Исследование кинетики переноса электронов между редокс-кофакторами в фотосистеме 1 методами высокочастотной ЭПР-спектроскопии

Полный текст

Принятые сокращения: РЦ – реакционный центр; ФС 1 – фотосистема 1; Хл – хлорофилл; 4Fe4S – железо-серные кластеры; А₀ – первичные акцепторы электрона, Хл; А₁ – филлохинонные вторичные акцепторы электрона; A₁-core – комплекс ФС 1, лишённый 4Fe4S-кластеров F_X, F_A, F_B; F_X-core – комплекс ФС 1, лишённый 4Fe4S-кластеров F_A, F_B; Р₇₀₀ – первичный донор электрона, специальная пара молекул Хл.

ВВЕДЕНИЕ

Кинетика переноса электрона между редокс-кофакторами в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ) исследуется в течение нескольких последних десятилетий с помощью различных методов в разных временных диапазонах, от субпикосекундных до секундных времён. Наиболее распространёнными методами исследования кинетики являются импульсная абсорбционная спектрометрия и ЭПР-спектроскопия.

Импульсная абсорбционная спектрометрия позволяет регистрировать индуцированные лазерными вспышками изменения поглощения в видимом, ближнем инфракрасном и ближнем ультрафиолетовом диапазонах. В некоторых случаях удаётся приписать наблюдаемые изменения поглощения конкретным редокс-реакциям [1].

Одним из наиболее изученных типов фотосинтетических РЦ является фотосистема 1 (ФС 1) [2–4]. Редокс-кофакторы ФС 1 включают первичный донор электрона Р₇₀₀ – димер молекул хлорофилла (Хл), первичный акцептор электрона А₀ – две пары молекул Хл в симметричных ветвях редокс-кофакторов А и В (А_0А и А_0В), молекулы филлохинонов А₁ (А_1А и А_1В), а также три последовательно расположенных железо-серных (4Fe4S) кластера F_X, F_A и F_B. Кофакторы Р₇₀₀, А₀, А₁ и F_X связаны с белковыми субъединицами ФС 1 PsaA и PsaB, составляющими центральную часть РЦ ФС 1, а терминальные 4Fe4S-кластеры, F_A и F_B, связаны с наружной субъединицей PsaC [5]. В условиях преимущественного возбуждения Хл РЦ происходит сверхбыстрое разделение зарядов между ${\mathrm{Р}}_{700}^{*}$ и А₀ с образованием состояния ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{A}}_0^{-}$ за субпикосекундные времена [6, 7]. Вслед за этим электрон переносится с ${\mathrm{A}}_0^{-}$ на A₁ с характерным временем ~25 пс [6, 8, 9]. Последующие реакции переноса электрона с A_1A и A_1B на F_X происходят с характерными временами ~200 нс и ~20 нс соответственно, вслед за этим электрон с F_X переносится на терминальные 4Fe4S-кластеры F_A и F_B (см. обзор Brettel и Leibl [3] и рис. 1, а).

 

Рис. 1. Схема переноса электронов в ФС 1 цианобактерий: редокс-потенциалы основных кофакторов ФС 1 и времена прямых реакций переноса электрона (а); структурная схема нативных (б) и лишённых 4Fe4S-кластеров комплексов A₁-core ФС 1 (в). Редокс-кофакторы показаны: димер Хл Р₇₀₀ – красным, Хл А₀ – зелёным, филлохиноны А_1А и А_1В – синим. 4Fe4S-Кластеры на рис. 1, б показаны жёлто-голубыми кубиками. PsaA, PsaB и PsaC – белковые субъединицы, содержащие кофакторы переноса электрона. Синими и красными стрелками показаны наблюдаемые в эксперименте прямые и обратные реакции переноса электрона соответственно, сине-красными стрелками показана реакция рекомбинации зарядов пары ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$${\mathbf{A}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$_A, наблюдаемая при исчезновении как сигнала ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$, так и ${\mathbf{A}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$. Пунктиром на панелях б и в показан перенос электрона, не регистрируемый в представленных ниже экспериментах

 

На рис. 1, б и в схематически изображены нативный комплекс ФС 1 и комплекс A₁-core, в котором отсутствуют субъединица PsaC и железо-серные кластеры F_X, F_A и F_B. На рисунке стрелками обозначены различные прямые и обратные реакции переноса электрона. Сплошными стрелками на рисунке обозначены реакции, регистрируемые в наших экспериментах, а пунктиром – перенос электрона, который происходит быстрее, чем время разрешения установки импульсной ЭПР-спектроскопии (см. детали в подписи к рисунку и в обсуждении результатов).

Индуцируемый лазерными вспышками перенос электрона между редокс-кофакторами исследуется в широком временном диапазоне. С помощью импульсной абсорбционной спектрометрии в основном регистрируется кинетика восстановления фотоокисленного димера Хл Р₇₀₀, отражающая реакции обратного переноса электрона на первичный донор с различных редокс-кофакторов ФС 1 (вторичных акцепторов филлохинонов А₁ и 4Fe4S-кластеров F_Х, F_A и F_B). Эти данные дают только косвенную информацию о прямом переносе электрона от восстановленного ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на 4Fe4S-кластеры через соотношение амплитуд компонент рекомбинации зарядов, конкурирующих с реакциями прямого переноса электрона.

Что касается кинетики окисления филлохинонного акцептора А₁, то её, как правило, регистрируют косвенно с помощью измерения электрохромного каротиноидного сдвига на длине волны 480 нм. В некоторых случаях удаётся сопоставить кинетику редокс-реакций Р₇₀₀/${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и кинетику каротиноидного сдвига, отражающую, главным образом, редокс-переходы филлохинона A₁−/А₁. Однако следует отметить, что этот метод является косвенным и регистрирует не только кинетику исчезновения семихинон-аниона A₁−, но и наличие заряда на димере Хл ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ [10–12]. Прямое измерение перехода ${\mathrm{А}}_1^{-}$/А₁ возможно на длине волны ~380 нм [13, 14], однако применимость этого метода ограничена из-за низкого соотношения сигнал/шум.

Альтернативным методом регистрации кинетики переноса электрона в ФС 1 является высокочастотная ЭПР-спектроскопия в Q- и W-диапазонах [15]. Преимуществом данного метода является чёткое разделение сигналов ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$ – они наблюдаются при различных значениях напряжённости магнитного поля. Его ограничением является то обстоятельство, что традиционные измерения в Q- и W-диапазонах СВЧ возможны только при криогенных температурах в водно-глицериновой смеси и в относительно узком временном диапазоне [16]. В то же время недавно было обнаружено, что измерения спектров и кинетики изменения сигналов ЭПР в W-диапазоне возможны и при комнатной температуре в комплексах бактериальных РЦ, а также в комплексах ФС 1 в высушенных стекловидных трегалозных матрицах [17, 18]. Кроме того, с помощью импульсной ЭПР-спектроскопии в СВЧ диапазонах частот Q и W можно на одном и том же образце одновременно регистрировать как восстановление ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, так и окисление ${\mathrm{А}}_1^{-}$, хотя и в ограниченном временном диапазоне. При этом кинетика восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ в выделенных РЦ ФС 1 будет отражать обратный перенос электрона от восстановленных акцепторов, а кинетика окисления ${\mathrm{А}}_1^{-}$ – как обратный перенос на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, так и прямой перенос электрона на 4Fe4S-кластеры. Кинетика исчезновения сигнала ЭПР спин-коррелированной ион-радикальной пары ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$ была ранее исследована на нативных комплексах из цианобактерии Synechococcus lividus [19, 20]. Сопоставление кинетики восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ с кинетикой окисления ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на препаратах ФС 1, содержащих различное количество 4Fe4S-кластеров, позволяет определить кинетику и оценить соотношение прямых и обратных реакций с участием филлохинонов ${\mathrm{А}}_1^{-}$.

В настоящей работе кинетики восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и окисления ${\mathrm{А}}_1^{-}$ были исследованы при температуре 100 К в водно-глицериновой смеси на препаратах нативных комплексов ФС 1, препаратах F_X-core, не содержащих субъединицы PsaC и терминальных 4Fe4S-кластеров F_A и F_B, а также препаратах А₁-core, не содержащих всех трёх железо-серных кластеров. Для сопоставления данных были также произведены измерения кинетики восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ при комнатной температуре с помощью импульсной абсорбционной спектрофотометрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение нативных комплексов ФС 1. Культуру клеток Synechocystis sp. PCC 6803 выращивали в среде BG-11 [21] при постоянном освещении белым светом. Клетки собирали в логарифмической фазе роста (примерно через 7 дней) центрифугированием и дважды промывали в 50 мМ буфере HEPES-NaOH (рН 7,5).

Тримерные комплексы ФС 1 выделяли и очищали, согласно ранее описанной методике [22], с небольшими изменениями. Тилакоидные мембраны при концентрации Хл ~0,6 мг/мл растворяли в течение 90 мин при 4 °С в присутствии н-додецил-β-D-мальтозида (ДМ) до концентрации 1% (w/v). Неразрушенные мембраны осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 14 000 g и супернатант наносили на линейный градиент сахарозы (5–20%, w/v). Градиент центрифугировали в течение 3 ч в вертикальном роторе VTi 50 (полученном в рамках Программы развития МГУ имени М.В. Ломоносова) («Beckman Coulter», США) при 200 000 g и собирали нижнюю темно-зелёную полосу, содержащую тримеры ФС 1. После диализа исходную суспензию ФС 1 в 25 мМ буфере HEPES-NaOH (pH 7,5), содержащую 0,03% (m/v) ДМ, концентрировали до концентрации Хл 3 мг/мл (30 мкМ ФС 1).

Получение комплексов F_X-core. Для получения комплексов ФС 1, лишённых терминальных железо-серных кластеров F_A/F_B (обозначаемых как комплексы F_X-core), нативные комплексы ФС 1 при концентрации Хл 220 мкг/мл инкубировали в среде, содержащей 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0) и 6,8 М мочевины в течение 90 мин при комнатной температуре в темноте. Затем суспензию многократно промывали 50 мМ Tris-HCl-буфером (рН 8,0)/0,03% ДМ вплоть до конечной концентрации мочевины ~0,03% (более 30 циклов в зависимости от исходного объёма образца). Суспензию ядерных частиц F_X концентрировали с использованием концентраторов Centricon-50 (50 кДа, «Amicon», США) до концентрации ~2,5-3,0 мг Хл/мл.

Получение комплексов P₇₀₀-А₁-core. Для получения комплексов ФС 1, лишённых всех трёх железо-серных кластеров F_X и F_A/F_B (обозначенных как комплексы A₁-core), комплексы F_X-core при концентрации Хл 220 мкг/мл инкубировали в среде, содержащей 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0)-буфер, 5 мМ феррицианида калия и 3,4 М мочевины в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Для удаления мочевины и феррицианида суспензию ФС 1 несколько раз промывали 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0)-буфером до конечных концентраций мочевины и феррицианида ~0,03% и ~0,005% соответственно. Суспензию комплексов A₁-core концентрировали с использованием концентраторов Centricon-50 до концентрации ~2,5 мг Хл/мл.

Импульсная микросекундная абсорбционная спектрофотометрия. Кинетику восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, индуцированного лазерной вспышкой, измеряли на длине волны 820 нм [1, 17]. В качестве источника возбуждения использовался лазер YG-481 («Quantel», Франция) с длиной волны 532 нм, интенсивностью 30 мДж и полушириной импульса 12 нс, в качестве источника измерительного света использовался лазерный диод DC25A (длина волны 820 нм) («Spindler and Hoyer», Германия). Временное разрешение установки составило ~100 нс [1, 17]. Препараты с концентрацией Хл 50 мкг/мл помещались в кварцевую кювету с оптическим путём 10 мм. Измерения проводили в присутствии 10 мМ аскорбата натрия в 50 мМ HEPES-буфере (рН 7,5). Кинетику сигнала снимали в логарифмической развёртке, что позволило эффективно снизить шумы во всём временном диапазоне от 1 мкс до 1 с.

Импульсная ЭПР-спектроскопия. Измерения проводились в Q-диапазоне частот (33,913–33,952 ГГц) на ЭПР-спектрометре Elexsys E580 («Bruker», Германия-США) с использованием резонатора EN 5107D2 и продувного криостата CF935 («Oxford Instruments», Великобритания). Спектрометр был модернизирован с помощью твердотельного усилителя мощности СВЧ Q-диапазона, обеспечивающего выходную мощность 150 Вт на частоте 34 ГГц. В качестве источника возбуждения использовался лазер Brilliant B («Quantel») с длиной волны 532 нм, интенсивностью 1 мДж, с частотой повторения импульсов 10 Гц и полушириной импульса 12 нс.

Лазерный импульс индуцирует разделение зарядов в РЦ ФС 1. После временной задержки τ последовательность двух СВЧ импульсов формирует сигнал первичного электронного спинового эха. Регистрируется зависимость интенсивности сигнала эха в зависимости от интервала времени τ между лазерным импульсом и первым СВЧ импульсом. Длительность СВЧ π/2-импульса составляла 16 нс, задержка между двумя СВЧ импульсами составляла 440 нс. В процессе записи кинетик изменения сигналов ЭПР длительность СВЧ импульсов и задержка между двумя СВЧ импульсами не изменялись. Измерения кинетик изменения сигналов ЭПР для ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$ проводились при различных значениях магнитных полей в Q-диапазоне, т.к. сигналы, соответствующие ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$, в спектре ЭПР имеют разные значения резонансных полей [19, 23]. Протокол эксперимента показан на рис. 2.

 

Рис. 2. Протокол эксперимента регистрации кинетики изменения сигналов ЭПР

 

Анализ кинетик сигналов ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ и ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$. Кинетика индуцируемых лазерной вспышкой сигналов ЭПР анализировалась с использованием набора скриптов для Matlab R2023a [24]. Кинетика изменения сигнала аппроксимировалась заданным числом экспонент (подробности в тексте) методом наименьших квадратов. В большинстве случаев достаточно хорошее разложение достигалось с помощью суммы одной восходящей экспоненциальной функции с характерным временем ~60 мкс и одной убывающей экспоненциальной функции с характерным временем 300–800 мкс (см. Результаты).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Регистрация кинетики восстановления ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ с помощью импульсной абсорбционной спектроскопии. Кинетика восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ отражает обратный перенос электрона от различных акцепторов РЦ ФС 1, а также возможное взаимодействие РЦ с экзогенными донорами и акцепторами электронов. При комнатной температуре эти реакции регистрируются как уменьшение поглощения на длине волны 820 нм после лазерной вспышки [25]. На рис. 3 показаны кинетики рекомбинации зарядов в трёх типах препаратов ФС 1: комплексах A₁-core, лишённых всех трёх 4Fe4S-кластеров (F_X, F_A и F_B), комплексах F_X-core, лишённых кластеров F_A и F_B, а также нативных комплексах, содержащих полный набор 4Fe4S-кластеров.

 

Рис. 3. Индуцированная лазерными вспышками рекомбинация зарядов в комплексах ФС 1, регистрируемая как уменьшение поглощения на длине волны 820 нм при комнатной температуре для комплексов A₁-core (а), комплексов F_X-core (б) и полного комплекса ФС 1 (в). Указаны характерные времена и относительные амплитуды основных компонент рекомбинации. Поглощение указано в условных единицах, нормированных на максимум сигнала

 

В кинетике рекомбинации зарядов при комнатной температуре в случае комплексов A₁-core выявляются две компоненты с характерными временами (τ) ~10 и 140 мкс (рис. 3, а), которые соответствуют обратному переносу электрона с молекул филлохинона A_1В и A_1А в симметричных ветвях кофакторов [14, 26, 27]. В приведённых экспериментальных кривых доминирует более быстрая компонента с амплитудой почти 70%. Соотношение между быстрой и медленной компонентами рекомбинации варьирует в зависимости от условий приготовления препаратов A₁-core и использованного штамма цианобактерий [13, 14] и, вероятно, отражает не только асимметрию образования ион-радикальных пар ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_A и ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_В в симметричных ветвях редокс-кофакторов А и В, но и возможное повреждение и частичное удаление молекул филлохинона из сайтов А₁, происходящее при выделении препаратов A₁-core.

В кинетике обратного переноса электрона в комплексах F_X-core, лишённых терминальных кластеров F_A и F_B, выявляются две компоненты с характерными временами ~300 мкс и 2,5 мс и относительными амплитудами 40 и 60% соответственно (рис. 3, б). Медленная компонента может быть однозначно приписана рекомбинации с кластера F_X; что же касается более быстрой компоненты, то она в принципе может соответствовать рекомбинации с A_1A во фракции комплексов с повреждённым F_X. С другой стороны, характерное время τ данной компоненты вдвое медленнее, чем кинетика рекомбинации пары ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_A, наблюдавшаяся в препаратах A₁-core (140 мкс), а ожидаемая более быстрая компонента пары ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_В (10 мкс) на этих препаратах отсутствует. Ранее было предположено, что обратный перенос электрона с F_X на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ имеет гетерогенную кинетику, обусловленную наличием различных конформационных состояний ФС 1, как минимум при криогенных температурах [1, 13]. Нами ранее было показано, что кластер F_X является наиболее подверженным конформационным изменениям из кофакторов ФС 1 [1, 25]. При комнатной температуре маловероятна конформационная гетерогенность, аналогичная «замерзанию» конформации комплекса ФС 1 при понижении температуры ниже 200 К. Однако аналогичная неоднородность образца может достигаться в результате химической обработки пигмент-белкового комплекса мочевиной при приготовлении образцов F_X-core. В этом случае обе компоненты, 300 мкс и 2,5 мс, могут быть приписаны обратному переносу электрона с F_X в различных конформациях РЦ, возможно, способствующих преимущественной локализации отрицательного заряда на различных атомах кластера F_X.

В нативных комплексах ФС 1 кинетика рекомбинации зарядов, представленная на рис. 3, в, главным образом обусловлена обратным переносом электрона от терминальных кластеров F_A и F_B (τ ≈ 90 мс, относительная амплитуда 60%). Более быстрая минорная компонента (6%) обусловлена наличием небольшой фракции белка, не содержащей субъединицы PsaC и кластеров F_A/F_B, а более медленная компонента на временах сотен миллисекунд и секунд – восстановлением Р+₇₀₀ от экзогенных доноров электрона [25].

Разложение кинетик рекомбинации зарядов на экспоненциальные компоненты в трёх типах комплексов ФС 1 представлено в табл. 1.

 

Таблица 1. Компоненты окисления ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ при комнатной температуре, измеренные спектрофотометрически на длине волны 820 нм.

Тип комплекса ФС 1	τ, мс			Относительная амплитуда, %
	τ1	τ2	τ3	А1	А2	А3	Долгоживущие компоненты
A1-core	0,011/0,14			69/28			3
FX-core	0,32	2,5		37	57		6
Нативный		3,5	86		6	60	34

Примечание. Компоненты рекомбинации соответствуют: 1 – рекомбинации с A₁ (две субкомпоненты для комплексов А₁-core), 2 – рекомбинации с кластера F_X, 3 – рекомбинации c кластеров [F_A/F_B].

 

Регистрация кинетики восстановления ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ и окисления ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$ с помощью импульсной ЭПР-спектроскопии. После фотовозбуждения в нулевой момент времени разделённая пара зарядов в РЦ ФС 1 образуется в синглетном состоянии, при котором суммарный спин электронов равен нулю. Это состояние – немагнитное, и оно не даёт сигнала ЭПР. Благодаря разнице резонансных частот разделённых зарядов и диполь-дипольному спин-спиновому взаимодействию между зарядами пара электронов переходит из синглетного состояния в триплетное; в результате наблюдается дипольная спиновая поляризация каждого электрона пары [28, 29]. Эта дипольная поляризация по амплитуде на 1–2 порядка превышает равновесную поляризацию электронных спинов и известна как гиперполяризация или химическая поляризация электронных спинов (далее по тексту – неравновесная поляризация) [30]. В результате спиновой динамики неравновесная поляризация затухает, и в спектре ЭПР мы наблюдаем равновесный сигнал, который спадает с характерными временами жизни возбуждённых электронных состояний (рекомбинации зарядов). На рис. 4, а (а также рис. П1 и П2 в Приложении) хорошо видно, как отличаются формы спектров ЭПР для случаев формирования неравновесной поляризации и достижения равновесного состояния в РЦ. В начальный момент времени с задержкой 1 мкс после лазерного импульса наблюдается спектр ЭПР, обусловленный формированием неравновесной поляризации (рис. 4, а, пунктирная линия), в котором видны сигналы в форме испускания и поглощения СВЧ образцами. С увеличением времени задержки данный сигнал преобразуется в сигнал поглощения (рис. 4, а, сплошная линия), который обусловлен достижением равновесного состояния. На рис. 4, б приведены равновесные спектры трёх типов комплексов ФС 1 на временной задержке 280 мкс; вертикальными стрелками отмечены значения напряжённости магнитного поля в спектрах ЭПР, при которых производились измерения кинетики. Для лучшего разделения кинетик рекомбинаций электронных состояний и затухания неравновесной поляризации удобно выбирать именно эти значения магнитных полей [19, 23]. На кинетических кривых, представленных ниже на рис. 5–7, на временах < 200 мкс можно наблюдать переход сигнала из формы испускания в форму поглощения, который во всех случаях хорошо аппроксимируется экспонентой с характерным временем ~60 мкс. На более длительных временах наблюдается спад сигнала ЭПР, обусловленный кинетикой исчезновения ${\mathrm{А}}_1^{-}$ или ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$. Для примера на рис. П3 в Приложении показано, как выглядят кинетики при значении напряжения магнитного поля, при котором не наблюдается изменения формы линии в спектре ЭПР, т.е. сигнал положителен уже при начальных задержках.

 

Рис. 4. Эхо-детектированные спектры ЭПР трёх комплексов ФС 1 при 100 К в Q-диапазоне СВЧ. а – Спектры нативной ФС 1 при двух различных временных задержках; б – спектры нативного комплекса ФС 1, F_X-core- и A₁-core-комплексов, записанные при временной задержке 0,28 мс. Стрелками показаны точки спектра, в которых снимались кинетики. А, Е – поглощение и испускание СВЧ образцом соответственно

 

На рис. 5–7 представлены кинетики спада индуцированных лазерными вспышками сигналов ЭПР, соответствующих радикалам ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$, измеренные на комплексах ФС 1, лишённых всех 4Fe4S-кластеров (А₁-core, рис. 5), только терминальных кластеров [F_A/F_B] (F_X-core, рис. 6) или же нативных комплексов (рис. 7).

 

Рис. 5. Кинетика ЭПР-сигналов ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$ и ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ в комплексах A₁-core ФС 1 при 100 К. Исходная кинетика показана чёрными сплошными линиями, компоненты фиттинга показаны тонкими красными пунктирными линиями, сумма компонентов фиттинга показана чёрной пунктирной линией. Амплитуда сигнала указана в условных единицах, нормированных на максимум компонент сигнала

 

Рис. 6. Кинетика ЭПР-сигналов ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$ и ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ в комплексах F_X-core ФС 1 при 100 К. Обозначения такие же, как на рис. 5

 

Рис. 7. Кинетика ЭПР-сигналов ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$ и ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$ в комплексах нативной ФС 1 при 100 К. Обозначения такие же, как на рис. 5

 

Можно предполагать, что в комплексах А₁-core характерные времена жизни ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$ должны совпадать (τ_Р = τ_A1), поскольку в системе возможна только одна реакция рекомбинации зарядов (с филлохинонов ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$). Наличие какого-то альтернативного пути переноса электрона с ${\mathrm{А}}_1^{-}$ должно уменьшить характерное время жизни радикала ${\mathrm{А}}_1^{-}$, но не ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$. Такая ситуация ожидается для F_X-core и нативных комплексов ФС 1, так как в этих системах появляется возможность прямого переноса электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на 4Fe4S-кластеры. Кроме того, в F_X-core и нативных комплексах ФС 1 должна происходить более медленная рекомбинация зарядов между 4Fe4S-кластерами и ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, поэтому для этих систем ожидается, что τ_A1 < τ_Р.

Приведённые ниже экспериментальные результаты качественно хорошо согласуются с этими ожидаемыми результатами: в ряду «A₁-core → → F_X-core → нативные комплексы» кинетика окисления ${\mathrm{А}}_1^{-}$ ускорялась, в то время как кинетика восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, наоборот, замедлялась, что указывает на различные схемы электронного переноса в исследуемых вариантах ФС 1.

На рис. 5 представлены изменения сигналов ЭПР в комплексах A₁-core, в которых конечным акцептором электрона являются молекулы филлохинона А_1A и А_1В. Кинетика окисления ${\mathrm{А}}_1^{-}$ (вверху) и кинетика восстановления Р+₇₀₀ (внизу) имеют близкие характерные времена τ ≈ 500 мкс. Это совпадение демонстрирует, что кинетики спада обоих сигналов ЭПР обусловлены одной и той же реакцией рекомбинации зарядов в ион-радикальной паре ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$.

Как показано на рис. 3, рекомбинация зарядов с филлохинонов ${\mathrm{А}}_1^{-}$_В и ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А при комнатной температуре характеризуется значениями τ ≈ 10 и 140 мкс соответственно. Согласно ранее полученным данным [27], скорость реакции обратного переноса электрона с ${\mathrm{А}}_1^{-}$_В практически не зависит от температуры и маскируется в кинетике изменения сигнала ЭПР вышеописанным затуханием неравновесной поляризации. Таким образом, наблюдаемая кинетика сигнала ЭПР с τ ≈ 490 мкс может быть однозначно приписана рекомбинации с филлохинона ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А. Замедление кинетики при понижении температуры от 140 к 490 мкс хорошо соответствует ранее наблюдаемой температурной зависимости этой реакции, зарегистрированной спектрофотометрически по сигналу восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ на препаратах ФС 1 из цианобактерий Synechococcus sp. PCC 7002 [27] и Synechocystis sp. PCC 6803 [1], лишённых всех или части 4Fe4S-кластеров соответственно.

На рис. 6 представлена кинетика исчезновения сигналов ЭПР ${\mathrm{А}}_1^{-}$ и ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ на препаратах ФС 1 F_X-core, которые содержат только 4Fe4S-кластер F_X и не содержат терминальных кластеров F_A и F_B и белковой субъединицы PsaC. Характерное время спада сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$ (τ = 350 мкс) здесь существенно быстрее, чем время спада сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ (τ = 720 мкс); очевидно, что в отличие от препаратов A₁-core, наблюдаемые кинетики не могут быть приписаны одной и той же реакции. Вместе с тем реакция восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ должна отражать как минимум кинетику рекомбинации с филлохинонов A₁, то есть кинетика ЭПР сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ должна включать в себя субкомпоненту, сходную со спадом сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$. Исходя из данных импульсной абсорбционной спектрометрии (рис. 3, табл. 1 и работа Milanovsky et al. [1]), в сигнале Р+₇₀₀ комплексов F_X-core можно ожидать наличия как минимум двух компонент рекомбинации – с кофакторов ${\mathrm{А}}_1^{-}$ и ${\mathrm{F}}_{\mathrm{X}}^{-}$. Низкое соотношение сигнал/шум не позволяет провести однозначного разложения кинетики сигналов ЭПР на две экспоненциальные составляющие. Однако, если предположить, что оба сигнала (${\mathrm{А}}_1^{-}$ и ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$) включают экспоненциальную компоненту с характерным временем 400–500 мкс (соответствующую времени обратного переноса электрона с ${\mathrm{А}}_1^{-}$_A и наблюдавшуюся в комплексах A₁-core), то кинетика сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$ также будет включать более быструю компоненту с τ₀ < 200 мкс (на пределе временного разрешения метода), а кинетика сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ – более медленную компоненту с τ₂ = 910 мкс (см. табл. 2). При таком разложении кинетика обоих сигналов может быть интерпретирована как сочетание трёх различных реакций:

 

Таблица 2. Компоненты кинетики изменения сигналов ЭПР ${\mathbf{А}}_{\mathbf{1}}^{\mathbf{-}}$ и ${\mathbf{Р}}_{\mathbf{700}}^{\mathbf{+}}$

Сигнал ЭПР	Тип комплекса	τ, мс			Относительная амплитуда А, %
		τ0	τ1	τ2	А0	А1	А2	Долгоживущие компоненты
P700	A1-core		0,51			89		11
	FX-core			0,72			94	6
			0,42	0,91		45	50	6
	нативный			1,1			75	25
			0,48	5,07		66	20	14
A1	A1-core		0,49			105		–5
	FX-core		0,35			102		–2
		0,19	0,42		51	50		–1
	нативный		0,28			93		7
		0,16	0,48		86	11		3

Примечание. Жирным шрифтом отмечены разложения на одну экспоненциальную функцию, курсивом – разложения на две экспоненты при допущении наличия компоненты с τ₁ ≈ 400–500 мкс. Предположительные соответствия компонент: 0 – прямой перенос электрона от A_1A к F_X, 1 – рекомбинация с A₁, 2 – обратный перенос электрона от 4Fe4S-кластеров.

 

• в случае сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$ более быстрая компонента (τ₀ < 200 мкс) может быть приписана сильно замедленному при низкой температуре прямому переносу электрона с ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А на F_X, а более медленная (τ₁ = 420 мкс) – рекомбинации зарядов в ион-радикальной паре ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_А (см. схему переноса зарядов на рис. 1). Ранее было показано [13], что прямой перенос с ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А на F_X, происходящий при комнатной температуре за время ~200 нс, при температуре 170 К может замедляться до десятков микросекунд;
• в кинетике сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ более быстрая компонента (с той же τ₁ = 420 мкс) соответствует обратному переносу электрона с ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А, а более медленная (τ₂ = 910 мкс) – с F_X–.

В нативных комплексах ФС 1 кинетика сигнала ЭПР ${\mathrm{А}}_1^{-}$ аппроксимируется экспонентой с τ = 280 мкс и долгоживущей компонентой (τ > 10 мс) (рис. 7). Отношение сигнал/шум в экспериментальных данных не позволяет с уверенностью выделить две ожидаемые экспоненты, как это наблюдалось в спектрофотометрических измерениях при комнатной температуре. Если, по аналогии с вышеописанной процедурой, произвести разложение кинетики на две экспоненты, одна из которых имеет τ₁ ≈ 400–600 мкс, то в сигнале ${\mathrm{А}}_1^{-}$ можно выделить более быструю субкомпоненту со временем τ₀ < 200 мкс. Мы предполагаем, что так же, как и в препаратах F_X-core, наблюдаемый спад сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$ является комбинацией двух процессов – сильно замедленного прямого переноса электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на F_X (и, возможно, далее на F_A и F_B) с τ₀ < 200 мкс и обратного переноса электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ с τ₁ = 480 мкс.

Кинетика сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ хорошо описывается двумя компонентами с временами τ₁ = 480 мкс и τ₂ = 5 мс, а также долгоживущей компонентой (τ > 10 мс). Аналогично ситуации с комплексами F_X-core мы предполагаем, что более быстрая компонента обусловлена рекомбинацией зарядов в ион-радикальной паре ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$_А, а более медленные – обратным переносом электрона от железо-серных кластеров на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$.

Разложения кинетик ЭПР сигналов радикалов ${\mathrm{А}}_1^{-}$ и ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ в трёх типах комплексов ФС 1 суммированы в табл. 2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из экспериментальных данных, суммированных в табл. 2, можно сделать несколько выводов.

1) На препаратах A₁-core кинетики спада ЭПР-сигналов ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$ имеют одинаковые характерные времена τ₁ ≈ 500 мкс. Это время близко к одной из компонент кинетики восстановления Р+₇₀₀, приписываемой рекомбинации с филлохинона А_1А и измеренной спектрофотометрически при 100 К на аналогичных препаратах ФС 1, лишённых 4Fe4S-кластеров [27]. Более быстрая компонента рекомбинации с А_1В (τ ≈ 25 мкс), наблюдаемая в кинетике абсорбционных изменений, в сигнале ЭПР маскируется релаксацией неравновесной поляризации системы. Можно заключить, что в этих препаратах происходит только образование ион-радикальной пары ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$${\mathrm{А}}_1^{-}$ и обратный перенос электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$.

2) На препаратах F_X-core в ЭПР-сигнале ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ кинетика хорошо аппроксимируется одной экспонентой с τ = 720 мкс, а в сигнале ${\mathrm{А}}_1^{-}$ – с τ = 350 мкс. В отличие от данных, полученных на препаратах A₁-core, эти сигналы не могут отражать одну и ту же реакцию переноса электрона. В то же время, если обе представленные кинетики описать как сумму двух экспоненциальных функций, то одна из них будет иметь τ₁ = 420 мкс, что близко к наблюдаемой кинетике переноса электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$, наблюдаемой на препарате А₁-core. Вторая компонента в случае сигнала Р+₇₀₀ имеет τ₂ = 910 мкс, а в случае ${\mathrm{А}}_1^{-}$ – τ₀ < 200 мкс. Кинетика с τ₂ = 910 мкс, вероятно, соответствует рекомбинации с 4Fe4S-кластера F_X, а компонента с τ₀ < 200 мкс может быть связана с замедлившимся при низкой температуре прямым переносом электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$_А к F_X [13]. В кинетике восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ по данным абсорбционной спектрометрии на таких же препаратах при 100 К наблюдалась быстрая компонента с τ = 410 мкс и медленная гетерогенная компонента со средним значением τ = 104 мс [1]; таким образом, миллисекундная компонента восстановления ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ в сигнале ЭПР была на два порядка быстрее, чем в экспериментах по импульсной спектрофотометрии. Вероятно, это связано с тем, что в импульсной ЭПР-спектроскопии частота лазерных вспышек (10 Гц) существенно больше, чем в абсорбционной спектрометрии (< 0,1 Гц). В результате во фракции ФС 1, в которой рекомбинация происходит со временами τ > 1 мс, накапливаются восстановленные 4Fe4S-кластеры, с которых не происходит обратного переноса электрона. Таким образом, в наблюдаемой кинетике сигнала ЭПР наблюдается только рекомбинация с кластера F_X в конформации, обеспечивающей максимально возможную скорость этой реакции (τ₂ = 910 мкс).

3) В нативных комплексах ФС 1, так же как и в комплексах F_X-core, кинетика сигнала ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ существенно медленнее кинетики сигнала ${\mathrm{А}}_1^{-}$. Аналогично вышеописанной процедуре для F_X-core, сигнал ЭПР ${\mathrm{А}}_1^{-}$ может быть представлен как сумма замедленной реакции прямого переноса электрона с τ₀ < 200 мкс (определение амплитуды которой затруднено из-за релаксации неравновесной поляризации системы) и обратного переноса с А_1А с τ₁ = 480 мкс. В сигнале ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ можно выделить компоненту рекомбинации с А_1А с такой же кинетикой τ₁ = 480 мкс и более медленные компоненты рекомбинации с 4Fe4S-кластеров. Общая амплитуда последних (τ₂ = 5 мс и неразрешаемые по времени долгоживущие субкомпоненты) составляет 34%, что хорошо согласуется со вкладом рекомбинации с 4Fe4S-кластеров при 100 К по данным импульсной абсорбционной спектроскопии [1]. Так же, как и в F_X-core-комплексах, медленная компонента восстановления Р+₇₀₀ существенно быстрее в сигнале ЭПР, чем в кинетике абсорбционных изменений на длине волны 820 нм; вероятная причина этого изложена выше.

Сопоставление кинетики изменения сигналов ЭПР ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ и ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на трёх препаратах комплексов ФС 1, содержащих различное число 4Fe4S-кластеров, впервые позволяет разделить прямые и обратные реакции переноса электрона с участием филлохинона ${\mathrm{А}}_1^{-}$ и оценить соотношение этих реакций при криогенных температурах. Одновременное измерение ЭПР-сигналов двух редокс-кофакторов демонстрирует кинетику обратного переноса электрона от ${\mathrm{А}}_1^{-}$ на ${\mathrm{Р}}_{700}^{+}$ в нативных комплексах ФС 1. В отличие от косвенных измерений по каротиноидному сдвигу, измерение сигнала ЭПР ${\mathrm{А}}_1^{-}$ позволяет прямо регистрировать кинетику редокс-превращений ${\mathrm{А}}_1^{-}$, в том числе в нативных комплексах ФС 1. В настоящей работе данный метод позволял регистрировать кинетику спада сигналов ЭПР в диапазоне от ~200 мкс до 10 мс, ограниченном релаксацией неравновесной поляризации системы на быстрых временах, а также уменьшением соотношения сигнал/шум и деградацией образца – на медленных.

Временное разрешение метода можно улучшить при повышении температуры, что позволяет существенно ускорить релаксацию неравновесной поляризации системы. В водно-глицериновой смеси измерения при более высоких температурах затруднены, однако ранее было показано, что высушивание комплексов ФС 1 в дегидратированных трегалозных матрицах даёт возможность измерять сигнал ЭПР при температурах вплоть до комнатных [17, 18]: в таких измерениях временное разрешение составляло ~10 мкс. Доступный временной диапазон можно расширить на времена свыше 10 мс при использовании метода измерения сигнала ЭПР в W-диапазоне в ответ на единичные вспышки [18].

Вклад авторов. А.Ю. Семёнов – концепция и руководство работой; Л.А. Витухновская, М.Д. Мамедов – получение образцов; А.Н. Суханов, К.М. Салихов – получение кинетик спектров ЭПР; А.Н. Суханов, Г.Е. Милановский – анализ результатов; Г.Е. Милановский, А.Ю. Семёнов – написание текста; все авторы принимали участие в обсуждении результатов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-74-00025).

Благодарности. Авторы приносят благодарность недавно ушедшему из жизни проф. Клаусу Мёбиусу (Freie Universität Berlin, Германия) за ценное обсуждение результатов и Аиде Мамедовой (НИИ ФХБ МГУ, Москва) за помощь в выделении образцов ФС 1.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье опубликовано на сайте журнала «Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

Об авторах

А. А. Суханов

Казанский физико-технический институт им. Е.К. Завойского – обособленное структурное подразделение Казанского научного центра РАН

Email: milanovsky@belozersky.msu.ru
Россия, 420111, Казань

Г. Е. Милановский

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: milanovsky@belozersky.msu.ru
Россия, 119992, Москва

Л. А. Витухновская

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН

Email: milanovsky@belozersky.msu.ru
Россия, 119992, Москва; 119991, Москва

М. Д. Мамедов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: milanovsky@belozersky.msu.ru
Россия, 119992, Москва

К. М. Салихов

Казанский физико-технический институт им. Е.К. Завойского – обособленное структурное подразделение Казанского научного центра РАН

Email: milanovsky@belozersky.msu.ru
Россия, 420111, Казань

А. Ю. Семенов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: semenov@belozersky.msu.ru
Россия, 119992, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы