Аннотация
Олиго-α-1,6-гликозидазы широко применяются в биотехнологии для гидролиза крахмала. Клеточный дисплей, основанный на использовании якорных мотивов белков внешней мембраны, позволяет экспонировать целевые пептиды и белки на поверхности микробных клеток, что способствует созданию технологически и экологически оптимальной среды для получения целевого продукта. Ранее нами была получена и охарактеризована рекомбинантная олиго-α-1,6-гликозидаза психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum (EsOgl), демонстрирующая высокую каталитическую активность. Было также показано, что аутотранспортер АТ877 Psychrobacter cryohalolentis и его делеционные варианты эффективно экспонируют эстеразу EstPc и 10-й домен фибронектина III-го типа на поверхности клеток Escherichia coli. Целью работы явилось получение системы дисплея EsOgl на поверхности бактериальных клеток на основе АТ877. Сконструированы гены гибридного аутотранспортера EsOgl877 и его делеционных мутантов EsOgl877Δ239 и EsOgl877Δ310. Исследована ферментативная активность EsOgl877 и установлено, что клетки, экспрессирующие этот белок, сохраняли около 90% максимальной активности в температурном диапазоне 15-35 °C. Показано, что активность клеток, содержащих EsOgl877Δ239 и EsOgl877Δ310, была соответственно в 2,7 и 2,4 раза выше, чем клеток, экспрессирующих полноразмерный АТ. Анализ клеток, экспрессирующих укороченные варианты EsOgl877, после обработки протеиназой К показал, что пассажирский домен во всех случаях локализован на клеточной поверхности. Полученные результаты могут быть использованы для оптимизации систем дисплея олиго-α-1,6-гликозидазы и других гетерологичных белков на поверхности клеток E. coli.
Биохимия. 2023;88(5):875-883
875-883