Том 88, № 10 (2023)
Статьи
Л.А. Драчев и прямой электрометрический метод
Аннотация
В работах в области биоэнергетики важное методическое место принадлежит прямому электрометрическому методу. Принцип этого метода заключается в измерении трансмембранной разности электрических потенциалов, создаваемой между двумя отсеками ячейки белками - генераторами электрического (электрохимического) потенциала, ассоциированными с разделяющей отсеки искусственной липидной мембраной. Само существование таких белков было одним из следствий хемиосмотической концепции Питера Митчелла; обнаружение белков - генераторов электрического тока - и исследование их работы послужило одним из аргументов для признания справедливости этой концепции и способствовало в итоге присуждению Митчеллу заслуженной Нобелевской премии. Одним из главных создателей прямого электрометрического метода был Л.А. Драчев (1926-2022). С его участием были выполнены ключевые работы по электрогенезу мембранных белков фотосинтетических и дыхательных электрон-транспортных цепей: бактеориородопсина, зрительного родопсина, фотосинтетических бактериальных реакционных центров, цитохромоксидазы и др.
Биохимия. 2023;88(10):1717-1730
1717-1730
Генерация разности электрических потенциалов хроматофорами фотосинтезирующих бактерий в присутствии трегалозы в ответ на стационарное освещение
Аннотация
Измерение разности электрических потенциалов (Δψ) в мембранных везикулах (хроматофорах) из пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides, ассоциированных с поверхностью нитроцеллюлозного мембранного фильтра (МФ), пропитанного раствором фосфолипидов в декане, а также погруженных внутрь него, в присутствии экзогенных медиаторов и дисахарида трегалозы продемонстрировало увеличение амплитуды и стабилизацию сигнала при стационарном освещении. В качестве медиаторов (донора и акцептора электронов) были использованы пара аскорбат/N,N,N′N′-тетраметил-п-фенилендиамин и убихинон-0 соответственно. Хотя стабилизация фотоэлектрических ответов при длительном стационарном освещении наблюдалась в обоих случаях иммобилизации хроматофоров, только при погружении образцов внутрь МФ сохранялась функциональная активность работы реакционного центра в течение месяца при их хранении в темноте при комнатной температуре. Стабильные фотоответы, вероятно, связаны с сохранением интактности белков хроматофоров внутри пор МФ. Стабилизирующее действие биопротектора трегалозы может быть обусловлено как его влиянием на белки РЦ, так и на фосфолипидную бислойную мембрану. Полученные результаты позволят расширить современные представления об использовании полусинтетических структур на основе различных интактных фотосинтетических систем, способных преобразовывать солнечную энергию в электрохимическую форму.
Биохимия. 2023;88(10):1731-1741
1731-1741
Электронный транспорт в хлоропластах: регуляция и альтернативные пути переноса электронов
Аннотация
Работа посвящена обзору механизмов регуляции электронного транспорта в хлоропластах в контексте структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата растений. Основное внимание уделено окислению пластохинола цитохромным b6f-комплексом - лимитирующей стадии переноса электронов между фотосистемами 2 и 1. Кратко описаны процессы электронного транспорта по цепям нециклического, циклического и псевдоциклического транспорта электронов, их связь с созданием транс-тилакоидной разности электрохимических потенциалов ионов водорода в хлоропластах, обсуждаются механизмы рН-зависимой регуляции функционирования цитохромного b6f-комплекса. Рассмотрены процессы электронного переноса, связанные с участием альтернативных редокс-медиаторов - молекулярного кислорода (О2) и аскорбата.
Биохимия. 2023;88(10):1742-1760
1742-1760
Электрические сигналы плазматической мембраны и их влияние на флуоресценцию хлорофилла в хлоропластах chara in vivo
Аннотация
Потенциалы действия растительных клеток участвуют в регуляции многих клеточных процессов, включая фотосинтез и течение цитоплазмы. Возбудимые клетки харовых водорослей, находясь в средах с повышенным содержанием K+, способны генерировать гиперполяризационные электрические сигналы. Активный ответ плазмалеммы возникает при пропускании входящего электрического тока, сравнимого по величине с природными токами, циркулирующими в освещенных междоузлиях Chara. В литературе отсутствуют сведения о влиянии гиперполяризационных ответов Chara на активность фотосинтеза. В данной работе показано, что гиперполяризационный сдвиг мембранного потенциала клетки, вызывающий поток K+ в цитоплазму, сопровождается задержанным снижением выхода фактической флуоресценции хлорофилла (F′) и максимального выхода (Fm′) на фоновом свету с интенсивностью 12,5 мкмоль/м2⋅с. Переходные изменения F′ и Fm′ проявлялись только в освещенных клетках, что свидетельствует об их тесной связи с фотосинтетическим преобразованием энергии в хлоропластах. Пропускание входящего тока вызывало также возрастание pH у поверхности клетки (pHo), что служит показателем высокой H+/OH--проводимости плазмалеммы и указывает на снижение pH цитоплазмы при поступлении в клетку протонов. Сдвиги pHo проявлялись лишь в ответ на первый гиперполяризующий импульс, но исчезали при повторной стимуляции, что свидетельствует о длительной инактивации H+/OH--проводимости плазмалеммы. Подавление потоков H+ через плазмалемму не устраняло гиперполяризационные ответы и анализируемые изменения флуоресценции хлорофилла. Результаты указывают на участие потоков K+ между средой, цитоплазмой и стромой в изменениях состояния хлоропластов, выявляемых по динамике выхода флуоресценции F′ и Fm′.
Биохимия. 2023;88(10):1761-1774
1761-1774
Ионные каналы в электрической сигнализации у высших растений
Аннотация
Электрические сигналы (ЭС) растений, возникающие при действии различных внешних факторов, играют важную роль в адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Генерация ЭС в клетках высших растений связана с активацией потоков Ca2+, K+, анионов, а также изменением активности H+-ATPазы плазмалеммы. В настоящем обзоре на основе сопоставления данных молекулярно-генетических и электрофизиологических исследований выполнен анализ молекулярной природы ионных каналов, вносящих вклад в передачу ЭС у высших растений. На основе таких характеристик ионных каналов, как селективность, механизм активации, а также внутриклеточная и тканевая локализация, из широкого разнообразия ионных каналов высших растений выделены те, которые отвечают требованиям к потенциальным участникам генерации ЭС. Анализ данных экспериментальных исследований, выполненных на мутантах с подавленной или усиленной экспрессией гена определённого канала, выявил те каналы, активация которых вносит вклад в формирование ЭС. К числу каналов, ответственных за возникновение потока Ca2+ при генерации ЭС, относятся каналы семейства GLR, потока K+ - GORK, анионов - MSL. Рассмотрение перспектив дальнейших исследований говорит о необходимости объединения в рамках единого исследования электрофизиологических и генетических подходов наряду с анализом ионных концентраций в интактных растениях.
Биохимия. 2023;88(10):1775-1799
1775-1799
Изменения активности H+-ATPазы плазматической мембраны как связующее звено между формированием электрических сигналов и развитием фотосинтетических ответов у высших растений
Аннотация
Действие многочисленных неблагоприятных факторов окружающей среды на высшие растения является пространственно-неоднородным; это означает, что для развития системного адаптационного ответа необходима генерация и распространение стрессовых сигналов. Вызванные локальным действием стрессоров электрические сигналы (ЭС), которые представлены потенциалом действия, вариабельным потенциалом и системным потенциалом, играют важную роль в развитии быстрых физиологических изменений на уровне целого растения, включая фотосинтетические ответы. Развитие всех отмеченных электрических сигналов сопровождается изменениями активности H+-ATPазы, которая является основной системой электрогенного транспорта протонов на плазматической мембране. На основании литературных данных, представляется вероятным, что изменения активности H+-ATPазы и связанные с ними изменения вне- и внутриклеточного pH играют ключевую роль в формировании вызванной ЭС инактивации фотосинтетических процессов в интактных частях растений. Такая инактивация обусловлена как нарушением притока CO2 в клетки мезофилла листа, вызванным защелачиванием апопласта и, возможно, закислением цитоплазмы, так и непосредственным влиянием закисления стромы и люмена хлоропластов на процессы световой и, возможно, темновой стадии фотосинтеза. Конечным результатом вызванной ЭС фотосинтетической инактивации является повышение устойчивости фотосинтетического аппарата к действию неблагоприятных факторов и вероятности выживания растения.
Биохимия. 2023;88(10):1800-1817
1800-1817
Генерация мембранного потенциала цитохромом bd
Аннотация
В обзоре даны современные представления о механизме генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (Δψ) в ходе каталитического цикла трёхгемовой терминальной хинолоксидазы типа bd. Предполагается, что основной вклад в образование Δψ вносит перемещение Н+ поперёк мембраны по внутрибелковому гидрофильному протон-проводящему пути из цитоплазмы к кислородоредуктазному активному центру этого бактериального фермента.
Биохимия. 2023;88(10):1818-1828
1818-1828
Исследование механизма генерации мембранного потенциала гем-медными дыхательными оксидазами в режиме реального времени
Аннотация
Гем-медные дыхательные оксидазы являются высокоэффективными молекулярными машинами. Эти мембранные ферменты катализируют конечный этап клеточного дыхания эукариот и многих прокариот: перенос электронов от цитохромов или хинолов к молекулярному кислороду и восстановление O2 до воды. Высвобождаемая в этой окислительно-восстановительной реакции свободная энергия преобразуется гем-медными дыхательными оксидазами в трансмембранный градиент электрохимического потенциала ионов водорода (ΔµH+). Гем-медные дыхательные оксидазы обладают уникальным механизмом генерации ΔµH+ - редокс-сопряженной протонной помпой. Использование в исследовании гем-медных оксидаз комбинации прямого электрометрического метода измерения кинетики генерации мембранного потенциала с подходами и методами предстационарной кинетики и направленного мутагенеза позволяет получать уникальную информацию о перемещении протонов внутри белка в режиме реального времени. В обзоре суммированы результаты применения разрешенной во времени электрометрии к расшифровке механизмов работы этих важнейших биоэнергетических ферментов.
Биохимия. 2023;88(10):1829-1846
1829-1846
Сходство и различие фотохимии родопсинов I и II типов
Аннотация
Разнообразие ретиналь-содержащих белков (родопсинов) в природе чрезвычайно велико. Принципиальное сходство структуры и фотохимических свойств объединяет их в одно семейство. Однако до сих пор идет дискуссия о происхождении родопсинов: дивергентная или конвергентная эволюция? В обзоре на основе результатов собственных и литературных данных проведен сравнительный анализ сходства и различий фотопревращения родопсинов I и II типов. Представлены результаты экспериментальных исследований прямых и обратных фотореакций бактериородопсина (родопсина I типа) и зрительного родопсина (родопсина II типа) в фемто- и пикосекундном интервале времен, фотообратимой реакции родопсина осьминога (родопсина II типа), фотоэлектрических реакций родопсинов I и II типов, а также квантово-химические расчеты прямых фотореакций. Обсуждается вопрос о вероятной конвергентной эволюции родопсинов I и II типов.
Биохимия. 2023;88(10):1847-1866
1847-1866
Особенности механизма транспорта протонов в ESR, ретинальном белке Exiguobacterium sibiricum
Аннотация
Ретиналь-содержащие светочувствительные белки - родопсины - обнаружены у многих микроорганизмов. Интерес к ним во многом объясняется их ролью в запасании энергии света и фоторегуляции в микроорганизмах, а также перспективами использования в оптогенетике с целью контроля активности нейронов, в том числе для терапии различных заболеваний. Одним из представителей микробных родопсинов является ESR, ретинальный белок Exiguobacterium sibiricum. От гомологичных белков ESR отличает наличие остатка лизина (Lys96) в качестве донора протонов для основания Шиффа. Эта особенность, наряду с водородной связью акцептора протонов Asp85 с остатком His57, определяет его функциональные характеристики как протонного насоса. В обзоре рассматриваются результаты исследований ESR, проведенных с использованием различных методов, включая метод прямой электрометрии. Сравнение полученных данных с результатами определения пространственной структуры и с другими ретинальными белками позволяет сделать выводы о механизмах транспорта ионов водорода в молекуле ESR и подобных ретинальных белков.
Биохимия. 2023;88(10):1867-1879
1867-1879
Канальные родопсины: от фототаксиса к оптогенетике
Аннотация
Среди всего многообразия ретинальных белков канальные родопсины выделяются своей уникальной способностью к генерации пассивных ионных токов при фотовозбуждении. Благодаря этой способности канальные родопсины широко используются в нейрофизиологии и кардиологии как инструменты для оптогенетической манипуляции активностью возбудимых клеток. Впервые токи, генерируемые канальными родопсинами, были обнаружены в нативных клетках зеленых водорослей в 1970-е гг. В этом обзоре мы прослеживаем историю этого открытия и обсуждаем современное состояние исследований в этой области.
Биохимия. 2023;88(10):1880-1897
1880-1897
Ретиналь-содержащая анионная помпа из цианобактерии Tolypothrix campylonemoides
Аннотация
В данной работе получена функциональная характеристика родопсина TcaR из цианобактерии Tolypothrix campylonemoides. Анализ аминокислотной последовательности TcaR выявил, что этот белок обладает мотивом TSD, который отличается лишь одной аминокислотой от мотива известной хлорной помпы галородопсина TSA. Белок TcaR был экспрессирован в Escherichia coli, очищен и реконструирован в протеолипосомы и нанодиски. Функциональная активность измерялась по генерации электрического тока через плоские бислойные липидные мембраны с адсорбированными на одной поверхности мембраны протеолипосомами, а также по флуоресценции с использованием потенциал-зависимого красителя оксонола VI. Мы показали, что родопсин TcaR функционирует как мощная анионная помпа. Наши результаты показывают, что новый микробный анионный транспортер TcaR заслуживает более глубокого изучения и может быть интересен как для фундаментальных исследований мембранных белков, так и в качестве инструмента для оптогенетики.
Биохимия. 2023;88(10):1898-1907
1898-1907
Фемтосекундная динамика возбужденных состояний тетрамера хлорофилла в водорастворимом хлорофилл-связывающем белке BoWSCP
Аннотация
Методом широкополосной фемтосекундной лазерной спектроскопии «возбуждение-зондирование» измерена абсорбционная динамика хлорофилла a в симметричном тетрамерном комплексе водорастворимого хлорофилл-связывающего белка BoWSCP в диапазоне от 400 до 750 нм с временным разрешением 20 фс-200 пс. При возбуждении BoWSCP в области полосы Соре на длине волны 430 нм наблюдалась безызлучательная внутримолекулярная конверсия S3→S1 с характерным временем 83 ± 9 фс. При возбуждении комплекса в области полосы Qy на длине волны 670 нм наблюдался релаксационный переход между двумя экситонными состояниями димера хлорофилла со временем 105 ± 10 фс. Получены спектры поглощения возбужденных синглетных состояний S1 и S3 хлорофилла a. Продемонстрировано, что делокализация возбужденного состояния между экситонно-сопряженными молекулами хлорофилла в тетрамере BoWSCP изменяется во времени и зависит от энергии возбуждения. При возбуждении BoWSCP в области полосы Соре наблюдается сверхбыстрая фотохимическая реакция, обусловленная, по всей видимости, восстановлением триптофана в ближайшем окружении хлорофилла.
Биохимия. 2023;88(10):1908-1925
1908-1925
Митохондриальная сеть: электрический кабель и многое другое
Аннотация
Митохондрии в клетке могут объединяться и организовывать сложные, протяженные структуры, которые пронизывают весь объем клетки, обеспечивая равномерное снабжение энергией в виде синтезируемого в митохондриях ATP. В соответствии с хемиосмотической концепцией, энергия окисления дыхательных субстратов в значительной степени запасается в виде разности электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий. Теория функционирования протяженных митохондриальных структур как внутриклеточных электрических проводов предполагает, что митохондрии обеспечивают максимально быструю доставку электрической энергии по клеточному объему с последующим использованием этой энергии для синтеза ATP, тем самым ускоряя процесс доставки ATP по сравнению с достаточно медленной диффузией ATP в клетке. В аналитическом обзоре дана история кабельной теории, перечислены нерешенные критические проблемы, описаны перестройки митохондриальной сети и роль окислительного стресса в этом процессе. Кроме уже доказанного функционирования протяженных митохондриальных структур как электрических кабелей, предлагается и ряд дополнительных функций, в частности выдвигается гипотеза поддержания митохондриальными сетями редокс-потенциала в клеточном объеме, который может варьировать в зависимости от физиологического состояния в результате изменения трехмерной организации митохондриальной сети (фрагментация/расщепление - слияние). Рассмотрен ряд патологий, сопровождаемых нарушением редокс-статуса, и участие в них митохондрий.
Биохимия. 2023;88(10):1926-1939
1926-1939
Регулярные статьи
Роль и молекулярные механизмы альтернативного сплайсинга Th2-цитокинов IL-4 и IL-5 в аллергической бронхиальной астме
Аннотация
Бронхиальная астма (БА) - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, включающее в себя несколько фенотипов, самым распространенным из которых (до 80% от всех случаев) является аллергическая БА. Ключевыми участниками патогенеза этого заболевания являются Th2-цитокины (IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13). Гены, кодирующие эти цитокины, как и подавляющее большинство генов человека, состоят из нескольких экзонов, и, соответственно, из единого мРНК-предшественника в результате альтернативного сплайсинга может образовываться несколько вариантов зрелых мРНК и изоформ белка, которые также могут участвовать в патогенезе БА. Анализ научной литературы и баз данных показал наличие альтернативных мРНК-транскриптов для IL-4, IL-5 и IL-13. При этом у IL-4 и IL-5 альтернативные транскрипты несут открытые рамки считывания, а следовательно, могут кодировать функциональные белки. Для IL-4 показано существование не только альтернативных мРНК-транскриптов, но и альтернативной изоформы белка (IL-4δ2), которая утратила часть, кодируемую экзоном-2. Сходный по структуре альтернативный транскрипт, утративший экзон-2 (IL-5δ2) был идентифицирован для IL-5. В данном обзоре мы обобщаем сведения об известных на данный момент альтернативных мРНК-транскриптах и белковых изоформах Th2-цитокининов, прежде всего, IL-4 и IL-5. Мы проанализировали известные биологические свойства альтернативных вариантов этих цитокинов, их возможную роль в развитии аллергической БА, а также рассмотрели диагностический и терапевтический потенциал.
Биохимия. 2023;88(10):1940-1956
1940-1956
Маркеры терминальной стадии почечной недостаточности: не только СКФ
Аннотация
Хроническая болезнь почек может прогрессировать до терминальной стадии почечной недостаточности (ТСПН), характеризующейся высоким риском развития осложнений и даже смерти. ТСПН является показанием к немедленному интенсивному лечению и принятию решения о начале диализа или трансплантации почки. В связи с этим своевременная диагностика данной патологии имеет решающее значение для многих пациентов. ТСПН связана с развитием таких патологических процессов, как воспаление, фиброз, нарушение гормонального фона и сопутствующие эпигенетические изменения в различных клетках, что может служить маркерами для определения ТСПН. В обзоре рассматриваются как традиционные, так и новые перспективные биомаркеры ТСПН, которые могут быть определены в почках, крови или моче. Одни из них узкоспецифичны для конкретной патологии, другие носят более универсальный характер. На основе анализа предложено несколько универсальных воспалительных, фиброзных, гормональных и эпигенетических маркеров, свидетельствующих о существенном ухудшении функции почек и прогрессировании ТСПН, которые могут служить для улучшения диагностики ТСПН.
Биохимия. 2023;88(10):1957-1984
1957-1984
Цитохромы P450: особенности механизмов катализа и электрокатализа для создания биосенсоров и биореакторов
Аннотация
Цитохромы P450 - уникальное семейство ферментов, обнаруженное во всех царствах живых существ (у животных, бактерий, растений, грибов, архей). Основной функциональной ролью цитохромов P450 является биотрансформация экзогенных и эндогенных соединений. Данный обзор посвящен проблеме повышения эффективности электрокатализа цитохромами P450, которые обладают уникальными возможностями как для создания биосенсоров, так и для биотехнологического применения. В работе рассмотрены основные способы создания реконструированных и электрохимических каталитических систем на основе цитохромов P450, а также современные тенденции и подходы к практическому применению цитохромов P450.
Биохимия. 2023;88(10):1985-2001
1985-2001
Новая двухдоменная лакказа со средним окислительно-восстановительным потенциалом: физико-химические и структурные свойства
Аннотация
Ген ранее неисследованной двухдоменной лакказы был идентифицирован в геноме актинобактерии Streptomyces carpinensis ВКМ Ас-1300. Двухдоменная лакказа, названная ScaSL, была продуцирована в гетерологичной системе экспрессии (штамм Escherichia coli M15 [pREP4]). Фермент был очищен до гомогенного состояния с использованием аффинной хроматографии. Лакказа ScaSL, как и большинство двухдоменных лакказ, проявляла активность в форме гомотримера. Однако, в отличие от большинства двухдоменных лакказ, она была активна и в мультимерных формах. Фермент проявлял максимальную активность при 80 °C и был термостабилен. Время полуинактивации ScaSL при 80 °C составило 40 мин. Лакказа окисляла нефенольное органическое соединение 2,2′-азинобис(3-этилбензотиазолин сульфонат) (АБТС) с максимальной скоростью при pH 4,7, окисляла фенольное соединение 2,6-диметоксифенол с максимальной скоростью при pH 7,5. Стабильность лакказы наблюдалась в диапазоне pH 9-11. При pH 7,5 лакказа слабо ингибировалась азидом натрия, фторидом натрия и хлоридом натрия; при pH 4,5 лакказа полностью ингибировалась 100 мМ азидом натрия. Значения Km и kcat фермента для АБТС составили 0,1 мМ и 20 с-1, а для 2,6-диметоксифенола - 0,84 мМ и 0,36 с-1 соответственно. ScaSL катализировала полимеризацию гуминовых кислот и лигнина. Окислительно-восстановительный потенциал лакказы составил 0,472 ± 0,007 В. Таким образом, лакказа ScaSL - первая охарактеризованная двухдоменная лакказа со средним окислительно-восстановительным потенциалом. Кристаллическая структура ScaSL была определена с разрешением 2,35 Å. Сравнительный анализ структур ScaSL и других двухдоменных лакказ позволил предположить, что средний потенциал ScaSL может быть связан с конформационными различиями в положениях боковых групп аминокислот в позиции 230 (в нумерации ScaSL), относящихся ко второй координационной сфере атома меди Т1-центра.
Биохимия. 2023;88(10):2002-2013
2002-2013
Протеомный подход для исследования экспрессии, локализации и функций белкового продукта гена SOWAHD в процессе гранулоцитарной дифференцировки
Аннотация
Каталогизация белков человека, определение уровня их содержания, клеточной локализации, выполняемой функции и потенциальной медицинской значимости являются важными задачами, стоящими перед мировым протеомным сообществом. В настоящее время локализация и функции белковых продуктов для почти половины белок-кодирующих генов неизвестны или слабо изучены. Исследование протеома органелл является многообещающим подходом для выявления локализации и функций белков человека. Протеом клеточного ядра представляет особый интерес, поскольку многие белки с ядерной локализацией, например, транскрипционные факторы, выполняют регуляторные функции, определяющие судьбу клеток. По результатам метаанализа ядерного протеома, или нуклеома, клеток линии HL-60 под действием полностью-транс-ретиноевой кислоты (ATRA) выявили, что функция и локализация белкового продукта гена SOWAHD слабо изучена, кроме того, отсутствует исчерпывающая информация об экспрессии SOWAHD на уровне белка. В клетках линии HL-60 для белок-кодирующего гена SOWAHD определили экспрессию мРНК на уровне 6,4 ± 0,7 транскриптов на миллион молекул. С помощью направленной масс-спектрометрии измерили содержание белка SOWAHD (белок 58, содержащий домен анкириновых повторов) в диапазоне 0,27-1,25 фмоль/мкг общего белка. С применением пульсового мечения стабильными изотопами определили, что время полураспада для белкового продукта гена SOWAHD составляет приблизительно 19 ч. Протеомное профилирование ядерной фракции клеток линии HL-60 показало, что содержание белка SOWAHD увеличивалось в процессе ATRA-индуцированной гранулоцитарной дифференцировки, с пиком в 9 ч после добавления индуктора и с последующим снижением в более поздние временные точки. Результаты исследования впервые указывают на ядерную локализацию и вовлечённость белкового продукта гена SOWAHD в индуцированную гранулоцитарную дифференцировку.
Биохимия. 2023;88(10):2014-2031
2014-2031