Механизм стимуляции миогенеза под действием янтарной кислоты через сукцинатный рецептор SUCNR1

Полный текст

Принятые сокращения: MYH – тяжелые цепи миозина (myosin heavy chain); MyoD – фактор миогенной детерминации (myogenic determination factor 1); MyoG – миогенин (myogenic factor); SUCNR1 – сукцинатный рецептор (succinate receptor 1).

ВВЕДЕНИЕ

Развитие скелетных мышц – это высокоорганизованный процесс, контролируемый эволюционно консервативными сетями транскрипционных факторов, сигнальными молекулами и некодирующими РНК, которые координируют экспрессию большого количества генов [1].

Семейство миогенных регуляторных транскрипционных факторов (Myf5, MyoD, Mrf4 и MyoG) является основным регулятором миогенеза. Myf5 и MyoD регулируют пролиферацию миобластов и переход на процесс миогенной дифференцировки клеток, а MRF4 и MyoG контролируют этап терминальной дифференцировки. Исследования с использованием нокаутных мышей показали, что MyoD, Mrf4 и Myf5 регулируют миогенную детерминацию, в то же время MyoG, MyoD и Mrf4 контролируют терминальную дифференцировку миобластов [2, 3].

В настоящее время ведется активный поиск других факторов и сигнальных путей, участвующих в этом процессе [4, 5].

В некоторых исследованиях было показано, что янтарная кислота может стимулировать миогенез [6]. Однако механизм данного влияния не установлен. Можно предположить, что это действие реализуется через специфический сукцинатный рецептор (SUCNR1/GPR91).

SUCNR1 принадлежит к большому семейству рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), которое делится на разные группы на основании сходства аминокислотной последовательности или типа лиганда. SUCNR1 относят к родопсин-подобному типу δ GPCR [7].

SUCNR1 обнаружен во многих тканях и органах, например, в почках, сердце, печени, мозге, сетчатке и др. При анализе экспрессии в мышцах были получены противоречивые результаты. Данный рецептор был обнаружен у мышей [8], но не был выявлен у людей [9]. Экспрессия SUCNR1 во время миогенеза не изучалась.

SUCNR1 высокоспецифичен к сукцинату, структурно родственные аналоги и метаболиты цикла Кребса не могут его активировать, только малеат и метилмалонат вызывают слабый ответ [10].

Было показано, что SUCNR1 связывается как с белком Gαi, так и с Gαq. Активация Gαi приводит к снижению уровня cAMP, а Gαq запускает сигнальный каскад фосфолипазы С-β (PLC-β) [11]. Также было высказано предположение, что наблюдаемая мобилизация [Ca2+]i при стимуляции SUCNR1 может быть связана с активацией PLC-β димером βγ [12].

Учитывая все вышеизложенное, в настоящем исследовании мы стремились изучить механизм влияния янтарной кислоты на миогенез и оценить роль SUCNR1–Gαi и SUCNR1–Gαq в данном процессе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток. Исследование выполнено in vitro на клеточной линии мышиных миобластов С2С12, предоставленной Институтом биологии гена РАН (Москва). Данная клеточная линия является классической моделью для изучения миогенной дифференцировки [13].

Клетки культивировали при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ в инкубаторе WS-189C («World Science», Корея) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/литр), с добавлением L-глутамина (4 мМ), 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Biosera», Франция), 100 ед./мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина («ПанЭко», Россия) соответственно. После достижения 70−90% конфлюэнтности клетки снимали с флакона добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА; «Sigma-Aldrich», Германия) и высевали в 6-луночные планшеты («Сorning», США).

В ходе работы были сформированы следующие экспериментальные группы:

• клетки до дифференцировки (0 день дифференцировки, контроль) – инкубация клеток с питательной средой, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки до конфлюэтности 50–60% (состояние, при котором очень немногие из клеток физически соприкасаются друг с другом);
• инициация дифференцировки миобластов – после достижения клетками конфлюэнтности 50–60% инициировали миогенную дифференцировку путем замены эмбриональной бычьей сыворотки в составе питательной среды DMEM на 2%-ную лошадиную сыворотку («Sigma-Aldrich», Германия) – дифференцировочную среду [14, 15, 16]. На 1-, 4- и 7-й день дифференцировки анализировали выраженность морфологических и биохимических изменений;
• влияние янтарной кислоты на миогенную дифференцировку миобластов – вместе с дифференцировочной питательной средой к клеткам добавляли янтарную кислоту («Acros Organics», Бельгия) в концентрациях 10, 100 и 1000 мкМ. На 1-, 4- и 7-й день анализировали выраженность изменений в клетках;
• оценка роли сукцинатных рецепторов во влиянии янтарной кислоты на миогенную дифференцировку миобластов – вместе с дифференцировочной питательной средой к клеткам добавляли янтарную кислоту в концентрациях 10, 100 и 1000 мкМ и коклюшный токсин (ингибитор сигнального пути SUCNR1–Gαi, 516560, «Sigma-Aldrich») в концентрации 100 нг/мл [17]. На 1-, 4- и 7-й день анализировали выраженность изменений в клетках;
• влияние янтарной кислоты на индекс миогенеза – янтарную кислоту в концентрации 100 мкМ вносили в питательную среду DMEM с 10%-ной эмбриональной бычьей сывороткой без замены на 2%-ную лошадиную сыворотку; срок инкубации – 7 дней.

Каждый эксперимент, каждый анализ в каждой концентрации выполняли в трех независимых повторах.

Визуализацию клеток выполняли с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX-53 («Olympus», Япония) с цифровой цветной камерой CCD 5 МПикс («DeltaPix», Дания), анализ результатов проводили с использованием программного обеспечения DeltaPix InSight.

После окончания экспериментальных воздействий клетки фиксировали 95%-ным этанолом (5 мин) и прокрашивали ядра миобластов раствором Романовского–Гимзе при комнатной температуре в течение 20–25 мин. Затем удаляли краситель, промывали клетки фосфатным буфером («ПанЭко») и микроскопировали.

Для количественной оценки процесса миогенной дифференцировки рассчитывали индекс миогенеза (IM) – долю ядер, находящихся в миотрубках, содержащих два или более ядер по отношению к общему количеству ядер. Для анализа выбирали пять полей зрения в лунке 6-луночного планшета, площадь одной лунки планшета составляла 9,6 см² (n = 3) при увеличении 200×. Общее количество проанализированных ядер составляло 90–120 на поле зрения. Расчеты проводили по формуле (1):

$IM =\frac{A-B}{C-1}\times 100$, (1)

где IМ – индекс миогенеза, А – количество ядер в многоядерных клеточных структурах, В – количество многоядерных клеточных структур, С – количество ядер в поле зрения [18, 19].

Вестерн-блот. После окончания экспериментов клетки лизировали NP40 Cell Lysis Buffer Thermo («Thermo Fisher Scientific», США) с ингибиторами протеаз («Sigma-Aldrich») в течение 30 мин при 4 °C и постоянном перемешивании из расчета 107 клеток на 100 мкл буфера.

Концентрации белка в пробах анализировали методом Бредфорда, используя Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit («Thermo Fisher») [20].

Белки (20 мкг/образец) разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, приготовленном с использованием 10% TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit («Bio-Rad», США), и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью системы полусухого переноса (Transblot; «Bio-Rad»). Затем мембраны блокировали в течение 1 ч с помощью TBS 1% Casein Blocker («Bio-Rad») с добавлением 0,1% Tween 20 («Sigma-Aldrich»). Далее, инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами в разведении 1 : 200: sc-53092, MYH1/2/3 (N3.36), мышиное моноклональное антитело («Santa Cruz Biotechnology, Inc», США); sc-53142, MyoD (G-1), мышиное моноклональное антитело («Santa Cruz Biotechnology, Inc»); sc-12732, миогенин (F5D), мышиное моноклональное антитело («Santa Cruz Biotechnology, Inc»); A08485, SUCNR1, кроличье поликлональное антитело («Boster Bio», Китай). Мембраны промывали TBST и затем инкубировали со вторичными антителами в разведении 1 : 4000 в течение 1 ч при комнатной температуре: кроличьи анти-мышиные IgG (H + L), HRP («Invitrogen», США); козьи анти-кроличьи IgG (H + L), HRP («Invitrogen»).

Содержание изучаемых белков оценивали относительно уровня белка домашнего хозяйства GAPDH (первичные мышиные моноклональные антитела: GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68 («Invitrogen»); вторичные антитела: кроличьи антитела Rabbit-anti-Mouse IgG (H + L), HRP («Invitrogen»)).

Хемилюминесценцию регистрировали с помощью ChemiDocXRS+ («Bio-Rad»). Интенсивность полученных полос анализировали денситометрически с использованием программного обеспечения ImageLab («Bio-Rad»).

Анализ концентрации сукцината в лизате клеток. Концентрации сукцината в клеточном лизате анализировали с помощью ВЭЖХ-МС/МС (жидкостной хроматограф Ultimate 3000 и тройной квадрупольный масс-спектрометр TSQ Fortis («Thermo Fisher Scientific»)). Белки осаждали добавлением к образцу метанола в соотношении 1/1.

Хроматографическое разделение проводили на колонке С18 UCT Selectra (C18 4,6 мм × 100 мм; 5 мкм; 100 Å) с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-418 18GDC46-5UM; температура разделения – 40 °С, скорость потока – 0,5 мл/мин с использованием 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы А и метанола в качестве подвижной фазы Б. Программа градиента подвижной фазы (A/Б) была следующей: 0,0 мин – 90%/10%; 0,01 мин – 70%/30%; 3,5 мин – 50%/50%; 5 мин – 10%/90%; 7,5 мин – 90%/10%. Объем вводимой пробы – 10 мкл; время анализа – 7,5 мин. В данных условиях время удерживания сукцината составило 3,76–3,82 мин.

Ионизацию молекул сукцината проводили в негативном (отрицательном) режиме электроспрея при атмосферном давлении и напряжении 2500 В. Для количественного анализа использовали оптимизированный режим мониторинга селективных реакций (SRM) со следующими параметрами: 117 m/z → 98,7 m/z, энергия столкновения – 10 В, напряжение линз – 25 В; 117 m/z → 73,11 m/z (использовался для количественного анализа), энергия столкновения – 10 В.

Анализ концентрации инозитолмонофосфата в лизате клеток. Концентрацию инозитолмонофосфата в клеточном лизате также анализировали с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Белки осаждали добавлением к образцу ацетонитрила в соотношении 1/1. Хроматографическое разделение проводили на колонке С18 UCT Selectra (C18 4,6 мм × 100 мм; 5 мкм; 100 Å) с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-418 18GDC46-5UM с использованием раствора 10 мМ формиата аммония в качестве подвижной фазы А и метанола в качестве подвижной фазы Б. Программа градиента подвижной фазы (A/Б) была следующей: 0,0 мин – 80%/20%; 2,5 мин – 30%/70%; 2,5 мин – 80%/20%. Объем вводимой пробы – 30 мкл; время анализа – 8 мин. В данных условиях время удерживания инозитолмонофосфата составило 2,2–2,23 мин.

Ионизацию молекул инозитолмонофосфата проводили в негативном (отрицательном) режиме электроспрея при атмосферном давлении и напряжении 3000 В. Для количественного анализа использовали оптимизированный режим мониторинга селективных реакций (SRM) со следующими параметрами: 259 m/z → 79 m/z (использовался для количественного анализа), энергия столкновения 20 В; 259 m/z → 97,1 m/z, энергия столкновения 20 В.

Анализ данных. Статистический анализ полученных данных проводился с использованием GraphPad Prism версия 8.1.2. Данные представлены как среднее арифметическое (М) ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость различий при сравнении более чем двух групп оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. Для сравнения двух групп использовали t-критерий Стьюдента. Значения p < 0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Миогенная дифференцировка С2С12. Недифференцированные миобласты представляли собой плоские, веретенообразные или звездчатые клетки, которые диффузно располагались по лунке и были строго мононуклеарными. Через 24 ч (1 день дифференцировки) после удаления бычьей сыворотки запускался процесс дифференцировки миобластов, происходило их удлинение и утолщение. К четвертому дню дифференцировки после замены бычьей сыворотки на лошадиную отмечалось появление мышечных трубочек, содержащих более двух ядер. Феномен прогрессивно нарастал и достигал максимального уровня к седьмому дню дифференцировки (рис. 1). Фиксировалось образование длинных многоядерных мышечных трубочек. Индекс миогенеза постепенно увеличивался и достигал максимального значения (77,2 ± 4,4%) к седьмому дню (табл. 1).

 

 

Рис. 1. Клетки С2С12 до дифференцировки и на разных стадиях дифференцировки. Фазово-контрастная микроскопия; 200×. Окрашивание ядер по Романовскому–Гимзе; L – длина миобластов; B – ширина миобластов

 

Таблица 1. Значения индекса миогенеза (М ± SD, %) клеток линии С2С12 под действием янтарной кислоты (10, 100, 1000 мкМ), коклюшного токсина (Pertussis toxin (РТ), 100 нг/мл) и их сочетанного применения на 1-, 4-, 7-й дни дифференцировки

Экспериментальная серия	Индекс миогенеза, %
	1-й день дифференцировки	4-й день дифференцировки	7-й день дифференцировки
Дифференцировочная среда	15,4 ± 5,2	44,3 ± 13,8	77,2 ± 4,4
Коклюшный токсин (РТ), 100 нг/мл	13,2 ± 4,1	16,3 ± 3,9*	23,2 ± 5,6*
Янтарная кислота, 10 мкМ	57,9 ± 4,4*	60,3 ± 5,6*	87,8 ± 4,4*
Янтарная кислота, 100 мкМ	77,5 ± 2,4*	85,4 ± 1,7*	92,6 ± 5,9*
Янтарная кислота, 1000 мкМ	81,9 ± 2,9*	74,8 ± 2,9*	89,6 ± 3,8*
Янтарная кислота, 10 мкМ + РТ	23,2 ± 2,9^	54,5 ± 7,0	40,3 ± 2,4*,^
Янтарная кислота, 100 мкМ + РТ	47,4 ± 5,3*,#	64,5 ± 5,2*,#	65,5 ± 5,2*,#
Янтарная кислота, 1000 мкМ + РТ	51,1 ± 5,0*,°	73,0 ± 5,4*	71,4 ± 8,3*

Примечание. *p ≤ 0,05 – относительно соответствующего дня дифференцировки; ^ p ≤ 0,05 – относительно группы янтарная кислота 10 мкМ; # p ≤ 0,05 – относительно группы янтарная кислота 100 мкМ; ° p ≤ 0,05 – относительно группы янтарная кислота 1000 мкМ.

 

Относительное количество MyoD увеличивалось после замены питательной среды на дифференцировочную, достигая максимального уровня на 4-й день дифференцировки, а затем постепенно снижалось к седьмому дню, но все равно превышало показатели контроля (рис. 2, а). Относительное количество белка миогенина (MyoG) – регуляторного белка миогенеза, необходимого для терминальной дифференцировки миобластов (рис. 2, б), и тяжелых цепей миозина (MYH) значительно повышалось в клетках на 7-й день дифференцировки и не менялось на 1-й и 4-й дни по сравнению со значениями до дифференцировки (рис. 2, в).

 

Рис. 2. Результаты вестерн-блот-анализа относительного количества MyoD (а), MyoG (б), MYH (в), SUCNR1 (г) в зависимости от дня дифференцировки клеток С2С12. * р < 0,05 – по сравнению с контролем (до дифференцировки); ^ р < 0,05 – по сравнению с первым днем дифференцировки; ˅ р < 0,05 – по сравнению с четвертым днем дифференцировки

 

Методом Вестерн-блот нами было доказано наличие сукцинатных рецепторов в клетках линии С2С12. При этом в ходе миогенной дифференцировки относительное количество рецепторов прогрессивно уменьшалось (1–7 дни; рис. 2, г). В исследовании Wang et al. [8] было показано, что при мышечной нагрузке в икроножных мышцах мышей увеличивается количество сукцинатных рецепторов. Полученные результаты позволяют предположить, что SUCNR1, скорее всего, важен в процессе миогенеза, при завершении миогенеза его количество снижается. С этим может быть связан и тот факт, что SUCNR1 не обнаружены у взрослых людей (возраст 55 ± 7 лет) [9].

Таким образом, в настоящем исследовании подтвержден запуск процесса миогенеза при замене питательной среды на дифференцировочную и доказано наличие SUCNR1 в клетках С2С12, что, в свою очередь, дает возможность предположить участие янтарной кислоты в данном процессе.

Влияние янтарной кислоты на миогенную дифференцировку С2С12. Добавление в дифференцировочную среду янтарной кислоты в концентрациях 10, 100 и 1000 мкМ вызывало ускорение миогенной дифференцировки С2С12. Это проявлялось в увеличении индекса миогенеза на 1-й, 4-й и 7-й дни по сравнению с показателями клеток в дифференцировочной среде без добавления сукцината (табл. 1).

На 1-й и 4-й дни дифференцировки при воздействии янтарной кислоты в концентрациях 10, 100, 1000 мкМ увеличивалось относительное количество MyoD (рис. 3, а и б), а на 7-й день возрастал уровень MyoG и MYH по сравнению со значениями на соответствующий день дифференцировки без добавления тестируемого вещества (рис. 3, в).

 

Рис. 3. Результаты вестерн-блот-анализа относительного количества MyoD и SUCNR1 на 1-й (а) и 4-й (б) дни дифференцировки; MYH, MyoG, SUCNR1 – на 7-й день дифференцировки (в) при воздействии янтарной кислоты в концентрациях 10, 100, 1000 мкМ на клетки С2С12. *р < 0,05 – по сравнению со значениями соответствующего дня дифференцировки без добавления янтарной кислоты

 

Стоит отметить, что максимальный прирост индекса миогенеза происходил на 1-й день дифференцировки, а увеличение MyoD и MyoG – на 4-й и 7-й день соответственно, то есть усиление индекса миогенеза несколько опережало активацию транскрипционных факторов.

Относительное количество сукцинатных рецепторов снижалось во все сроки эксперимента (1-й, 4-й и 7-й день) и при всех концентрациях янтарной кислоты (10–1000 мкМ) по сравнению с уровнем клеток без добавления вещества (рис. 3).

Таким образом, янтарная кислота во всех протестированных концентрациях ускоряет миогенную дифференцировку С2С12, что связано со снижением уровня SUCNR1. С другой стороны, понижение уровня рецептора может служить ответом на его стимуляцию лигандом. При активации рецепторов, связанных с G-белком, их лиганды также инициируют процессы десенсибилизации – адаптивный ответ, используемый клетками для остановки передачи сигналов G-белками, таким образом предотвращая потенциально вредные эффекты, которые могут возникнуть в результате персистенции cтимуляции [21].

Полученные результаты также согласуются с данными других авторов. Например, на мышах C57BL/6J было показано, что добавление в пищевой рацион животных 0,5% или 1% натриевой соли янтарной кислоты повышает выносливость к физическим нагрузкам, экспрессию тяжелой цепи I миозина, активность аэробных ферментов, потребление кислорода и биогенез митохондрий в скелетных мышцах [8].

Влияние янтарной кислоты на концентрацию внутриклеточного сукцината в процессе миогенной дифференцировки С2С12. При изучении концентрации сукцината в клетках С2С12 в процессе миогенной дифференцировки было показано, что его содержание постепенно снижалось, достигая минимальных значений к седьмому дню (рис. 4, а).

 

Рис. 4. Концентрация сукцината в клетках С2С12 в процессе их миогенной дифференцировки при внесении в питательную среду янтарной кислоты в концентрациях 10 (а), 100 (б) и 1000 (в) мкМ (метод детекции – ВЭЖХ-МС/МС). * р < 0,05; ** p < 0,01 – статистически значимые различия между группами

 

Сукцинат является субстратом цикла Кребса и поставщиком FADН₂ для дыхательной цепи митохондрий [22], поэтому можно было предположить, что выявленный эффект стимуляции миогенеза связан с его участием в метаболических процессах как субстрата. Однако нами было показано, что добавление янтарной кислоты в дифференцировочную среду во всех тестируемых концентрациях (10, 100 и 1000 мкМ) не только не приводило к увеличению концентрации сукцината в клетках линии С2С12 в процессе дифференцировки, но даже, наоборот, ускоряло процесс снижения. При этом достоверных различий между показателями клеток, инкубировавшихся с разными концентрациями янтарной кислоты, получено не было, что свидетельствует о том, что влияние янтарной кислоты на уровень сукцината не было дозозависимым. При этом стоит отметить, что концентрацию сукцината оценивали через 24 ч после внесения янтарной кислоты в питательную среду (рис. 4).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сукцинат, видимо, быстро метаболизируется и эффект стимуляции миогенеза реализуется не через влияние на метаболизм клеток и дыхательную цепь. Таким образом, янтарная кислота принимает участие в процессе дифференцировки миобластов не как энергетический субстрат, а как сигнальная молекула.

Влияние коклюшного токсина на миогенную дифференцировку С2С12 под действием янтарной кислоты. Предполагается, что SUCNR1 может реализовывать свои эффекты через белки Gαi, βγ и Gαq [11, 12]. Для оценки роли сигнального пути SUCNR1–Gαi в стимуляции миогенеза под действием янтарной кислоты применяли специфический ингибитор Gαi-белка – коклюшный токсин. Коклюшный токсин катализирует ADP-рибозилирование по остаткам цистеина (Cys351) на С-конце специфических α-субъединиц тримерных G-белков семейства Gi/o (Gi/Go) [23]. Показано, что коклюшный токсин может подавлять основные эффекты SUCNR1 [17].

Добавление коклюшного токсина в дифференцировочную среду приводило к практически полной остановке процессов миогенной дифференцировки. Индекс миогенеза на 4-й и 7-й дни дифференцировки был существенно ниже значений серии с применением изолированной дифференцировочной среды (табл. 1).

При добавлении коклюшного токсина к дифференцировочной среде, содержащей янтарную кислоту, на протяжении всех сроков эксперимента токсин подавлял миогенную дифференцировку, ускоренную сукцинатом, о чем свидетельствует достоверное снижение индекса миогенеза на 1-й, 4-й и 7-й дни (табл. 1).

Также на 1-й день дифференцировки применение коклюшного токсина препятствовало изменению уровня MyoD под действием янтарной кислоты, данный показатель достоверно не отличался от значений клеток, культивируемых в обычной дифференцировочной среде (без янтарной кислоты; рис. 5, а).

 

Рис. 5. Результаты вестерн-блот-анализа относительного количества MyoD и SUCNR1 на 1-й (а) и 4-й (б) дни дифференцировки; MYH, MyoG, SUCNR1 – на 7-й день дифференцировки (в) при воздействии янтарной кислоты в концентрациях 10, 100, 1000 мкМ, коклюшного токсина (Pertussis toxin (РТ), 100 нг/мл) и их сочетанного применения на клетки С2С12. * р < 0,05 – по сравнению со значениями соответствующего дня дифференцировки без добавления янтарной кислоты

 

На 4-й день дифференцировки при воздействии коклюшного токсина в сочетании с сукцинатом в концентрации 10 мкМ уровень MyoD возрастал относительно четвертого дня дифференцировки, а в остальных концентрациях достоверно не изменялся (рис. 5, б).

На 7-й день дифференцировки коклюшный токсин нивелировал все изменения, вызванные добавлением янтарной кислоты в питательную среду: относительное количество MyoG и MYH достоверно от значений клеток на 7-й день дифференцировки без добавления янтарной кислоты не отличалось (рис. 5, в).

Уровень SUCNR1 при воздействии янтарной кислоты в присутствии коклюшного токсина статистически значимо не отличался от показателей клеток без ее воздействия (дифференцировочной среды). Известно, что коклюшный токсин может предотвращать интернализацию G-белка, связанного с рецептором при воздействии лиганда [24].

Дополнительно в рамках исследования было оценено влияние коклюшного токсина на концентрацию инозитолмонофосфата в клетках С2С12 при стимуляции миогенной дифференцировки янтарной кислотой, поскольку показано, что активациях SUCNR1 сопровождается повышением его концентрации [11].

Добавление дифференцировочной питательной среды, содержащей янтарную кислоту, на 1-й день стимуляции миогенной дифференцировки приводило к постепенному нарастанию уровня инозитолмонофосфата в клетках С2С12, который достигал максимального значения к 30-й мин эксперимента.

Добавление коклюшного токсина в дифференцировочную среду вместе с янтарной кислотой препятствовало нарастанию уровня инозитолмонофосфата. Его концентрация достоверно не отличалась от показателей клеток при добавлении дифференцировочной питательной среды без внесения янтарной кислоты (рис. 6).

 

Рис. 6. Концентрация инозитолмонофосфата в клетках С2С12 в процессе их миогенной дифференцировки при внесении в питательную среду янтарной кислоты в концентрациях 10, 100 и 1000 мкМ (метод детекции – ВЭЖХ-МС/МС). * p < 0,01 – статистически значимые различия с показателями клеток до внесения сукцината, # p < 0,01 – статистически значимые различия с показателями при добавлении янтарной кислоты (100 мкМ) + коклюшный токсин (100 нг/мл)

 

В совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что янтарная кислота стимулирует миогенную дифференцировку С2С12, действуя через SUCNR1–Gαi, а не через SUCNR1–Gαq (рис. 7).

 

Рис. 7. Предполагаемый механизм действия янтарной кислоты на процесс миогенной дифференцировки клеток С2С12. АЦ – аденилатциклаза; ФЛС – фосфолипаза С; ФИФ2 – фосфатидилинозитол-1,5-дифосфат; ДАГ – диацилглицерол; ИФ3 – инозитол-3-фосфат. Механизма действия через белок Gαi обозначен полужирной стрелкой; механизм действия через белок Gγβ – тонкой стрелкой; механизм действия через Ca2+-зависимые белки – пунктирной стрелкой

 

Сделанные выводы согласуются с классическими представлениями о регуляции миогенеза. Известно, что повышенный внутриклеточный уровень cAMP может ингибировать экспрессию специфичных генов, инициирующих миогенную дифференцировку, тогда как снижение cAMP может их активировать и запускать миогенез [25], например, за счет дефосфорилирования MyoD по остатку Ser200 [26].

Выявленное в нашем исследовании опережение нарастания индекса миогенеза, по сравнению с нарастанием уровня MyoD, может быть связано именно с накоплением активной дефосфорилированной формы данного транскрипционного фактора под действием янтарной кислоты, а не с увеличением его общего количества.

Возможность стимуляции миогенной дифференцировки С2С12 янтарной кислотой без внесения дифференцировочной питательной среды. На завершающем этапе исследования нами была проверена гипотеза о возможности запуска миогенной дифференцировки клеток С2С12 при добавлении янтарной кислоты в культуральную питательную среду, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки, без замены ее на дифференцировочную (содержащую 2% лошадиной сыворотки).

В ходе исследования было установлено, что янтарная кислота самостоятельно запускала процесс миогенной дифференцировки, о чем свидетельствовали морфологические изменения клеток. Индекс миогенеза увеличивался уже с первого дня дифференцировки и достигал максимального значения к седьмому дню – 42,1 ± 3,0% (рис. 8).

 

Рис. 8. Клетки С2С12 до дифференцировки (а) и при стимуляции миогенеза добавлением 100 мкМ сукцината (б). Фазово-контрастная микроскопия; 200×. Окрашивание ядер по Романовскому–Гимзе; L – длина миобластов, B – ширина миобластов

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в настоящем исследовании на клетках миобластов С2С12 было установлено, что янтарная кислота запускает и ускоряет процесс миогенной дифференцировки, действуя через SUCNR1–Gαi.

Вклад авторов. Абаленихина Ю.В. – дизайн исследования, проведение вестерн-блот-анализа, интерпретация результатов; Исаева М.О. – культивирование и визуализация клеток; Мыльников П.Ю. – выполнение ВЭЖХ-МС/МС-анализов; Щулькин А.В. – концепция и дизайн исследования, редактирование; Якушева Е.Н. – проверка критически важного интеллектуального содержания работ.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке внутривузовского гранта молодых ученых Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова на 2023 год (Договор № 3/23).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Об авторах

Ю. В. Абаленихина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: abalenihina88@mail.ru
Россия, Рязань

М. О. Исаева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Email: abalenihina88@mail.ru
Россия, Рязань

П. Ю. Мыльников

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Email: abalenihina88@mail.ru
Россия, Рязань

А. В. Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Email: abalenihina88@mail.ru
Россия, Рязань

Е. Н. Якушева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Email: abalenihina88@mail.ru
Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы